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Este documento aborda o papel das moléculas mhc (major histocompatibility complex) na apresentação de antígenos aos linfócitos t, com ênfase nas classes i e ii. Descreve-se a importância de cada classe na apresentação de antígenos intracelulares e extracelulares, respectivamente, e os processos envolvidos na geração e expressão de moléculas mhc-peptídeo na superfície celular. Além disso, o documento discute como certos vírus podem evitar a apresentação de antígenos por mhc, especialmente através da inibição da tap (transporter associated with antigen processing).
O que você vai aprender
Tipologia: Notas de estudo
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Não perca as partes importantes!
Disciplina: SEMINÁRIOS APLICADOS
Duanne Alves da Silva Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
Goiânia 2011
ii
Seminário apresentado à disciplina de Seminários Aplicados do Programa de Pós-Graduação em Ciência Animal da Escola de Veterinária e Zootecnia da Universidade Federal de Goiás
Nível: Doutorado
Área de Concentração: Sanidade Animal e Higiene e Tecnologia de Alimentos
Orientador (a): Profa. Dra. Ana Paula Junqueira Kipnis
Comitê de Orientação: Profa. Dra. Wilia Marta Elsner Diederichsen de Brito – EV/UFG Profa. Dra Liliane Borges de Menezes – IPTSP/UFG
Goiânia 2011
iv
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1: Estrutura das moléculas de MHC classes I e II................................
FIGURA 2: Micrografia eletrônica de uma célula dendrítica................................
FIGURA 3: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos endógenos via MHC classe I para linfócitos TCD8+............................................
FIGURA 4: Os quatro processos de digestão celular mediada por lisossomos...........................................................................................................
FIGURA 5: Síntese do MHC classe II evidenciando a remoção do CLIP pela molécula HLA-DM..............................................................................................
FIGURA 6: Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos exógenos via MHC classe II para linfócitos TCD4+...........................................
FIGURA 7: Mecanismos de proteólise lisossomal.............................................
FIGURA 8: A macroautofagia regula a apresentação cruzada e as vias de apresentação de antígenos intra e extracelulares nas moléculas de classe II do MHC.......................................................................................................................
FIGURA 9: Regulação do MHC I de camundongos pelas proteínas UL49.5, US3, US6, BNFL2a e ICP47................................................................................
FIGURA 10: Expressão dos níveis de inibidores virais em células de camundongos..........................................................................................................
FIGURA 11: Expressão das proteínas UL49.5 dos herpesvírus de ruminantes.........................................................................................................
FIGURA 12: Citometria de fluxo evidenciando a expressão de moléculas de MHC-I na superfície de células MDBK e MJS, e de MHC-II em células MJS......................................................................................................................
FIGURA 13: A atividade de transporte do TAP foi analisada nas células MDBK e MJS expressando as proteínas UL49.5 homólogas........................................
FIGURA 14: Níveis de TAP1 e TAP2 expressos nas células MJS.................... 24
