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(OSMOCONFORMADOR)?. Dissertação apresentada como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em. Fisiologia, do Curso de Pós-Graduação em.
Tipologia: Notas de aula
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NOS CRUSTÁCEOS BRAQUIÚROS Callinectes danae E Callinectes
ornatus (OSMORREGULADORES) E Hepatus pudibundus
(OSMOCONFORMADOR)?
NOS CRUSTÁCEOS BRAQUIÚROS Callinectes danae E Callinectes ornatus
(OSMORREGULADORES) E Hepatus pudibundus
(OSMOCONFORMADOR)?
Dissertação apresentada como requisito
parcial à obtenção do grau de Mestre em
Fisiologia, do Curso de Pós-Graduação em
Fisiologia, Setor de Ciências Biológicas da
Universidade Federal do Paraná. Orientadora: Profª. Drª Carolina Arruda de O. Freire
A minha orientadora, Profª. Dra. Carolina Arruda De Oliveira Freire, por ter me
dado uma oportunidade, pela orientação, amizade, convívio, sabedoria e paciência
nestes mais de 3 anos de LFCO.
A Profª Dra. Viviane Prodocimo pelos conselhos, convivência e colaboração.
Aos meus colegas e amigos de laboratório: Deivyson Bozza, Eloísa Pinheiro,
Felipe Brandalise de Araújo, Flávia Sampaio, Giovanna C. Castellano, Guilherme de
Almeida Torres, Gustavo Yamasaki, Isis Danniele Cury da Cruz, Juliane Ceron,
Natascha Wosnick; à Silvia Milan e Anieli Maraschi que também fizeram parte da
equipe: obrigado a todos pelo companheirismo, amizade, paciência e por estarem
sempre dispostos a ajudar, colaborar e principalmente ensinar.
Aos meus familiares pelo apoio, suporte e ajuda.
Aos meus pais por cederem sua casa, comida e auxílio durante as coletas, pelo
incentivo e por sempre estarem lá por mim.
A todos os professores do Programa de Pós-Graduação em Fisiologia por terem contribuído com a minha formação e o meu aprendizado.
Ao CNPq pela bolsa concedida durante esses dois anos de mestrado.
Quando nada pareceu dar certo, fui ver o cortador de pedras martelar a sua rocha,
talvez cem vezes sem que uma rachadura aparecesse. Mas na centésima primeira
martelada a pedra se abriu em duas. E eu sabia que não foi aquele golpe que fez
aquilo, mas todos os outros que vieram antes dele.
JACOB A. RIIS
The long time evolution of crustaceans (~ 500 million years) along with evolutionary factors, such as mutation, natural selection and gene flow among populations, allowed a huge variation of forms and the filling of ecological niches by these animals. Around 90% of the known species of crustaceans are found in the sea or salt water, such as estuaries. Whatever their habitat, osmoregulation is of vital importance for the survival of crustaceans, as it ensures the homeostasis of extracellular fluid, even in the face of variations in salinity of water. These changes in salinity responsible for the osmotic imbalance of the extracellular fluid may impact on the normal functioning of the cells, which in turn activate cellular responses, among them the possible synthesis of heat shock proteins, like Hsp70. The objective of this study was to evaluate the expression of Hsp70, follow the hemolymph osmolality and to compare the muscle hydration capacity in three species of decapods: Callinectes danae , Callinectes ornatus and Hepatus pudibundus in the presence of saline challenges. The fact that species of the genus Callinectes are osmoregulatory and H. pudibundus presenting the osmoconformation strategy can be reflected in the differentiated expression of the synthesis of Hsp70 in response to a stressor agent. For this, the animals were exposed to hyposaline (20‰) and hypersaline (45‰) shock at intervals of 6 hours, 24 hours and 72 hours for each species. After exposure, hemolymph samples were taken for posterior osmolality analysis, as well as muscle tissue samples for determination of hydration content and analysis of Hsp70 expression. Ammonia concentrations and pH in water were also analyzed at the beginning and at the end of each experiment, to determine if the concentration of ammonia at a certain pH value could be toxic to the point of destabilizing the osmoregulation process. The hypothesis that H. pudibundus would have lower constitutive expression of Hsp70 has not been proven, but the hypothesis that C. danae and C. ornatus would present higher expression of Hsp70 than H. pudibundus exposed to salt shocks proved to be true, at least With respect to C. danae and conditioned to a exposure to the stressor of at least 72 hours. C. danae and C. ornatus (weak osmoregulators) and H. pudibundus (osmoconformer) presented in this study a great ability to maintain hemolymph osmolality in the presence of salinity reduction, at least for a few hours. All three species presented behavior of osmoconformatores in exposure to increase of salinity, as expected. In relation to tissue hydration capacity, C. danae and C. ornatus were able to maintain their tissue hydration in the presence of both saline shocks, while H. pudibundus showed a significant decrease in the amount of water in the muscle tissue after 24 hours of exposure in hypersaline shock. The concentration of ammonia in the water together with the pH values can not be accepted as factors that may have impaired the response of the species to salt stress. The answer to the question that the expression of Hsp70 could reflect saline stress in C. danae, C. ornatus and H. pudibundus can only be fully answered by analyzing the expression of Hsp70 in other tissues such as gills and hepatopancreas, in addition to the use of different intervals of exposure to saline stress.
