Baixe Aula 3: Titulação de Aminoácidos e Estrutura de Proteínas e outras Manuais, Projetos, Pesquisas em PDF para Bioquímica, somente na Docsity!
QBQ0204 Bioquímica: Estrutura de Biomoléculas e Metabolismo
Guia de estudos
Aula 3 : titulação de aminoácidos e estrutura de proteínas
Seguindo o mesmo esquema de marcação de aulas anteriores há
diversos tipos de leituras nos textos a seguir (D.L. Nelson e M.M. Cox - Princípios
de Bioquímica de Lehninger, 6ª ed. e Marzzocco e B. B. Torres - Bioquímica
Básica, 4ª ed.). Novamente, não se assustem com o número de páginas.
Estamos mantendo a leitura básica em torno de 20 páginas. Mas, como trata-se
de um assunto extenso, os livros de bioquímica avançada possuem bastante
informação. É importante que vocês tenham esse material para eventuais
consultas. No meio das leituras avançadas, na página 16, há o tema “3.
trabalhando com proteínas”. Observem que esta é uma leitura complementar
somente da aula 4 (marcado no texto), mas para não ficar cortando o capítulo no
meio ele já se encontra neste guia.
As proteínas, além de constituírem o componente celular mais abundante, são as biomoléculas mais diversificadas quanto a forma e função. São o componente principal, ou único, de estruturas tão diferentes quanto a clara dos ovos, os cascos e chifres, a pele e o cabelo, o bico e as penas das aves. As funções que desempenham são estruturais e dinâmicas. Fazem parte de todas as membranas e organelas celulares, do citoesqueleto e da matriz extracelular. Participam de quase todos os processos biológicos, já que incluem as enzimas, catalisadores das milhares de reações químicas que ocorrem nos organismos. Outra função dinâmica das proteínas é o transporte de moléculas (oxigênio, lipídios etc.) e íons pelo plasma e a transferência destes compostos através das membranas. Os mecanismos de defesa do organismo incluem diversas proteínas, como as imunoglobulinas e o interferon, que atuam no combate a infecções bacterianas e virais. Muitas proteínas participam do controle global do metabolismo, devido à sua ação hormonal, como é o caso da insulina e do glucagon. São também responsáveis por mecanismos contráteis, sendo de particular importância a actina e a miosina, que atuam na contração muscular. Até mesmo a atividade dos genes é controlada por proteínas: proteínas reguladoras ligamse ao DNA em sítios específicos, localizados próximo às extremidades dos genes, sinalizando o início e o término corretos da transcrição. Estas proteínas são capazes de reconhecer, no genoma de mamíferos, o sítio regulador de um determinado gene, dentre dezenas de milhares de genes diferentes.
Aminoácidos componentes de proteínas
As proteínas são polímeros de aminoácidos
Apesar de apresentarem estruturas e funções tão variadas, as proteínas são sintetizadas a partir de apenas 20 aminoácidos diferentes. Ainda que o número dos monômeros precursores pareça pequeno, as possibilidades de existirem proteínas distintas são espantosamente grandes. Considerandose a formação de proteínas hipotéticas contendo somente 20 aminoácidos, um de cada tipo, poderiam ser obtidas 2,4 × 10^18 moléculas diferentes! Como as proteínas são compostas por centenas de aminoácidos, cada um deles podendo estar representado mais de uma vez, a possibilidade de construção de moléculas diferentes é praticamente infinita.
Os aminoácidos diferem entre si pela cadeia lateral
Aminoácidos são compostos que apresentam, na sua molécula, um grupo amino (− NH 2 ) e um grupo carboxila (– COOH). Entre os aminoácidos que compõem as proteínas, a única exceção é a prolina, que contém um grupo imino (– NH –) no lugar do grupo amino, sendo a rigor um iminoácido. Em pH fisiológico, esses grupos estão na forma ionizada: –
NH 3 +, – COO−^ e – NH 2 +. Os aminoácidos têm uma fórmula básica comum, com os grupos amino e carboxila ligados ao carbono α, ao qual também se liga um átomo de hidrogênio e um grupo variável chamado cadeia lateral ou grupo R:
As propriedades das cadeias laterais dos aminoácidos — principalmente a afinidade pela água — são importantes para a conformação das proteínas e, portanto, para sua função. De acordo com a polaridade do grupo R, os aminoácidos são classificados em duas grandes categorias: aminoácidos apolares (grupo R hidrofóbico) e aminoácidos polares (grupo R hidrofílico) (Figura 2.1).