O organismo dos animais e humanos está exposto a constantes ataques de microrganismos, podendo sofrer as mais variadas injúrias. No entanto, existem mecanismos competentes no combate a essas invasões visando responder a esses ataques de uma forma eficiente. Um patógeno, para estabelecer-se com sucesso no organismo, precisa ultrapassar barreiras e ser capaz de driblar as defesas do hospedeiro que pretende infectar. Por sua vez, o organismo infectado necessita reconhecer o agente invasor para definir as ações a serem tomadas no intuito de restabelecer o equilíbrio. Esse ponto é crucial quando ocorre uma injúria, pois uma resposta exacerbada pode eliminar a infecção, mas por ser tão intensa, pode levar a morte do hospedeiro, assim como uma resposta fraca pode não ser suficiente para eliminar o agente. O sistema imunológico é, portanto, um vigilante do organismo, pois sua função não é apenas proteger e defender o indivíduo frente a invasão de agentes estranhos, mas principalmente de manter a homeostase corporal. Diversas substâncias, ao entrarem no organismo de um indivíduo, podem ser reconhecidas como antígenos, tais como: proteínas, carboidratos, lipídeos e ácidos nucléicos. Para que o sistema imune responda a essas substâncias estranhas desenvolvendo suas funções eficientemente, elas precisam ser processadas e apresentadas a células específicas. A célula do sistema imunológico responsável por esse processamento e posterior apresentação de antígenos, sejam eles próprios ou não próprios, é conhecida como célula apresentadora de antígeno (APC). Macrófagos, linfócitos B, neutrófilos, células endoteliais e células dendríticas (DC) atuam como APCs, sendo que as DCs são consideradas APCs profissionais, por serem mais eficientes no processamento e apresentação antigênicos (THÉRY & AMIGORENA, 2001; LYN et al., 2008; VYAS et al., 2008). Apesar de o processamento e a apresentação de antígenos serem mecanismos complexos que envolvem diferentes fases, muitos microrganismos conseguem subverter etapas distintas desses processos. Dentre os agentes que interferem nesses mecanismos de forma eficiente encontram-se os
2.1- Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC)
O MHC ( Major Histocompatibility Complex ) é um locus amplo com genes altamente polimórficos que codifica as moléculas classes I e II, assim como outras proteínas. Essas moléculas têm a função de se ligar a peptídeos antigênicos e apresentá-los aos linfócitos T específicos. As moléculas MHC foram originariamente reconhecidas pelo seu papel no desencadeamento de resposta das células T que causavam a rejeição de transplantes (BODMER, 1987; KLEIN & SATO, 2000). As duas classes de MHC apresentam características estruturais semelhantes, no entanto, diferem quanto a apresentação dos antígenos a determinado tipo de linfócito. O MHC de classe I é uma molécula composta por duas cadeias polipeptídicas distintas ligadas de forma não covalente; a cadeia pesada (ou cadeia α) e um polipeptídeo não polimórfico que não é codificado pelo MHC, a β 2 -microglobulina (ABBAS et al., 2008). Já nas moléculas de classe II do MHC, as duas cadeias polipeptídicas (α e β), que também estão ligadas de forma não covalente, são codificadas por genes do MHC polimórficos (VILLADANGOS, 2001). Ambas as classes apresentam uma fenda extracelular de ligação de antígenos, uma região não polimórfica semelhante a imunoglobulina (Ig), uma região transmembrana e uma região citoplasmática. A fenda é constituída de α- hélices nas laterais e uma base de oito lâminas β-pregueadas antiparalelas. A fenda das moléculas de classe I é formada pelos domínios α1 e α2 da cadeia α, enquanto que a da classe II é formada pelos domínios α1 e β1 das duas cadeias (Figura 1) (VILLADANGOS, 2001; ABBAS et al., 2008).
FIGURA 1: Estrutura das moléculas de MHC classes I e II. Fonte: ABBAS et al., 2008.
O MHC de classe I é um receptor para antígenos endógenos (intracelulares) e está presente na maior parte das células nucleadas. Já o MHC de classe II é um receptor para antígenos exógenos (extracelulares) e é encontrado nas principais células apresentadoras de antígenos (células dendríticas, macrófagos e linfócitos B). É importante ressaltar que ambas as classes são receptores de antígenos protéicos (VILLADANGOS, 2001; ABBAS et al., 2008).
QUADRO 1: características das moléculas de MHC classes I e II Características MHC classe I MHC classe II Cadeias Polipeptídicas α (44-47 kD) β2-microglobulina (12 kD)
α ( 32 kD) β (29 – 32 kD)
Localização dos resíduos polimórficos
Domínios α1 e α 2 Domínios α1 e β 1
Local de ligação para correceptor de célula T
Região α3 liga CD8 Região β2 liga CD
Tamanho da fenda de ligação de peptídeo
Acomoda peptídeos de 8- 11 resíduos
Acomoda peptídeos de 10- 30 resíduos ou mais Fonte: ABBAS et al., 2008.
