Baixe Comparação de Derivatização Pré-Coluna de Aminoácidos com OPA e PITC. e outras Notas de estudo em PDF para Desvio, somente na Docsity!
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Trabalho de Conclusão de Curso
Ciências Biológicas
CARLOS EDUARDO RODRIGUES
ANÁLISE E SEPARAÇÃO DE AMINOÁCIDOS NATURAIS E
NÃO-NATURAIS POR CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA
EFICIÊNCIA (CLAE)
Orientador: Prof. Dr. Tarso Benigno Ledur Kist
Porto Alegre
Dezembro/
Análise e Separação de Aminoácidos Naturais e Não-naturais por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)
Carlos Eduardo Rodrigues
Laboratório de Métodos Biofísicos de Análise – Departamento de Biofísica – UFRGS (Universidade Federal do Rio
Grande do Sul), Porto Alegre, Brasil.
Resumo
A separação dos aminoácidos mais comumente encontrados em proteínas (L-aspartato, L-
glutamato, L-asparagina, L-serina, L-glutamina, L-histidina, glicina, L-treonina, L-arginina, L-
alanina, L-tirosina, L-valina, L-cistina, L-metionina, L-isoleucina, L-triptofano, L-lisina, L-
fenilalanina, L-leucina) e dos cinco mais citados na literatura científica (ácido γ-aminobutírico –
GABA, homocisteína, taurina, nitro-L-arginina e beta-alanina), utilizando-se derivativação pré-
coluna com ortoftaldialdeído/N-acetil-L-cisteína (OPA/NAC), foi avaliada neste estudo. A
separação dos aminoácidos mais comuns foi satisfatória, com exceção do par glicina/treonina,
enquanto que para os demais aminoácidos não foi eficaz. Cinco amostras de sucos concentrados
comerciais (laranja, uva, abacaxi, pêssego e maçã) foram avaliadas para verificar a presença de
aminoácidos livres como teste para a eficiência do método. Um bom sistema de bombas, assim
como boas colunas e um detector mediano são suficientes para análises em CLAE, que, aliados
a um sistema simples para aquisição de dados, utilizando softwares livres, surgem como
alternativa para a modernização de equipamentos fora de uso e aos caros softwares e
equipamentos modernos. A estabilidade de armazenamento dos aminoácidos por um período de
nove anos em solução de água/metanol (80/20) foi positiva, visto que o processo de análise e
derivatização não foi afetado significativamente. Como novidade, é relatada a formação de
derivativo adicional para o aminoácido glutamato. A utilização de fases móveis compostas por
baixa quantidade de solventes orgânicos empregando acetona como substituinte do
tetraidrofurano (THF) representou uma ótima relação de custo/benefício e baixo índice de
agressão ao meio ambiente.
Palavras-chave: Aminoácidos; Acetona; OPA/NAC; CLAE; Software livre
1. Introdução
Todas as proteínas, sejam das mais antigas linhagens de bactérias ou das mais
complexas formas de vida, são construídas a partir do mesmo conjunto onipresente de 20
aminoácidos, covalentemente ligados em sequências lineares características, e que, devido às
propriedades distintas das cadeias laterais, podem ser considerados o alfabeto no qual a
linguagem proteica é escrita. Em acréscimo a esses 20 aminoácidos usuais, as proteínas podem
conter resíduos criados por modificação de resíduos já incorporados a um polipeptídeo e
desempenhar importantes papéis estruturais e metabólicos nos seres vivos [1]. Além de todas
essas possibilidades, nos últimos anos, os estudos envolvendo a síntese e incorporação de
aminoácidos não-naturais emergiram como uma importante ferramenta no desenvolvimento de
novas drogas, terapias e aplicações nas mais diferentes áreas da biotecnologia [2, 3]. Estabelecer
uma metodologia confiável para identificar e quantificar esses aminoácidos é de grande
N-acetil-L-cisteína (NAC) foi adquirida da Acros Organics; padrão de aminoácidos
marca Fluka e acetona adquiridos da Sigma-Aldrich; metanol e acetonitrila graus HPLC,
ortoftaldialdeído (OPA), ácido mercaptopropiônico (MPA), ácido bórico e acetato de sódio
foram adquiridos da Merck Brasil. Sucos concentrados comerciais marca Suvalan de 200 mL.
