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LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS α alfa β beta γ gama. µl microlitros. AQN espermadesina suína. ASFP proteína ácida do plasma seminal.
Tipologia: Slides
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Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa Faculdade de Veterinária Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias BODESINAS: ESPERMADESINAS CODIFICADAS POR GENES DA VESÍCULA SEMINAL DE CAPRINOS DOMÉSTICOS ( Capra hircus ) Dárcio Ítalo Alves Teixeira Fortaleza-Ceará 2005
Dárcio Ítalo Alves Teixeira BODESINAS: ESPERMADESINAS CODIFICADAS POR GENES DA VESÍCULA SEMINAL DE CAPRINOS DOMÉSTICOS ( Capra hircus ) Tese apresentada à Faculdade de Veterinária da Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias. Área de concentração: Reprodução e Sanidade Animal Orientador: Prof. Dr. Vicente José de Figueirêdo Freitas Fortaleza-Ceará 2005
Aos meus pais, Damião Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia, pelo apoio e incentivo incondicional ao estudo... Dedico
Quem reconhece a sua ignorância Revela a mais alta sapiência. Quem ignora a sua ignorância Vive na mais profunda ilusão. Não sucumbe à ilusão Quem conhece a ilusão como ilusão. O sábio conhece o seu não-saber, E essa consciência do não-saber O preserva de toda a ilusão. Lao-Tsé
Ao Prof. M.Sc. Rodrigo Maranguape pela disposição de todos os equipamentos e mão de obra para realização deste trabalho. À Doutoranda Luciana Magalhães de Melo pela dedicação e apoio imensurável na composição deste trabalho o qual está apenas começando. Ao Dr. Alexandre Havt pela contribuição oferecida durante a confecção dos artigos científicos. Aos Professores e funcionários do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) da UECE, pelo apoio técnico e burocrático para o desenvolvimento deste trabalho. Aos meus amigos da Iniciação Cientifica do Laboratório de Fisiologia e Controle da Reprodução, Camila Pontes Albuquerque, Déborah de Melo Magalhães, Francisco Carlos de Sousa, Isadora Machado Teixeira, João Davi Araújo da Silva, Karlliely de Castro Almeida, Raylene Ramos Moura, e Suely Renata Gaya Avelar, pela dedicação aos trabalhos e sobretudo pelo convívio diário no laboratório. Aos meus amigos Mestrandos e Doutorandos do Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias, M.V. Iracelma Julião Arruda, M.V. Aline Lima Souza, M.V. Anderson Pinto Almeida, Química Alexsandra Fernandes Pereira, Bióloga Maria Luciana Lira de Andrade, M.Sc. João Batista Cajazeiras, M.Sc. Ney Rômulo de Oliveira Paula e o Dr. Edílson Soares Lopes Júnior pela dedicação no Setor de Ovinocaprinocultura, produzindo ciência de excelência e pelas dias e noites de dedicação ao trabalho. Aos meus amigos do Laboratório de Moléculas Biologicamente Ativas – BIOMOL- LAB, pela dedicação e esforço em manter uma instituição de pesquisa de qualidade. Aos Meus grandes Amigos Dr. Carlos Alberto de Almeida Gadelha e Dra. Tatiane Santi Gadelha, pelo exemplo de casal e apoio durante este doutoramento.
Aos Funcionários Selmar e César que participam dos trabalhos diários com responsabilidade e competência. À minha família pela amizade, em especial às minhas queridas Tias Maria Salete Silveira e Freitas, Maria Lucy Teixeira Pontes e Maria Lucineide Teixeira e Tios José Luciê Teixeira e Antônio Alves Maia. Aos Meus Irmãos e Irmãs, Delândio Luiz Alves Teixeira, Dárlio Inácio Alves Teixeira, Daniele Maria Alves Teixeira e Dirla Maria Alves Teixeira, pelo companherismo e exemplo de dedicação à família. Aos meus pais que tanto amo, Damião Alves Maia e Maria Luiza Teixeira Maia por tudo que eles me ensinaram na minha vida. Ao meu amor, Elizabeth Saraiva Peixoto Pinheiro pela compreensão nos momentos ausentes e pelo incentivo nas horas difíceis, obrigado por está sempre ao meu lado. E finalmente à todos aqueles que de uma forma ou de outra contribuíram para o conteúdo desta tese e pela construção de minha personalidade.