FIGURA 2: Micrografia eletrônica de uma célula dendrítica. Fonte:http://pt.wikipedia.org/wiki/C%C3%A9lula_dend r%C3%ADtica
2.3- Processamento e apresentação de antígenos endógenos
Todas as células nucleadas podem apresentar peptídeos associados ao MHC classe I, pois todas elas expressam essa molécula em sua superfície. Antígenos protéicos presentes no citosol como, proteínas virais ou proteínas que sofreram mutação em células tumorais são, em sua maioria, sintetizados endogenamente. Esses antígenos protéicos são degradados pelo proteassoma, um grande complexo catalítico de proteases presente no citoplasma e no núcleo da célula para, posteriormente, serem apresentados aos linfócitos TCD8+^ via MHC classe I (PEAPER et al., 2008). O proteassoma degrada proteínas em peptídeos contendo de três a 20 aminoácidos. A forma ativa do proteassoma é o complexo 26S, o qual reconhece e se liga a proteínas ubiquitinadas. A ubiquitina é um pequeno polipeptídeo que funciona como uma chaperonina, sendo responsável pela checagem estrutural das proteínas que são sintetizadas pela célula. Quando ocorre algum erro na síntese protéica, a ubiquitina se liga de forma covalente a proteína, permitindo o reconhecimento desta pelo proteassoma. O complexo 26S é composto pela subunidade catalítica 20S e pela subunidade reguladora 19S. Em todas as células eucariotas, o complexo 26S é formado por uma estrutura anelar que apresenta regiões não catalíticas (subunidades α) e catalíticas (subunidades β). Três subunidades β, que são expressas
constitutivamente, são substituídas por subunidades induzíveis chamadas LMP2 (iβ1), MECL1 (iβ2) e LMP7 (iβ5) quando há estímulo do IFN-γ sobre as células. Essas subunidades constituem o chamado imunoproteassoma e são importantes na geração dos peptídeos de ligação a classe I do MHC, pois alteram a especificidade do substrato do proteassoma que passa a produzir peptídeos contendo de seis a 30 aminoácidos (MURATA et al., 2009). O imunoproteassoma apresenta uma elevada capacidade de clivar regiões com aminoácidos hidrofóbicos ou que contenham terminal carboxila básico, os quais são freqüentemente encontrados na porção C- terminal dos peptídeos ligados ao MHC classe I (VAN DEN EYNDE & MOREL, 2001). Os peptídeos antigênicos gerados no citosol precisam ser encaminhados ao retículo endoplasmático, pois é nessa organela que ocorre a síntese das moléculas de MHC classe I. Os genes do MHC codificam as duas cadeias de um heterodímero chamado transportador associado a processamento de antígenos (TAP). Esse transportador está localizado na membrana do retículo endoplasmático e medeia o transporte ativo dependente de ATP dos peptídeos citosólicos para o interior do retículo. A síntese da proteína TAP também é estimulada pelo IFN-γ e os genes TAP1 e TAP2 (que codificam as proteínas formadoras do canal de entrada dos peptídeos no retículo) estão próximos aos genes que codificam LMP2 e LMP7 no MHC (MURATA et al., 2009). Além disso, apesar da proteína TAP apresentar uma ampla especificidade de substrato, assim como o imunoproteassoma, ela possui um transporte ótimo de peptídeos que contenham de seis a 30 aminoácidos e que possuem terminais carboxilas básicos (no homem) ou resíduos hidrofóbicos (no homem e nos camundongos), que são as características dos peptídeos gerados no imunoproteassoma permitindo a ligação às moléculas do MHC (ABBAS et al., 2008). A proteína TAP é altamente conservada entre diversas espécies. A TAP1 e a TAP2 de humanos, suínos, bovinos e roedores apresentam 70 a 80% de similaridade de aminoácidos (McCLUSKEY et al., 2004; GARCIA-BORGES et al., 2006). Acredita-se que este transportador esteja envolvido na apresentação antigênica mediada pelo MHC I em diferentes espécies (OHTA et al., 2003).
2.4- Processamento e apresentação de antígenos exógenos
A geração de moléculas do complexo peptídeo- MHC classe II e sua expressão na superfície celular são essenciais para a ativação de linfócitos TCD4+^ (ROCHA & NEEFJES, 2008). A geração de peptídeos que se ligarão as moléculas de MHC II pode ocorrer por diversos mecanismos de endocitose que diferem em importância de acordo com a APC. Eles podem acessar a via endocítica por pinocitose, fagocitose, endocitose mediada por receptor e autofagocitose (ou autofagia) (Figura 4) (WATTS, 1997).