Aminoácidos livres pK 1 (α– COO–) pK 2 (α– NH 3 +) pKR(grupo R) Glicina 2,35 9, Alanina 2,35 9, Valina 2,29 9, Leucina 2,33 9, Isoleucina 2,32 9, Metionina 2,13 9, Prolina 1,95 10, Fenilalanina 2,20 9, Triptofano 2,46 9, Serina 2,19 9, Treonina 2,09 9,10 Aminoácidos em proteínas Asparagina 2,14 8,72 COO –^ terminal NH 3 +^ terminal Grupos R Glutamina 2,17 9,13 3,5–4,0 7,6–9, Cisteína 1,92 10,70 8,37 8,0–9, Tirosina 2,20 9,21 10,46 9,5–10, Lisina 2,16 9,06 10,54 9,5–10, Arginina 1,82 8,99 12,48 11,5–12, Histidina 1,80 9,33 6,04 6,0–7, Aspartato 1,99 9,90 3,90 4,0–5, Glutamato 2,10 9,47 4,07 4,0–5,
As proteínas são formadas por L-aminoácidos
O carbono α de todos os aminoácidos, com exceção da glicina, é assimétrico, já que está ligado a quatro grupos diferentes: – NH 3 +, – COO−, – H e – R. Na glicina, este carbono não é assimétrico porque o grupo R é constituído por – H.
Os aminoácidos com carbono α assimétrico apresentam dois isômeros opticamente ativos, os isômeros D e L, que são imagens especulares um do outro (Figura 2.2). Todas as proteínas encontradas nos seres vivos são formadas por L aminoácidos. Os Daminoácidos aparecem somente em certos antibióticos e em peptídios componentes da parede de algumas bactérias. Os aminoácidos com configuração D, assim como outros aminoácidos exóticos encontrados nas células, são formados por modificações dos 20 aminoácidos proteicos ou são produtos intermediários das vias de síntese destes compostos.
Figura 2.2 Isômeros L e D da alanina, em duas representações moleculares diferentes. A linha pontilhada indica o plano de um espelho.
Ionização dos aminoácidos
Dependendo do pH do meio, os aminoácidos podem existir nas formas seguintes:
Como se deduz pelos valores de seus pKa (Tabela 2.1), em soluções muito ácidas, os dois grupos apresentamse protonados (a); em soluções muito alcalinas, ambos apresentamse desprotonados (c); e, em soluções neutras ou na forma cristalina, o aminoácido apresentase como um íon dipolar (b). A conversão entre as formas a, b e c em função do pH do meio é refletida na curva de titulação do aminoácido. Quando o aminoácido tem apenas dois grupos ionizáveis, como a alanina, a sua curva de titulação (Figura 2.3) assemelhase à composição das curvas de titulação de dois ácidos fracos com valores de pKa muito diferentes, como, por exemplo, um ácido carboxílico e uma amina primária (Seção 1.3). Esta semelhança é resultado da presença do grupo carboxila e do grupo amino na mesma molécula. As duas regiões de tamponamento observadas na curva correspondem à ionização do grupo carboxila (conversão da forma a em b) e do grupo amino (conversão de b em c), com valores de pKa de 2,35 e 9,87, respectivamente. Outros aminoácidos monoamínicos e monocarboxílicos apresentam curvas de titulação similares, apenas variando a região de pH em que se dá o tamponamento. A curva de titulação de aminoácidos com cadeias laterais ionizáveis apresenta uma terceira região de tamponamento, correspondente ao seu terceiro pKa. Isto ocorre com os aminoácidos
ácidos, básicos, cisteína e tirosina.