Mammalian seminal plasma contains among others, proteins named spermadhesins, which are the major proteins of boar and stallion seminal plasma. These proteins appear to be involved in capacitation and sperm-egg interaction. Previously, we reported the presence of a protein related to spermadhesins in goat seminal plasma. This work was carried out in two steps with different objectives. In the first step, we have further characterized this protein and we purpose the ion-exchange chromatography to obtain this seminal protein. In the second step, we aimed to found the gene that encodes goat spermadhesin. The seminal plasma from four adult Saanen bucks was pooled and dialyzed against distilled water and freeze-dried. Lyophilized proteins were loaded onto an ion-exchange chromatography column. Dialyzed-lyophilized proteins from the mean peak of DEAE-Sephacel were applied to a C2/C18 column coupled to a RP-HPLC. Proteins from DEAE-Sephacel chromatography step were dialyzed and submitted to a Heparin- Sepharose High Performance Chromatography. To achieve the second objective, we prepared the cDNAs of testis and seminal vesicle from a sexually mature buck. To amplify the cDNA 3’-end we tested two primers designed based on distinct conserved regions of goat spermadhesin. Goat seminal plasma yielded 6.47 ± 0.63 mg (mean ± SEM) of a major retained fraction. The protein was primarily named BSFP (buck seminal fluid protein). BSFP showed no heparin-binding capabilities. Cloning and sequencing of PCR products allow us to identify three new cDNAs encoding buck spermadhesins named bodhesin-1, -2 and -3. All three deduced amino acid sequences are highly similar (50%) to boar AWN spermadhesin and the bodhesin-2 sequence is identical to the BSFP N-terminal. In conclusion, goat spermadhesin can be efficiently isolated by ion-exchange and reverse-phase chromatographies. Finally, these results indicate that bodhesins seem to belong to a multigene family encoding proteins with conserved CUB domain essential for their biological function. To our knowledge, this is the first report of molecular cloning of buck spermadhesins (bodhesins).
α alfa β beta γ gama μl microlitros AQN espermadesina suína ASFP proteína ácida do plasma seminal AWN espermadesinas suína e equina Bmp1 proteína morfogenética do osso- BSFP proteína do fluido seminal de bode BSP – A1, A2, A3 proteína do plasma seminal bovino °C graus centígrados Ca++^ cálcio cDNA DNA complementar CP fosfatidal colina (colina plasmalogena) CRISP proteínas secretórias ricas em cisteínas CUB componentes do osso do ouriço do mar Da Dalton ddH 2 O água tratada com dietilpirocarbonato DNA ácido desoxiribonucléico DPG difosfatidilglicerol EP losfatidal etanolamina FISH hibridação in situ com fluorescência Fn – 2 domínio fibronectina tipo II g grama g gravidade h hora HPLC cromatografia líquida de alta precisão i.m. intramuscular kDa quilodaltons
LPC lisofosfatidilcolina LPE lisofosfatidil etanolamina M molar Man-6-P manose-6-fosfato mg miligrama min minutos mL mililitros mRNA RNA mensageiro PA ácido fosfatídico PC fosfatidil colina PE fosfatidil etanolamina pH potencial hidrogeniônico PI fosfatidil inositol PM peso molecular PS fosfatidil serina PSP proteína do plasma seminal de suínos PSP-I unidade I da PSP PSP-II unidade II da PSP RNA Ácido Ribonucléico rpm rotações por minuto RT-PCR transciptase reversa acoplada a uma reação em cadeia de polimerase SPH esfingomielina Sp17, Sp56 proteína 17 e 56 do espermatozóide SSP-7 proteína do plasma seminal do garanhão TFA ácido trifluoracético UECE Universidade Estadual do Ceará Uegf proteína do embrião do ouriço do mar UFC Universidade Federal do Ceará
total....................................................................................................... 61 Figura 17: Transformação da bactéria E. coli ........................................................ 63 Figura 18: (A) Análise eletroforética do cDNA sintetizado de testículo (T) e vesícula seminal (SV) após RT-PCR. (B) Amplificação do cDNA 3’-end usando primers Q0 e SMD-SE2. As bandas em SV são os genes da bodesina................................................................................. 65 Figura 19: Múltiplo alinhamento da seqüência de aminoácido da espermadesina.