FIGURA 4 : Os quatro processos de digestão celular mediada por lisossomos. (i) endocitose mediada por receptores específicos; (ii) pinocitose (englobamento de gotículas contendo líquido extracelular); (iii) fagocitose (partículas extracelulares); (iv) autofagia (micro- e macro- de proteínas e organelas intracelulares). Fonte: CIECHANOVER, 2005.
A formação do complexo peptídeo- MHC é resultado do encontro de duas vias: o transporte de antígenos por meio de endossomos; e a síntese do
MHC II no retículo endoplasmático seguida do envio da molécula ao compartimento endocítico para que haja a ligação ao antígeno. Três estruturas principais estão envolvidas nesse processo: os endossomos precoces (ou primários), os endossomos tardios (ou secundários) e os lisossomos. Os endossomos precoces são as primeiras vesículas que entram em contato com o material endocitado, apresentam um pH ligeiramente ácido e não possuem boa capacidade proteolítica. Já os endossomos tardios são mais ácidos e contêm alguns dos componentes característicos de compartimentos lisossômicos, como proteases e glicoproteínas. Enquanto os lisossomos apresentam pH baixo e são ricos em enzimas hidrolíticas sendo uma das principais estruturas eliminadoras de resíduos da célula (VILLADANGOS, 2001). A via endocítica é interceptada por uma rota que se origina nos últimos componentes do complexo de Golgi, a rede trans-Golgi (TGN). Essa rede é um meio de comunicação onde as moléculas recém sintetizadas provenientes do retículo são direcionadas para a via endocítica, caso apresentem sinais específicos (como manose 6-fosfato, por exemplo). Se essas moléculas se destinarem a secreção ou expressão na membrana plasmática elas também podem entrar na via endocítica (VILLADANGOS, 2001). As cadeias α e β do MHC de classe II são sintetizadas coordenadamente e se associam no retículo endoplasmático formando um heterodímero. Este se liga a uma proteína chamada cadeia invariante (Ii) que ocupa as fendas de ligação de peptídeos da molécula de classe II. Os dímeros recém formados são instáveis e suas dobras e agregação também são auxiliadas por chaperoninas residentes no retículo como a calnexina, assim como ocorre na formação do MHC classe I. Logo, com a cadeia Ii ocupando a fenda de ligação, o MHC classe II não consegue se ligar e apresentar os antígenos que encontra no retículo, deixando tais peptídeos se associarem as moléculas de classe I. Além disso, a cadeia invariante também promove o dobramento e agregação das moléculas classe II recém formadas e direciona o complexo classe II- cadeia Ii para a via endocítica de modo que ocorra o encontro com os peptídeos interiorizados e processados nas vesículas (HASTINGS & CRESSWELL, 2011).
nessa etapa como uma chaperonina, assegurando a ligação de peptídeos de elevada afinidade ao MHC classe II. Como as extremidades da fenda de ligação do MHC II estão abertas (Figura 1), pode ocorrer a ligação de grandes peptídeos ou até proteínas inteiras desdobradas. As enzimas proteolíticas são as responsáveis por aparar essas proteínas até que tenham o tamanho apropriado para o reconhecimento das células T. Assim, os peptídeos apresentados na superfície celular em moléculas de classe II do MHC, geralmente, apresentam um tamanho que varia de 10 a 30 aminoácidos (Figura
FIGURA 6 : Mecanismos de processamento e apresentação de antígenos exógenos via MHC classe II para linfócitos TCD4+. Fonte: ABBAS et al., 2008.