Key words: osmoregulation, crustacean, Hsp70, hypo-regulation, hyper-regulation
FIGURA 1 - Espécimes de C. danae (A), C. ornatus (B) e H. pudibundus
(C)................................................................................................................................
FIGURA 2 - Osmolalidade na hemolinfa (média + erro padrão) de C. danae , C.
ornatus e H. pudibundus diante de desafios salinos. Os caranguejos foram expostos
por 6, 24 e 72 horas a salinidade 20 ‰ ( H. pudibundus sobreviveu por apenas 6
horas) e por 6, 24 e 72 horas à salinidade 45 ‰. Para o controle foi utilizada a
salinidade de 35‰ e o tempo de 24 horas (#): Diferença comparada a situação
controle. Letras minúsculas representam diferenças entre os tempos em cada
salinidade. Letras maiúsculas representam a diferença entre as espécies em cada
tempo. n=6. A linha vermelha representa a osmolalidade da
água...........................................................................................................................
FIGURA 3 - Teor hídrico muscular (média + erro padrão) de C. danae , C. ornatus e
H. pudibundus diante de desafios salinos. Os caranguejos foram expostos por 6, 24
e 72 horas a salinidade 20 ‰ ( H. pudibundus sobreviveu por apenas 6 horas) e por
6, 24 e 72 horas à salinidade 45 ‰. Para o controle foi utilizada a salinidade de 35‰
e o tempo de 24 horas (#): Diferença comparada a situação controle. Letras
maiúsculas representam a diferença entre as espécies em cada tempo.
5>n<6.........................................................................................................................
FIGURA 4 - Expressão de Hsp70 muscular (média + erro padrão) de C. danae , C.
ornatus e H. pudibundus diante de desafios salinos. Os caranguejos foram expostos
por 6, 24 e 72 horas a salinidade 20 ‰ ( H. pudibundus sobreviveu por apenas 6
horas) e por 6, 24 e 72 horas à salinidade 45 ‰. Para o controle foi utilizada a
salinidade de 35‰ e o tempo de 24 horas (#): Diferença comparado a situação
controle. Letras minúsculas representam diferenças entre os tempos em cada
salinidade. Letras maiúsculas representam a diferença entre as espécies cada
tempo.
3>n<6.........................................................................................................................
Os primeiros registros fósseis de crustáceos datam de 500 milhões de anos
atrás, desde o Cambriano inferior até o presente momento. Esse longo tempo de
evolução, aliado à diversidade genética, plasticidade fenotípica, pressão seletiva,
radiação adaptativa, mutação e seleção natural, entre outros fatores, permitiu uma
grande variedade de formas e ocupação de diversos nichos ecológicos por parte
destes animais, sendo que em torno de 90% das espécies conhecidas são
encontradas no mar ou em águas salinas, como estuários (Schram 2001; Dixon et al
2003; Evans et al 2009). Qualquer que seja o seu habitat, a osmorregulação tem papel
fundamental na capacidade de adaptação dos crustáceos aos diversos ambientes,
pois ela permite a homeostase do líquido extracelular, mesmo diante de variações na
salinidade da água (Pequex 1995; Odum 2001; Willmer et al 2009; Romano e Zeng
2012).
Em relação a salinidade, grande parte dos invertebrados marinhos
(crustáceos, moluscos, poliquetas, e outros) podem ser classificados como
estenohalinos, que por viverem em um ambiente estável, não toleram grandes
variações de salinidades do seu meio, ou como eurihalinos, que exibem alto grau de
tolerância a uma ampla variação da salinidade na água, sendo encontrados em locais
como estuários e baías, onde há grande oscilação de salinidade em decorrência do
ciclo de marés (Willmer et al 2005; Evans et al 2009; Sherwood et al 2012).