2.2 Soluções padrão
As soluções de aminoácidos foram preparadas diluindo-se os padrões em água destilada
contendo metanol (8:2), e o pH posteriormente ajustado com NaOH 2.5 M em 9, utilizando-se
pHmetro. Foram acondicionados individualmente em tubos tipo Eppendorf de volume de 1 mL,
na concentração final de 10 mM e mantidos congelados em freezer desde março de 2003, os
seguintes aminoácidos: L-aspartato, L-glutamato, L-asparagina, L-serina, L-glutamina, L-
histidina, glicina, L-arginina, L-alanina, L-tirosina, L-metionina, L-isoleucina, L-triptofano, L-
lisina, L-fenilalanina, L-leucina, além de GABA na concentração de 1 mM e DL-homocisteína
(7.4 mM), taurina (7.8 mM), nitro-L-arginina (4.56 mM) e beta-alanina (11.22 mM). Também
foi utilizada a solução padrão de aminoácidos da marca Fluka, na concentração de 1 mM cada,
contendo: L-aspartato, L-glutamato, L-serina, L-histidina, glicina, L-treonina, L-arginina, L-
alanina, L-tirosina, L-valina, L-cistina, L-metionina, L-isoleucina, L-triptofano, L-lisina, L-
fenilalanina, L-leucina, L-prolina. OPA e NAC eram pesados em balança analítica e diluídos,
separadamente, em solução de água e etanol (1:1), variando a concentração de 3 a 15 mg mL-
(OPA) e de 9 a 45 mg mL-1^ (NAC), os quais eram utilizados por um período de até 15 dias.
2.3 Solução Tampão
Tampão borato 400 mM foi produzido pela dissolução de ácido bórico em água
destilada, com ajuste do pH em 9.4.
2.4 Derivatização
O processo de derivatização foi modificado do modelo utilizado por Moldoveanu e
David [9]. Em tubos Eppendorf, foram adicionados os reagentes na seguinte ordem: 35 μL de
OPA, 35 μL de NAC, 150 μL de tampão borato de sódio 400 mM - pH 9.4 e 35 μL de solução
padrão de aminoácidos ou amostras de suco. O tempo de reação aplicado era de, no mínimo, 7
minutos.
2.5 Preparação das amostras para derivatização
As amostras de sucos, recém abertos, foram primeiramente filtradas com papel-filtro
para remoção de partículas maiores. Posteriormente, foram submetidas à filtração com filtro de
0.45 μm e acondicionadas em tubos Eppendorf. Sem ajuste do pH, o volume de 35 μL de cada
amostra foi adicionada diretamente à solução de derivatização. Para verificar a eficiência da
derivatização, o aminoácido metionina foi adicionado como controle nos sucos de laranja e de
maçã.
2.6 Equipamentos
2.6.1 Sistema Cromatográfico
Os equipamentos utilizados consistem em sistema de bombas ternário, modelo HPLC
System 525 e termostato de coluna, modelo HPLC 582 Column Thermostat (BioTek
Instruments, Alemanha); coluna Hi-Chrom C18 (modelo HI-5C18-250A) de 25 cm de
comprimento, com diâmetro interno de 4.6 mm e partículas de 5μm (Hi-Crom, Reino Unido);
detector UV-Vis, modelo UVV monitor 40 (IMA- Institut für Molekularbiologie und Analytik,
Alemanha); módulo de aquisição de dados AutoMAC, modelo MAC 882 (ISB Indústria e
Comércio Ltda., Brasil); seringa Hamilton com volume de 50 μL (Hamilton Company, Estados
Unidos); válvula de injeção Valco Cheminert, modelo C1 (Valco Instruments Co. Inc., Estados
Unidos) com loop de 10 μL.
2.6.2 Sistema de Detecção
O comprimento de onda escolhido situa-se dentro da faixa do ultravioleta e foi de 335
nm, já que o produto da reação de derivatização com OPA/NAC apresenta os maiores valores de
absorção entre os comprimentos de 300 e 380 nm (figuras 1 e 2 - dados adquiridos por
espectrofotômetro Femto (Femto Ind. e Com. de Equipamentos).
2.6.3 Sistema de Eluição
Utilizou-se sistema de eluição composto de duas soluções (A e B) baseado no sistema
utilizado por Vasanits e colaboradores [11]: o eluente (A) composto de acetato de sódio 50 mM,
pH 7.2, contendo 1% (v/v) de acetona e eluente (B) composto de acetato de sódio 100 mM-
acetonitrila-metanol-acetona (46:43:10:1), misturados em volumes proporcionais e titulados
com ácido acético glacial e hidróxido de sódio, 1M, para pH 7.2. Os programas de gradiente
considerados ótimos estão descritos na tabela 2.