Os valores de pKa1 e pKa2 a serem considerados no cálculo do pI dependem do aminoácido. Para os que não contêm grupamentos ionizáveis na cadeia lateral, utilizamse os valores de pK (^) a dos grupos amino e carboxila; para aminoácidos com três grupamentos ionizáveis, usamse os valores de pK (^) a dos grupos com mesmo sinal de carga. A única exceção a esta
regra é a tirosina, que apresenta valores de pKa iguais a 2,20 (carboxila), 9,21 (amino) e 10,46 (fenólico). O grupo fenólico apresentará carga negativa em valores de pH maiores do que o pKa do grupo amino, e o ponto isoelétrico é a média entre o pKa do grupo carboxila e o do grupo amino.
Os aminoácidos não constituem tampões 䍢䀀siológicos importantes
Uma análise dos valores de pKa dos aminoácidos revela que eles não apresentam poder tamponante significativo em
pH fisiológico. Todavia, quando fazem parte de uma proteína, o valor de pKa de suas cadeias laterais e dos grupos carboxila e amino terminais da proteína (Tabela 2.1) podem sofrer variações consideráveis, em relação ao seu valor no aminoácido livre. Essas alterações resultam das características do microambiente existente na região da proteína onde o aminoácido se encontra: polaridade, determinada pela proximidade de grupamentos com carga, exclusão de moléculas de água, como ocorre no interior da molécula proteica, e possibilidade de formação de ligações de hidrogênio (Seção 2.4). Um caso importante de alteração de pKa de aminoácidos, que tem implicações decisivas para o tamponamento do sangue,
é o da hemoglobina, analisado no Capítulo 3.
Polímeros de aminoácidos: peptídios e proteínas
Os aminoácidos podem formar polímeros lineares pela ligação do grupo αcarboxila de um aminoácido com o grupo α amino de outro. Esta ligação carbononitrogênio é uma ligação amídica, chamada, no caso das proteínas, de ligação peptídica. É obtida, teoricamente, por exclusão de uma molécula de água e sua formação pode ser representada pela seguinte equação:
Esta reação, como está escrita, jamais ocorre, pois não é termodinamicamente viável. Nos seres vivos, a ligação peptídica não é feita por reação direta entre os aminoácidos, mas por um complexo aparato de síntese proteica, que inclui ribossomos, ácidos ribonucleicos, várias proteínas e enzimas. A síntese compreende uma sequência de etapas, envolvendo um expressivo gasto de ATP, que viabiliza termodinamicamente o processo. A equação é apenas um esquema didático para descrever a formação da ligação peptídica. As propriedades da ligação peptídica impõem restrições ao dobramento do polímero formado. Apesar de ser representada por um único traço de ligação, ela tem características intermediárias entre uma ligação simples e uma dupla ligação, devido à ressonância entre duas formas:
A consequência desse caráter parcial de dupla ligação é não haver possibilidade de rotação em torno da ligação peptídica. Os quatro átomos dos grupamentos que participam da ligação peptídica – C, O, N, H – ficam dispostos em um plano rígido, constituindo o que se costuma chamar de grupo peptídico ou unidade peptídica (cada retângulo na Figura 2.4 a). Todavia, existem pontos de dobramento entre as unidades peptídicas, graças à possibilidade de rotação (indicada por setas na Figura 2.4 b) em torno das ligações com o carbono α (Cα– C e Cα – Ν), que são ligações efetivamente simples.
O polímero de aminoácidos pode, então, ser visualizado como uma cadeia constituída por unidades planares, as unidades peptídicas, ligadas por uma articulação flexível — o carbono α (Figura 2.4 c). Esta cadeia chamase cadeia polipeptídica, que, graças a esse arranjo estrutural, pode dobrarse de muitas maneiras diferentes.
Figura 2.4 Cadeia polipeptídica. a) Unidade peptídica, com a ligação peptídica em vermelho. b) Rotação das unidades peptídicas em torno do carbono α. c) Segmento de uma cadeia polipeptídica, com as cadeias laterais dos aminoácidos em verde.