Em matéria de regulação de fluidos, os crustáceos podem apresentar duas
estratégias distintas: osmoconformação ou osmorregulação (Pequex 1995). Tanto a
osmoconformação quanto a osmorregulação têm suas vantagens e desvantagens. Se
um animal possui a capacidade de regulação osmótica e iônica do liquido extracelular
(LEC), ele consegue manter a pressão osmótica do LEC estável apesar das
mudanças de salinidade do ambiente externo, através da manutenção de um
gradiente osmótico, evitando deste modo que a maioria das suas células sejam
expostas a oscilações osmóticas que levam a variação de volume (Moyes 2009;
Sherwood et al. 2012). Para tanto, é necessário que ocorra gasto energético neste
transporte de íons e estarem em contato direto com a água, elas podem sofrer danos,
e deste modo prejudicar o funcionamento das brânquias (Evans et al 2009).
Osmoconformadores eurihalinos podem tolerar mudanças significativas de
salinidade do ambiente externo (como estuários, por exemplo) e podem sobreviver a
diluição ou concentração do LEC através da regulação dos osmólitos orgânicos e
inorgânicos. Entre eles estão a β-alanina, taurina e prolina, que correspondem a mais
da metade da osmolalidade dos osmoconformadores nas suas células. Desta
maneira, é possível manter a concentração do líquido intracelular (LIC) em equilíbrio
com o LEC (Moyes 2009; Sherwood et al 2012). Desta forma, osmoconformadores
eurihalinos possuem grande capacidade de regulação de volume, em grande parte
devido ao aumento da capacidade de síntese de aminoácidos livres quando expostos
a alta salinidade. Em baixas salinidades, ocorre o contrário: os aminoácidos livres são
catabolizados e liberados na hemolinfa, onde sofrem desaminação e são excretados
como amônia através das brânquias. Este mecanismo é conhecido como regulação
isosmótica intracelular (RII) (Willmer et al. 2005; Evans et al 2009; Moyes,2009).
Ocorrem dois tipos de regulação de volume: Redução Regulatória de Volume
(RVD), e Aumento Regulatório de Volume (RVI). A RVD é utilizada quando a célula
ganha água e precisa perder volume; já o RVI ocorre quando existe a perda de água
e a necessidade de reposição do volume perdido (Lang et al. 1998, Strange 2004).
RVI e RVD podem acontecer, principalmente devido a ativação de ATPases
relacionadas ao transporte de íons, já que durante a RVD acontece a saída de
metabólitos somados à água para restabelecimento da homeostase. No caso da RVI,
acontece o contrário: a entrada de solutos na célula permite a entrada de água, de
modo a recuperar o volume anterior (Hoffmann e Dunham 1995; Wehner et al. 2003;
Strange 2004, Hoffmann et al. 2009).
1.3.1. Callinectes danae E Callinectes ornatus
Callinectes danae e Callinectes ornatus (FIGURAS 1 A e 1B) são crustáceos
decápodes, encontrados com facilidade em estuários, baías e em todo litoral ao longo
da costa sul do Brasil. É possível capturá-los com certa facilidade, seja utilizando
petrechos de pesca, como o puçá ou armadilhas do tipo covo iscadas com vísceras
de frango.Também é possível adquiri-los por intermédio de pescadores que
frequentemente os encontram em suas redes de pesca, como fauna acompanhante
(bycatch) da pesca do camarão (Baptista et al. 2003). Tanto C. danae quanto C.
ornatus são chamados de osmorreguladores fracos, pois conseguem a captação de
sal de águas salinas, mas não de água doce. Os crustáceos do gênero Callinectes
são capazes de alternar o padrão osmorregulador para osmoconformador ou vice-
versa, quando alternam entre o mar e estuário, especialmente em época de
reprodução, pois a desova sempre ocorre em ambiente mais salino (Mantelatto e
Fransozo 2000; Mantelatto 2000). C. danae e C. ornatus são osmoconformadores em
altas salinidades e em salinidades próximas à da água do mar, e hiperosmorregulam
em água do mar diluída (Masui et al. 2002; Garçon et al. 2009 ; Freire et al. 2011).