Tabela 2
Programas do gradiente de eluição para fases móveis A e B considerados ideais. Temperatura da coluna de 40ºC.
Etapa Tempo (min) Fluxo (mL) A (%) B (%)
2.6.4 Análise dos dados
AutoMAC, versão 1.0.0 para aquisição dos dados cromatográficos provenientes do
detector; CHROMuLAN, versão 0.90 (Jindrich Jindrich PIKRON Ltda, 2002) para tratamento
dos dados originados do módulo de aquisição; PAST – Paleontological Statistics software
package for education and data analisys (Hammer, O., Harper, D.A.T. and Ryan, PD, 2001)
para os cálculos estatísticos; Microsoft Office Excel (Microsoft Corporation, 2007) para
transformação dos dados e cálculos estatísticos diversos.
3. Resultados e discussão
3.1 Teoria/Cálculo
3.2 Estabilidade
3.2.1 Aminoácidos
A preparação de padrões analíticos é importantíssima no desenvolvimento de qualquer
metodologia, e com aminoácidos não é diferente. No entanto, como boa parte das análises
envolvem algum passo de modificação desses aminoácidos, mecanismos que facilitem futuras
reações são necessários (como ajuste do pH, por exemplo), o que torna sua preparação morosa e
dependente de volumes relativamente grandes, que acabam perdendo a viabilidade sem que
sejam totalmente utilizados. Além de dificultar passos para a concentração de amostras, a adição
de tampões pode facilitar o desenvolvimento de microrganismos e gerar contaminação. Os
ácidos, presentes nos padrões comerciais, podem dificultar o ajuste do pH. Nesse sentido, para
otimizar a preparação e reduzir custos, foi testada a preparação de padrões em uma solução de
água e metanol. Segundo Meyer [13], soluções aquosas com mais de 15% de solventes
orgânicos têm a sua durabilidade média em torno de três meses em temperatura ambiente. A
preparação das soluções de aminoácidos deste trabalho envolveu a solubilização em água com
20% metanol (v/v), sendo armazenadas congeladas, com uma pequena fração sendo retirada e
descongelada em geladeira, e mantidas em temperatura ambiente por 1h antes das análises. A
preparação dos padrões data de março de 2003, e o processo de derivatização ocorre como
descrito para outros tipos de preparação, com exceção do glutamato, representando sucesso na
sua conservação e nas suas propriedades originais.
3.2.2 Derivatização
Os estudos relativos à derivatização de aminoácidos com OPA e aditivos contendo
grupos SH [4,10] e a simplicidade de preparação em pequenos volumes utilizada por
Moldoveanu e David [9] foram o ponto de partida nos estudos de derivatização deste trabalho.
A relação OPA/NAC/AA (20:60:1) foi parcialmente seguida, pois, em determinadas
preparações, a concentração de aminoácidos variava. A análise de varredura do espectro durante
a derivatização revelou que a presença de NAC confere maior velocidade e maior estabilidade
que a que envolve o MPA (figura 1). Em concordância com os estudos de Molnár-Perl [4,10], 7
minutos de reação é o tempo ideal para derivatização de aminoácidos utilizando NAC como
aditivo SH, ao passo que MPA obtém a maior resposta entre 10 e 30 minutos de reação (figura
2). Não foi realizada a neutralização antes da injeção na coluna cromatográfica devido a
aceleração na trasformação de aminoácidos com mais de um derivativo e devido ao aumento de
até 16% na degradação total dos aminoácidos [4, 10]. Entre as vantagens na utilização de NAC
na derivatização com OPA, além da velocidade da reação, está no odor forte do MPA, que exige
trabalho em capela com sistema de exaustão.
3.3 Detecção
O comprimento de onda escolhido para as análises foi o UV a 335 nm como margem de
segurança pelo fato de as fases móveis utilizarem acetona, que possui “corte UV” (UV Cutoff)
por volta de 330 nm (10% em água) [13,14,15].