A cadeia polipeptídica pode conter um número variável de aminoácidos (ou, mais rigorosamente, resíduos de aminoácidos, já que, na formação de cada ligação peptídica, foi eliminada uma molécula de água). Quando o número de aminoácidos é igual a 2, o polímero é chamado de dipeptídio; com 3 é um tripeptídio e assim por diante. Polímeros contendo até 30 aminoácidos são chamados de oligopeptídios; quando o número é maior, podendo chegar a centenas ou milhares, são chamados de polipeptídios. As cadeias polipeptídicas que podem ser associadas a uma função recebem a designação de proteínas. Qualquer que seja o número de aminoácidos, os peptídios apresentam um grupamento amino livre em uma das extremidades — amino terminal — e um grupo carboxila livre na outra — carboxila terminal, além dos grupos R dos aminoácidos. Muitos peptídios encontrados na natureza desempenham funções importantes, atuando como hormônios (encefalinas, oxitocina, vasopressina, glucagon), antibióticos (gramicidina), agentes redutores (glutationa) etc. (Tabela 2.2). Peptídios sintéticos têm aplicações diversas; um exemplo é o aspartame, um adoçante artificial, com alto poder edulcorante. O aspartame é um dipeptídio modificado, formado por aspartato e fenilalanina esterificada a um grupo metila.
Tabela 2.2 Peptídios de importância biológica. Peptídios Número de aminoácidos Glândulas/células produtoras Efeitos principais Encefalinas 5 Hipó㸵䐰se anterior e medula adrenal Analgesia Oxitocina 9 Hipó㸵䐰se posterior Contração da musculatura uterina no parto e de glândulas mamárias na lactação Vasopressina 9 Hipó㸵䐰se posterior Aumento da pressão sanguínea e da reabsorção de água pelo rim
Lisina 14 6 18 Arginina 4 11 2 Histidina 2 1 3 Aspartato 8 8 3 Glutamato 5 2 8 Total 245 129 104
As proteínas são classificadas como globulares ou fibrosas, segundo sua forma. As proteínas globulares apresentam uma ou mais cadeias polipeptídicas organizadas em uma forma final aproximadamente esférica; são geralmente solúveis e desempenham funções dinâmicas. As proteínas fibrosas têm forma alongada, são geralmente insolúveis e desempenham um papel basicamente estrutural nos sistemas biológicos.
Estrutura das proteínas
A sequência de aminoácidos determina a estrutura espacial da proteína
A organização espacial 1 da proteína é resultante do tipo de aminoácidos que a compõem e de como eles estão dispostos uns em relação aos outros. A sequência dos aminoácidos irá determinar o tipo de interação possível entre as cadeias laterais, que apresentam características de carga, volume e reatividade com a água muito variáveis. A organização tridimensional de uma proteína, desde a sequência de aminoácidos, passando pelo enrolamento da cadeia polipeptídica até a associação de várias cadeias, pode ser descrita em níveis estruturais de complexidade crescente. Nesta seção, as estruturas tridimensionais descritas referemse às proteínas globulares.
A estrutura das proteínas pode ser descrita em quatro níveis
A estrutura primária é a sequência de aminoácidos da cadeia polipeptídica, determinada geneticamente e específica para cada proteína. Por convenção, a estrutura primária é escrita na direção amino terminal → carboxila terminal. Exemplificando, os peptídios AlaSerLys e LysSerAla são diferentes, porque, no primeiro caso é o grupo amino da
alanina que está livre e, no segundo caso, o da lisina^2. A estrutura secundária descreve as estruturas tridimensionais regulares, formadas por segmentos da cadeia polipeptídica. Duas organizações são particularmente estáveis: o enrolamento da cadeia ao redor de um eixo e a interação lateral de segmentos de uma cadeia polipeptídica ou de cadeias diferentes. Estas conformações são denominadas, respectivamente, αhélice e folha β pregueada. A extensão do segmento da cadeia polipeptídica que se organiza nessas duas configurações pode variar de alguns a dezenas de aminoácidos, conforme a proteína. A αhélice e a folha β pregueada estabilizamse por ligações de hidrogênio^3 entre o nitrogênio e o oxigênio dos grupos – NH e – C = O, constituintes das unidades peptídicas. Embora a ligação de hidrogênio seja uma interação fraca, o elevado número destas ligações confere grande estabilidade a essas estruturas. A αhélice é mantida por ligações de hidrogênio formadas entre uma unidade peptídica e a quarta unidade peptídica subsequente; estas ligações dispõemse paralelamente ao eixo da hélice. A αhélice tem um passo de 0,54 nm e apresenta 3,6 resíduos de aminoácidos por volta (Figura 2.5). As cadeias laterais dos aminoácidos estão projetadas para fora da hélice e, evidentemente, não