1.3.2. Hepatus pudibundus
Hepatus pudibundus (osmoconformador) (FIGURA 1C) é uma espécie de
crustáceo decápode marinho encontrado no Brasil, do Amapá ao Rio Grande do Sul,
que habita ambientes de fundos arenosos, lamosos e de conchas, de águas rasas ou
que podem chegar a 160 metros de profundidade (Melo 1996; Fracasso e Branco
2005). A sua coleta é feita por rede de arrasto, na maioria das vezes, sendo apanhado
como fauna acompanhante da pesca do camarão. A taxa de sobrevivência devido aos
danos causados pelas redes de arrasto é variável entre os diferentes grupos
taxonômicos, sendo que os crustáceos do gênero Callinectes e H. pudibundus são
muito resistentes às injúrias e a exposição ao ar (Moreira et al. 2011). Como típico em
invertebrados marinhos, H. pudibundus tem comportamento osmoconformador.
Nestes animais, a concentração osmótica do meio extracelular varia de acordo com a
concentração ou diluição da água do mar (salinidade), exigindo que o animal possua
a capacidade de regulação de volume celular diante de variação de salinidade, para
que as células possam desempenhar as suas funções (Pequex, 1995 , Freire et al
2008 ).
Devido ao fato de as brânquias estarem quase que o tempo todo em contato
com a água, elas podem ser danificadas pela alta concentração de amônia no
ambiente. Entre os danos causados, os mais importantes são: necrose, rompimento
das células pilares, infiltração de hemócitos e colapso das lamelas (Rebelo et al. 2000;
Romano e Zeng 2007 ). Em um ambiente com alta concentração de amônia, a sua
toxicidade irá depender do estágio de desenvolvimento do animal, visto que nas fases
pós larva e juvenil, a tolerância à amônia geralmente é maior (Zhao et al. 1997), além
da sua acumulação na hemolinfa, que por sua vez é influenciada pela permeabilidade
da membrana a amônia, por mecanismos de redução de difusão passiva, capacidade
de excreção contra um gradiente de concentração e processos internos de
desintoxicação (Romano e Zeng 2013). Normalmente, quando o NH 3 alcança a
hemolinfa, ele é protonado em NH4+, que então substitui potássio na atividade da
Na+/K+-ATPase basolateral das brânquias. Finalmente, o NH4+^ é excretado para o
ambiente via trocador Na+/NH4+^ apical ou via exocitose (Romano e Zeng 2007 ; Leone
et al 2017 ).
Falhas no processo de osmorregulação, como a incapacidade de regulação
isosmótica intracelular (RII), podem desencadear alteração significativa no ambiente
intracelular e possibilitar a desnaturação de proteínas envolvidas no metabolismo de
aminoácidos (Evans et al 2009 ). Se isto ocorrer, a célula pode iniciar um aumento na
síntese de chaperonas (Hsps), uma família de proteínas que hidrolisam o ATP e
auxiliam no enovelamento de proteínas recém sintetizadas, além de encaminhá-las
para destruição caso não ocorra o reparo (Terasawa 2005). Em estudos com o siri
Portunus trituberculatus , a exposição à diluição de salinidade aumentou a sua
capacidade osmorregulatória por intermédio da captação ativa de Na+^ e Cl-, ao mesmo
tempo em que houve aumento na síntese de Hsps para reparar o dano celular. Essas
atividades demandam alto custo energético, o que impacta nas taxas de crescimeto
deste crustáceo (Lu et al 2013). As Hsps também são conhecidas como proteínas de
estresse, uma família de proteínas altamente conservadas de peso molecular que
varia de 16 a 100 kDa, produzidas em todos os seres multicelulares quando
submetidos a agentes estressores como anoxia, isquemia, toxinas, acidose, choque
osmótico além de estresse térmico (Roberts et al 2010).
Uma das proteínas mais conhecidas e estudadas desta família é a Hsp70,
que auxilia na dobra e montagem de proteínas recém sintetizadas, redobramento de
proteínas deformadas e de agregados proteicos, além do controle da atividade de
proteínas regulatórias (Mayer e Bukau 2005). A presença da Hsp70 também pode ser
utilizada como biomarcador, indicando estresse de origem antropogênica em espécies
aquáticas (Webb e Gagnon 2009 ).