Fig. 1. Varredura por espectrofotômetro da reação de derivatização do padrão* de aminoácidos proteinogênicos com
OPA/NAC em função do tempo. Aminoácidos constantes no padrão: L-aspartato, L- glutamato, L-asparagina, L-
serina, L-glutamina, L-histidina, glicina, L-treonina, L-arginina, L-alanina, L-tirosina, L-valina, L-cistina, L-
metionina, L-isoleucina, L-triptofano, L-lisina, L-fenilalanina, L-leucina. *Diluído em 100 vezes.
Fig.2. Varredura por espectrofotômetro da reação de derivatização do padrão* de aminoácidos proteinogênicos com
OPA/MPA em função do tempo. Aminoácidos constantes no padrão: L-aspartato, L- glutamato, L-asparagina, L-
serina, L-glutamina, L-histidina, glicina, L-treonina, L-arginina, L-alanina, L-tirosina, L-valina, L-cistina, L-
metionina, L-isoleucina, L-triptofano, L-lisina, L-fenilalanina, L-leucina.*Diluído em 100 vezes.
0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 300 305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360 365 370 375 380 Unidade de absorbância Comprimento de onda (nm)
OPA/NAC
7 min 27 min 60 min 120 min 180 min 0 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 0, 300 305 310 315 320 325 330 335 340 345 350 355 360 365 370 375 380 Unidade de absorbância Comprimento de onda (nm)
OPA/MPA
7 min 10 min 30 min 60 min 120 min 180 min
Tabela 4
Perfil de separação dos aminoácidos mais comuns encontrados em proteínas, utilizando acetona como aditivo. Fluxo
de 1.5 mL min-¹ e temperatura da coluna de 40ºC.
AA Resolução TR (min) Largura (min)
Aspartato 2.60 0.
Glutamato 3.90 0.
Asparagina 7.73 0.
Serina 8.23 0.
Glutamina 9.01 0.
Histidina 9.62 0.
Glicina + Treonina 10.44 0.
Alanina 11.00 0.
Arginina 12.43 0.
Tirosina 14.31 1.
Cistina 15.31 0.
Valina 16.00 1.
Metionina 16.87 0.
Isoleucina 18.06 0.
Triptofano 18.42 0.
Lisina 1 18.71 0.
Fenilalanina 19.10 0.
Leucina 19.49 0.
Lisina 2 20.26 0.
3.5.2 Aminoácidos que eluem com mais de um pico
Vários estudos relatam e descrevem o comportamento de alguns aminoácidos que eluem
com mais de um pico (glicina, GABA, histidina, β-alanina, ornitina e lisina) [4,10,11]; porém
Molnár-Perl [19] faz uma bela revisão, relatando estudos com espectrometria de massas que
identificam os átomos vizinhos ao carbono ligado ao grupo amina primária como principal
responsável pela derivatização com uma molécula adicional de OPA (o hidrogênio mobilizável
do grupo CH2, próximo ao nitrogênio isoindol inicializa a reação).
Neste trabalho foi bem clara a reação da lisina com uma molécula adicional de OPA. Pouco
tempo depois dos 7 minutos de reação, ou com a temperatura ambiente mais elevada, já era
nítida a formação de um segundo pico da lisina (figura 3, cromatograma inferior). Em relação
aos outros aminoácidos que fizeram parte do estudo foi verificada a formação discreta de
derivativo adicional com GABA (figura 5), talvez pelo fato de a concentração final desse
aminoácido ter sido baixa (115,4 μM). Uma novidade (que não foi relatada na literatura
consultada) foi a formação irregular de um segundo derivativo para o glutamato (figuras 3 e 5),
o que gerou interferência na sua derivatização e nos testes de reprodutibilidade. Por se tratar de
um aminoácido com características ácidas, a formação do derivativo adicional pode ter sido
acelerada [4, 10], já que na preparação dos padrões não foi utilizado tampão, foi feito apenas o
ajuste do pH, que pode ter sido alterado pelo longo período de armazenamento. Essa observação
abre uma porta para futuras investigações sobre as condições que influenciam a formação de
derivativos adicionais também para outros aminoácidos. Com relação às amostras de suco, a
concentração de todos os aminoácidos presentes foi baixa, mas alguns aminoácidos livres ainda
permanecem em solução, o que cofere com o rótulo do produto, que apresenta quantidade zero
de proteínas. Apesar de baixa, lisina era detectável, e, mesmo com o tempo de reação
rigorosamente controlado em sete minutos, havia a formação irregular do segundo derivativo –
lisina 2 (figura 6), provavelmente devido ao pH ácido dos sucos (entre 5 e 6), o que dificultou a
sua quantificação (tabela 5).