participam das pontes de hidrogênio, estabelecidas unicamente entre os grupamentos das unidades peptídicas. Por esta razão, muitas sequências diferentes de aminoácidos podem adotar esta configuração e sua estabilidade independe do tipo de cadeia lateral, mas até certo ponto — certas sequências de aminoácidos não podem organizarse em αhélice. Isto ocorre, por exemplo, quando a cadeia polipeptídica contém vários aminoácidos adjacentes de mesma carga, que se repelem fortemente. Assim, polilisina em solução a pH 7 não forma αhélice, pois apresenta as cadeias laterais carregadas positivamente; em pH 12, contudo, a maioria das cadeias laterais está desprotonada e a polilisina forma α hélice espontaneamente. A prolina, quando participa da ligação peptídica, não apresenta o átomo de hidrogênio no grupo imino e, portanto, não pode formar ligação de hidrogênio — este aminoácido é geralmente encontrado entre segmentos em αhélice. A folhaβpregueada ou conformaçãoβ é uma estrutura também mantida por ligações de hidrogênio entre as unidades peptídicas. Neste caso, entretanto, as ligações são estabelecidas entre cadeias polipeptídicas diferentes ou entre segmentos distantes de uma mesma cadeia. Na folha β pregueada, as cadeias apresentam uma conformação maisdistendida que na α hélice e dispõemse lado a lado, o que atribui a essa estrutura o aspecto de uma folha de papel pregueada. As ligações de hidrogênio são perpendiculares ao eixo das cadeias, e os grupos R dos aminoácidos projetamse para cima e para baixo do
plano da folha pregueada (Figura 2.6).
Figura 2.5 Modelo da αhélice: a cadeia polipeptídica forma uma espiral, estabilizada por pontes de H entre os grupos – C = O e – NH das ligações peptídicas. As cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos dispõemse no exterior da hélice. (Adaptada de Lodish H, Berk A, Matsudaira P, Kaiser CA, Krieger M, Scott MP, Zipursky SL, Darnell J: Molecular Cell Biology, 5th ed. W. H. Freeman and Company, 2004.)
Os dois tipos principais de estruturas secundárias regulares (αhélice e folha β pregueada) ocorrem nas proteínas em proporções muito diversas. Um exemplo extremo é a mioglobina — uma proteína de músculo transportadora de oxigênio — que apresenta cerca de 80% da cadeia polipeptídica organizada em αhélice. Sua molécula é formada por oito segmentos em αhélice, separados por trechos sem estrutura regular, que permitem o dobramento da cadeia (“cotovelos”), alguns deles resultantes da presença de prolina (Figura 2.7). No outro extremo aparecem proteínas como a concanavalina A^4 , que tem alto conteúdo de folha β pregueada e não forma αhélice ( Figura 2.8). A maioria das proteínas exibe os dois tipos de estrutura secundária, como acontece com a toxina diftérica (Figura 2.9), produzida por uma bactéria que infecta o trato respiratório superior de seres humanos. Cada proteína tem um conteúdo próprio de αhélice e de folha β pregueada, determinado pela sua estrutura primária. No entanto, um exemplo dramático e excepcional de alteração da estrutura de proteínas acontece no caso do príon (do inglês prion, derivado de proteinaceous infectious particle). Tratase de uma partícula infecciosa constituída apenas de proteína — diferindo, portanto, dos agentes infecciosos conhecidos, capazes de se replicar porque contêm DNA ou RNA, como protozoários, bactérias e vírus —, responsável por encefalopatias transmissíveis em mamíferos. Alguns exemplos são: encefalopatia espongiforme bovina (doença da vaca louca), scrapie, uma moléstia semelhante que afeta ovelhas e a doença de CreutzfeldtJakob, em seres humanos. A incidência da moléstia no rebanho bovino atingiu proporções epidêmicas na Inglaterra na década de 1990, devido ao hábito de alimentar o gado com rações preparadas com carne e ossos derivados, inadvertidamente, de animais infectados. Estes animais apresentavam parte das moléculas da proteína PrP (de Prion Protein) com estrutura alterada; esta proteína, na sua forma normal, ocorre no cérebro de animais sadios e sua função ainda é desconhecida. As moléculas modificadas da proteína PrP são os príons, capazes de converter a proteína PrP normal em novos príons. As mudanças consistem em aumento do conteúdo de folha β pregueada e redução daquele de α
Figura 2.7 Modelos da mioglobina mostrando: os diversos trechos em αhélice (representados por espirais), alternados por segmentos desenrolados (a); os dobramentos da cadeia da mioglobina, onde as esferas representam o carbono α dos resíduos de aminoácidos (b). A cadeia polipeptídica ligase ao grupo heme — vermelho em (a) e preto em (b) —, descrito no Capítulo 3.