2.5- Apresentação cruzada
Originalmente, acreditava-se que as moléculas de MHC classe I seriam apresentadoras, principalmente, de antígenos endógenos. No entanto, notou-se que certos tipos celulares, principalmente APCs profissionais como as células dendríticas, eram capazes de exibir antígenos extracelulares nas
moléculas de classe I por meio de um mecanismo de apresentação cruzada (AMIGORENA & SAVINA, 2010). Tal mecanismo também ocorre com as moléculas de classe II, que podem ligar-se a antígenos endógenos e exibí-los na superfície das células apresentadoras (MARRACK et al., 1993; DENGJEL et al., 2005) inclusive, após o processamento intracelular desses antígenos (JARAQUEMADA et al., 1990; MÜNZ et al., 2000). Alguns antígenos ganham acesso a degradação lisossômica nos compartimentos carreadores de MHC II por meio do processo de autofagia (NIMMERJAHN et al., 2003; PALUDAN et al., 2005; JAGANNATH et al., 2009). A autofagia é uma via catabólica que leva a degradação proteolítica dos compartimentos celulares por lisossomos (Figura 4). Este mecanismo permite o contato de antígenos intracelulares com o MHC de classe II e sua posterior apresentação por essas moléculas. Além disso, já se tem evidências de que a autofagia pode auxiliar a apresentação de antígenos extracelulares tanto pelo MHC I quanto pelo MHC II (Figura 7) (DENGJEL et al., 2005; HAYASHI- NISHINO et al., 2009; MÜNZ, 2010). Um tipo particular de autofagia, a macroautofagia, tem sido implicado na apresentação de antígenos intracelulares via MHC classe II para os linfócitos TCD4+. Durante esse processo componentes celulares, como organelas danificadas, agregados protéicos ou mesmo antígenos, são englobados por vesículas originárias do retículo endoplasmático, do complexo de Golgi ou da membrana mitocondrial (Figuras 4 e 7) (ENGLISH et al., 2009; HAYASHI-NISHINO et al., 2009).
FIGURA 8 : A macroautofagia regula a apresentação cruzada e as vias de apresentação de antígenos intra e extracelulares nas moléculas de classe II do MHC. Fonte: MÜNZ, 2010.
Durante o processamento de partículas endocitadas ou que estejam presentes no citosol, é formado o autofagossomo, uma vesícula que apresenta uma membrana isoladora ao redor dessas partículas ou de constituintes do citoplasma celular. O autofagossomo se funde com o MIIC gerando os corpos multivesiculares (MVBs). Os autofagossomos podem fundir-se diretamente com os MVBs ou após a fusão com endossomos (formando o anfissomo). As partículas internalizadas pelo autofagossomo também podem escapar dos MVBs por exocitose, sendo apresentadas pelas células dendríticas via MHC I (MÜNZ, 2010).
2.6- Interferências virais no processamento e apresentação antigênicos
2.6.1- Inibição do transportador associado ao processamento de antígenos (TAP)
Os herpesvírus conseguem escapar da eliminação dos linfócitos T citotóxicos por meio de interferências específicas na função de apresentação antigênica das moléculas do MHC I. Muitos vírus, especialmente os herpesvírus, codificam moléculas que bloqueiam a função do TAP. Atualmente, quatro genes codificados pelos herpesvírus já foram identificados como inibidores desta proteína transportadora (VERWEIJ et al., 2011a). Os herpesvírus de animais, pertencentes ao gênero Varicellovirus , como o herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1), o vírus da Doença de Aujeszky ou pseudoraiva (PRV ou SuVH-1) e os herpesvírus de eqüinos tipos 1 e 4 (EHV 1 e 4), são capazes de inibir o TAP por meio de uma proteína chamada UL49.5, codificada por esses patógenos. A UL49.5 do BoHV-1 bloqueia mudanças conformacionais no complexo TAP, impedindo os rearranjos estruturais necessários para o transporte do antígeno. Ademais, o TAP é direcionado para degradação pelo proteassoma (KOPPERS-LALIC et al., 2005; VERWEIJ et al., 2008). As proteínas UL49.5 codificadas pelos herpesvírus bovino tipo 5 (BoHV-5), herpesvírus bubalino tipo 1 (BuHV-1), herpesvírus cervídeo tipo 1 (CvHV-1) e herpesvírus felídeo tipo 1 (FeHV-1), também já foram identificadas como potentes inibidores do TAP (VERWEIJ et al., 2011b). Outros herpesvírus de animais como os herpesvírus de galídeos tipos 1 e 2 (vírus da laringotraqueíte infecciosa (ILTV) e vírus da Doença de Marek (MDV), respectivamente), pertencentes aos gêneros Iltovírus e Mardivirus , também já foram alvo de estudos com relação as prováveis proteínas inibidoras da apresentação pelo MHC I. Apesar de VERWEIJ et al., (2011b) terem observado que as proteínas UL49.5 desses vírus falharam na inibição do TAP, ainda não está esclarecido se o ILTV possui outro tipo mecanismo e se o MDV codifica alguma proteína que tenha ação inibidora.