0.041^ Asp 2.^60 Glu 3.^90 Asn 7.^73 Ser 8.^23 Gln 9.^0
His^
9.^62
Gly +^ Th r^10
.^44
Ala^1
1.^00
Arg^
12.^4
Tyr^
14.^3
Cys tina
15.^3
Val^1
6.^00
Met
16.^8
Ile^1
8.^06
Trp^
18.^4
Lys^
.^71
Phe
19.^1
Leu
19.^4
Lys^
.^26
Tempo (minutos)
Unidade de Absorbância (UA)
Fig. 3. Cromatogramas dos aminoácidos mais comuns das proteínas: 1-aspartato; 2-glutamato 1; 3-glutamato 2*; 4-asparagina; 5- serina; 6-glutamina; 7-histidina; 8-glicina+treonina; 9-alanina; 10-arginina; 11-tirosina; 12-cistina; 13-valina; 14-metionina; 15- isoleucina; 16-triptofano; 17-lisina; 18-fenilalanina; 19-leucina; 20-lisina 2. Cromatograma superior sem adição de asparagina e glutamina e injeção após 7 min de derivatização; inferior com Asn e Gln e injeção com tempo de derivatização superior a 7 min. *Glutamato 2 (inferior).
Unidade de Absorbância (UA)
0.036^ G
ln^9.
Arg^
11.^1
Nitr o-Ar g^12
Tyr^
14.^5
His^
9.^77
Gly^
+^ B-
Ala^
?^10
.^50
Ala^ + Nitr o-Ar g^12
.^62
Tau
12.^1
GAB
A^12
.^32
Hom o-C ys^1
5.^73
A
B
C
D
Tempo (minutos)
Fig. 4. Sobreposição dos cromatogramas em detalhe dos aminoácidos em que não foi satisfatória a separação: A (preto), glicina+β- alanina; B (azul), taurina; C (rosa), GABA; D (preto), alanina+nitro-arginina.
Unidade de Absorbância (UA)
Asp
2.^53
Asn
8.^33
Ser^
8.^79
Gly^ +^ Tr h^11
.^02
Tempo (minutos)
Fig. 8. Cromatograma de amostra de suco de abacaxi: 1-aspartato; 2-asparagina; 3-serina; 4-glicina+treonina.
Unidade de Absorbância (U
A)
Asp
2.^53
Asn
8.^29
Arg
12.^9
Tempo (minutos)
Fig. 9. Cromatograma de amostra de suco de pêssego: 1-aspartato; 2-asparagina; 7-arginina.
Un
ida
de
de
Ab
so
rbâ
nc
ia^
(U
A)
Asp
2.^51
Asn
8.^09
Tyr^
14.^4
Met^
17.^0
Tempo (minutos)
Fig. 10. Cromatograma de amostra de suco de maçã: 1-aspartato; 2-asparagina; 8-tirosina; 9-metionina (padrão adicionado).
Tabela 5
Identificação e quantificação de aminoácidos livres presentes em amostras de sucos. Fluxo de 1.5 mL min-¹ e
temperatura da coluna de 40ºC.
AA
Concentração de aminoácidos nos sucos (μM)
Laranja Uva Abacaxi Pêssego Maçã
Aspartato 146.83 150.68 28.92 43.21 105.
Asparagina 209.34 - 295.02 669.50 185.
Serina 135.76 30.81 54.53 - -
Glicina 93.14 37.34 35.56 - -
Alanina 728.77 42.48 - - -
GABA 195.17 15.09 - - -
Arginina 91.66 103.21 - 53.46 -
Tirosina 98.56 77.14 - - 33.
Metionina¹ 192.30 - - - 192.
Lisina 1 26.71 - - - -
Lisina 2 NQE² - - - -
¹ Padrão utilizado como referência; ² NQE (não quantificado eficientemente).
3.6 Sistema de análise
3.6.1 Características gerais
Todo o sistema de análise contou com equipamentos que não eram mais utilizados por
seus respectivos laboratórios, os quais foram doados ao nosso laboratório. Como a proposta do
nosso laboratório é desenvolver métodos de análise, avaliar e desenvolver metodologias que
possam utilizar e modificar esses equipamentos é uma questão relevante.