Figura 2.9 Estrutura da toxina diftérica, que apresenta segmentos em αhélice, em folha β pregueada e sem estrutura regular, organizados em três domínios, representados em cores diferentes.
Figura 2.8 Concanavalina A, uma proteína que se organiza, predominantemente, em folha β pregueada.
A estrutura terciária descreve o dobramento final da cadeia polipeptídica por interação de regiões com estrutura regular (αhélice ou folha β pregueada) ou de regiões sem estrutura definida. Neste nível de organização ( Figuras 2.7 a 2.9), segmentos distantes da estrutura primária podem se aproximar e interagir, por intermédio de ligações não covalentes entre as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos. Estas ligações são consideradas fracas (4 a 30 kJ ⋅ mol–1), quando
comparadas a ligações covalentes (200 kJ ⋅ mol–1). Como ocorre com as ligações de hidrogênio da estrutura secundária, é o grande número de ligações individualmente fracas que permite a manutenção dos dobramentos da estrutura terciária das proteínas. Estas ligações podem ser de diferentes tipos (Figura 2.10): ligações de hidrogênio, interações hidrofóbicas, ligações iônicas ou salinas e forças de van der Waals.
Ligações de hidrogênio. Estabelecidas entre grupos R de aminoácidos polares com ou sem carga. Por exemplo, serina e treonina, que apresentam grupo hidroxila, podem formar ligações de hidrogênio com asparagina ou glutamina, que apresentam grupo carbonila. As ligações de hidrogênio da estrutura terciária, naturalmente, não apresentam um padrão regular de disposição, ao contrário do que ocorre com as ligações de hidrogênio da estrutura secundária, com as quais não devem ser confundidas. Interações hidrofóbicas. Formadas entre as cadeias laterais hidrofóbicas dos aminoácidos apolares. Estas cadeias não interagem com a água e aproximamse, reduzindo a área apolar exposta ao solvente. As interações hidrofóbicas não resultam de qualquer atração entre os grupos apolares, mas são consequência da presença da molécula proteica no ambiente aquoso celular — a maioria das cadeias hidrofóbicas localizase no interior da molécula proteica. As interações hidrofóbicas são as mais importantes para a manutenção da conformação espacial das proteínas, dado o grande número (nove) de aminoácidos hidrofóbicos. Ligações iônicas ou salinas. Incluem interações de grupos com cargas opostas, como os presentes nos aminoácidos básicos (lisina, arginina e histidina) e ácidos (aspartato e glutamato). A energia de formação das ligações iônicas tem magnitude semelhante à das ligações dos grupos iônicos com a água, não contribuindo, portanto, para a conformação da molécula proteica quando estão localizados na sua superfície. Estas ligações, entretanto, têm importância fundamental para o dobramento da cadeia polipeptídica quando ocorrem no interior apolar da proteína. Todavia, esta situação não é muito frequente: a maioria dos grupos carregados de uma proteína localizase em sua superfície, estabelecendo interações íondipolo com a água, que forma uma camada organizada em volta da molécula proteica, a camada de solvatação. Forças de van der Waals. São a resultante das forças de atração e repulsão entre partes de moléculas. Inclui as forças entre dipolos permanentes e dipolos induzidos, encontrados nas cadeias laterais dos aminoácidos.
Figura 2.11 A estrutura quaternária da hemoglobina consiste na associação de duas cadeias α e duas cadeias β, cada uma associada a um grupo heme (em vermelho).