Tabela 1: Composição fosfolipídica do espermatozóide e do plasma seminal de caprinos................................................................................................... 24 Tabela 2: Proteínas BSPs do plasma seminal de diversas espécies........................ 26 Tabela 3: Proteínas de espermatozóide de mamíferos identificadas pela capacidade de ligarem-se à zona pelúcida do oócito ................................................................................................................. 30 Tabela 4: Cronograma dos principais eventos envolvendo lectinas....................... 34 Tabela 5: Funções fisiológicas das lectinas........................................................... 41 Tabela 6: cDNA das espermadesinas encontradas em suínos e bovinos................ 47 Tabela 7: cDNAs das espermadesinas .................................................................. 66 INTRODUÇÃO
1.1 Definição O plasma seminal é um fluido proveniente da secreção do epidídimo e de glândulas acessórias contidas no trato reprodutor masculino que dá suporte aos espermatozóides, além de formar o sêmen (CALVETE, 1996). As glândulas acessórias responsáveis pela produção do plasma seminal estão situadas junto à uretra. Em caprinos, as glândulas vesiculares são em número de duas e são formadas por um corpo glandular. A próstata, pouco desenvolvida, está distribuída ao redor do lúmen da uretra. As glândulas bulbo-uretrais têm tamanho de uma avelã e possuem somente um conduto excretor de cada lado (YANAGIMACHI , 1988)(Figura 1). Figura 1: Trato reprodutor masculino de caprino. 1.2 Composição e função do plasma seminal
Os constituintes do plasma seminal de mamíferos tem recebido considerável atenção, por sua capacidade de influenciar a fertilidade potencial dos espermatozóides e pelo fato de que alguns constituintes seminais tenham suas origens em órgãos específicos, cujas concentrações são importantes para avaliar a capacidade secretora de várias glândulas sexuais anexas, as quais dependem da produção de andrógenos pelos testículos para desempenhar suas funções (MANN, 1964). O plasma seminal contém uma variedade de constituintes bioquímicos, alguns dos quais são relativamente específicos dentro do mecanismo de regulação da função dos espermatozóides, entretanto as exatas funções destes componentes seminais no controle espermático ainda não estão bem elucidadas (STRZEZEK & CIERESZKO, 1987). A composição protéica do plasma seminal varia de espécie para espécie. Foi verificado, em muitas espécies de mamíferos, que o plasma seminal contém fatores que influenciam tanto na habilidade do espermatozóide em fertilizar como também, causa importantes efeitos na fisiologia reprodutiva da fêmea (SHIVAJE et al. , 1990). Dentre os componentes do plasma seminal , podemos citar compostos inorgânicos, tais como aminoácidos, peptídeos, proteínas de baixo e alto peso molecular, carboidratos, lipídios, minerais, hormônios, fatores de crescimento, inibidores, imunossupressores, imunoglobulinas e estes variam entre as espécies, intervalo entre ejaculações e saúde do animal (FRAZER & BUCCI, 1996). Para obtenção de energia os espermatozóides utilizam carboidratos como a glicose e a frutose, mas a principal composição de carboidratos do plasma seminal é de frutose, onde esta influencia diretamente a motilidade espermática (CHAKRABARTI & GUHA, 1993; GONZALES, 2001). Ibarra & Navaridas (1992), sugerem que a frutose seminal comporta-se como um marcador das funções das vesículas seminais, sendo necessárias para à sobrevivência e motilidade inicial da célula espermática, e que o ácido cítrico reflete a atividade secretora