Embora a maioria das espécies conhecidas apresentem genes relacionados
a síntese de chaperonas, a expressão gênica destas proteínas, principalmente Hsp70,
é espécie-dependente e ambiente-dependente, assim como está relacionada com a
exposição a agentes estressores (Yenary et al. 1999). É possível que as espécies que
apresentam maiores níveis de síntese de chaperonas estejam sujeitas a grande
variação de condições ambientais, como as espécies que vivem ou passam parte do
seu ciclo de vida em estuários, o que pode torná-las resistente aos estresse (Feder e
Hofmann 1999).
Em estudos anteriores do laboratório sobre a expressão de Hsp70, C.
danae e C. ornatus , foram submetidos a choque hipo e hiperosmótico (5‰ e 40 ‰,
respectivamente) durante o período de 3 horas, não sendo possível detectar
mudanças no nível de expressão de Hsp70 em relação ao grupo controle (35‰). As
alterações de salinidade responsáveis por desequilíbrio osmótico do líquido
extracelular podem ter impactado no funcionamento normal das células. Estas
células, por sua vez, ativaram respostas rápidas, associadas simultaneamente a
outros mecanismos compensatórios envolvendo regulação de volume celular, o que
pode ter assegurado o reestabelecimento da homeostase do meio interno (Marshall
2003; Freire et al. 2008). Desta maneira, não houve a necessidade da ativação de
mecanismos mais elaborados e que são mais custosos metabolicamente, como a
síntese de Hsp70, devido ao tempo de exposição ao choque osmótico ter sido breve
(Souza-Bastos, dados não publicados).
Avaliar a intensidade e a variação da expressão de Hsp 70 diante de desafios
salinos em três espécies de decápodes braquiúros: C. danae e C. ornatus
(osmorreguladores) e H. pudibundus (osmoconformador).
Acompanhar a osmolalidade da hemolinfa de C. danae, C. ornatus e H. pudibundus diante de aumento e redução de salinidade.
Comparar a capacidade de hidratação muscular de ambas às espécies quando expostas a oscilações de salinidade do meio.
Qualificar e quantificar a expressão de Hsp70 como mecanismo molecular ativador de proteção frente ao choque osmótico.
Crustáceos decápodas de três espécies, os siris C. danae, C. ornatus e o
caranguejo marinho H. pudibundus provenientes do descarte da fauna acompanhante
da pesca com rede de arrasto de camarão, foram coletados junto às bancas de
pescadores do Balneário de Shangrilá, localizada no litoral do Paraná (25° 37' 29''S,
48 ° 25' 3 ''W). De imediato, os animais foram acomodados em caixas plásticas
contendo água do local de coleta e mantidas sob aeração constante. Após este
procedimento, foram transportados para o laboratório de Fisiologia Comparativa da
Osmorregulação do Departamento de Fisiologia da Universidade Federal do Paraná,
onde permaneceram em aquário estoque contendo água do mar a 33‰ ± 2 e 24 °C±
1 durante 05 dias. Durante o período de aclimatação, os animais permaneceram em
um aquário com aeração constante, filtro externo, pH ~8,3, oxigênio dissolvido na
água em torno de 8,0 mg/L e fotoperíodo natural. Os animais foram alimentados a
cada dois dias com pequenas porções de filé de peixe, sendo que este procedimento
foi interrompido 24 horas antes do início dos experimentos.
3.2. DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
O protocolo experimental foi executado com 1 espécime por aquário de 2 litros,
exposto ou a choque hiposalino (20‰) ou hipersalino (45‰) em intervalos com
duração de 6, ou 24, ou 72 horas. Para o controle foi utilizada a salinidade de 35‰ e
o tempo de 24 horas. Os tempos e as salinidades foram baseados em experimentos
anteriores realizados neste laboratório, em que C. danae e C. ornatus foram expostos
a condição experimental de 03 horas em salinidades 5‰ e 40‰, sem que tenha
havido diferença na concentração de Hsp70 em relação ao controle. Todo o processo
foi repetido 6 vezes para cada grupo experimental ou controle, totalizando 114 animais
(42 espécimes de C. Danae e C. Ornatus e 30 espécimes de H.pudibundus). A diluição
da salinidade foi conseguida pela adição de água de torneira filtrada com a utilização
de filtros de celulose e carvão ativado, e a solução de água do mar hipersalina foi
alcançada pela adição de sal marinho obtido comercialmente em lojas de aquários.
Após os experimentos, os animais foram crioanestesiados por aproximadamente 5
minutos, cobertos por gelo picado em caixa de isopor, e foram retirados amostras de
tecido muscular para determinação da concentração de Hsp 70 e de teor hídrico.