3.6.2 Softwares
Os softwares utilizados nesse trabalho, com exceção do Microsoft Excel, são todos
gratuitos e estão disponíveis na internet. Dentre as vantagens de se utilizar sistemas livres e
softwares abertos encontram-se o valor do programa; não exigência de treinamento sempre que
um equipamento de fabricante diferente é adquirido ou um novo software é lançado (ganho de
tempo e familiaridade do analista com a interface de análise); as atualizações são gratuitas; no
caso dos softwares de código aberto, com algum conhecimento de programação pode-se adaptar
o software a usos específicos dentro da realidade do laboratório. Na análise cromatográfica
deste trabalho foi utilizado o software CHROMuLAN [16], que é simples de usar e permite que,
através de pequenos ajustes, se obtenha os principais parâmetros cromatográficos em uma
análise, além de possibilitar que programadores modifiquem o software para que ele receba e
trate os dados diretamente da fonte de aquisição disponível (tabelas 3 e 4 e figuras 3 a 10).
Outra possibilidade é o software OpenCrhom [17], que é muito versátil e importa os dados de
diversos fabricantes dos equipamentos de CLAE mais utilizados comercialmente, além de
possibilitar uma gama muito grande de tratamento dos dados cromatográficos e também de
espectrometria de massas. Para diversos tipos de análises estatísticas, muitas de alta
complexidade, o software PAST [18] é uma boa ferramenta. Ele possui uma interface agradável,
o sistema de inclusão de dados e os cálculos são simples de serem executados, além de dispor
de vasto material explicativo sobre o programa. O Microsoft Excel, que é o único software
pago, está disponível na maioria dos computadores utilizados no mundo todo e, além de ser
Rübensam pelos conhecimentos compartilhados nos meses de convívio no laboratório de
métodos; ao professor Tarso Kist pela orientação na elaboração deste trabalho.
Referências
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Porto Alegre, 2011
[2] J. Xie, P. G. Schultz, An expanding genetic code, Methods 36 (2005) 227–238.
[3] K. Ieong, M. Y. Pavlov, M. Kwiatkowski, A. C. Forster, M. Ehrenberg, Inefficient Delivery
but Fast Peptide Bond Formation of Unnatural L‑Aminoacyl-tRNAs in Translation, J. Am.
Chem. Soc 134 (2012) 17955−17962.
[4] I. Molnár-Perl, HPLC of Amino Acids as o -Phthalaldehyde Derivatives, Journal of
Chromatography – Volume 70, Elsevier, 2005- pp 163-198.
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column derivatization, J. Chromatogr. 336 (1984) 93-104.
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[9] S. C. Moldoveanu, V. David, Sample Preparation in Chromatography, Journal of
Chromatography Library – Volume 65, Elsevier, 2002, pp. 711.
[10] I. Molnár-Perl, Derivatization and chromatographic behavior of the o-phthaldialdehyde
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phthaldialdehyde–3-mercaptopropionic acid and the o-phthaldialdehyde–N-acetyl-L-cysteine
amino acid derivatives in reversed-phase high-performance liquid chromatography, J.
Chromatogr. A 870 (2000) 271–
[12] N. M. Cassiano, J. C. Barreiro, L. R. R. Martins, R. V. Oliveira, Q. B. Cass, Validação em
Métodos Cromatográficos para Análises de Pequenas Moléculas em Matrizes Biológicas,
Química Nova 4, volume 32 (2009) 1021-1030.
[13] V. R. Meyer, Practical High-Performance Liquid Chromatography, Fourth Edition, John
Wiley & Sons, Ltd, London, 2004.
[14] P. C. Sadek, The HPLC Solvent Guide, Second Edition, John Wiley and Sons, New York,
[15] L. R. Snyder and J. J. Kirkland, Introduction to Modern Liquid Chromatography, Second
Edition, John Wiley & Sons, Inc., New Yourk, 1979.
[16] http://www.chromulan.org – acessado em de 01/06 a 29/11 de 2012
[17] http://www.openc.net - acessado em de 01/06 a 29/11 de 2012
[18] http://palaeo-eletronica.org - acessado em de 01/01 a 29/11 de 2012
[19] I. Molnár-Perl, Advancement in the derivatizations of the amino groups with the o-
phthaldehyde-thiol and with the 9-fluorenylmethyloxycarbonyl chloride reagents, J.
Chromatogr. B 879 (2011) 1241–1269.