A estrutura quaternária descreve a associação de duas ou mais cadeias polipeptídicas (subunidades), para compor uma proteína funcional. A estrutura quaternária é mantida geralmente por ligações não covalentes entre as subunidades, dos mesmos tipos que mantêm a estrutura terciária. As subunidades que constituem uma proteína podem ser iguais ou diferentes. A molécula de hemoglobina, por exemplo, é formada por quatro cadeias polipeptídicas, iguais duas a duas, chamadas α e β, associadas sobretudo por interações hidrofóbicas, com contribuição menor de ligações de hidrogênio e interações eletrostáticas (Figura 2.11).
A estrutura terciária pode conter domínios e motivos
A estrutura terciária pode apresentar padrões de elementos estruturais, que se repetem em proteínas diferentes, chamados de domínios e motivos. Domínios são regiões diferenciadas da molécula proteica, com organização espacial compacta; cada domínio é um conjunto estrutural definido, formado por dobramentos da cadeia polipeptídica. Geralmente, cadeias polipeptídicas longas, com centenas de resíduos de aminoácidos, são as que se organizam em domínios. O grau de interação entre domínios pode variar desde domínios ligados por um segmento flexível da cadeia polipeptídica (Figura 2.9), até aqueles que estabelecem um contato muito íntimo, separados apenas por uma fenda estreita. Em qualquer um dos casos, os domínios podem movimentarse, uns em relação aos outros. Esta flexibilidade é fundamental para que a molécula de proteína possa ligarse eficientemente a outros compostos. Em muitas enzimas, a ligação com a molécula de substrato ocorre em fendas situadas entre domínios; estes se aproximam, encaixando o substrato na molécula da enzima (Figura 5.4, Seção 5.1). Os domínios frequentemente desempenham ações específicas; em inúmeras reações do metabolismo, o substrato ligase a um dos domínios da enzima e a coenzima a outro. Em proteínas diferentes, domínios com a mesma função têm estruturas semelhantes, o que permite prever a atividade de uma proteína desconhecida a partir do conhecimento de seus domínios. Motivos são diferentes formas de organização de elementos da estrutura secundária de proteínas globulares. Cada motivo tem um padrão de dobramento característico, que envolve interação entre segmentos da cadeia polipeptídica em α hélice e/ou folha β pregueada. Os mesmos motivos se repetem em proteínas de origens muito diferentes. Os motivos podem ser constituídos por arranjos de αhélices, folhas β pregueadas ou por combinações das duas. Numerosos receptores da superfície celular, por exemplo, são compostos por sete αhélices que atravessam a membrana plasmática (Figura 2.12); são responsáveis por receber os sinais que iniciam o processo de transdução, envolvido em fenômenos tão diversos quanto a visão, o paladar, o olfato e a atividade hormonal (Seção 19.3). Outro motivo complexo, chamado β barril, resulta da associação de numerosos segmentos em folha β pregueada. É encontrado na família das porinas (Figura 2.13), que formam canais na membrana externa de bactérias gramnegativas e de mitocôndrias, destinados ao transporte de íons e moléculas pequenas, como nucleosídios ou açúcares.
Figura 2.12 Estrutura de um receptor com sete segmentos em αhélice (numeradas de 1 a 7), que atravessam a membrana plasmática. a) Representação esquemática. b) Estrutura tridimensional do receptor adrenérgico β 2.
Figura 2.13 Estrutura de uma porina mitocondrial, o canal iônico voltagemdependente mVDAC1, contendo um motivo em β barril (em azul) e uma hélice na extremidade amino terminal (em vermelho). Vista lateral (a) e superior (b) da proteína na representação em fitas; no centro, vista superior da representação de volumes atômicos (c).
Proteínas 䍢䀀brosas
As proteínas fibrosas têm forma alongada e, diferentemente das globulares, são formadas pela associação de módulos repetitivos, possibilitando a construção de grandes estruturas. O componente fundamental das proteínas fibrosas são cadeias polipeptídicas muito longas com estrutura secundária regular: αhélice nas αqueratinas, folha β pregueada nas β queratinas e uma hélice característica no colágeno. Nas αqueratinas , duas ou três cadeias em αhélice associamse lateralmente, formando longos cabos helicoidais, que, reunidos, formam fibrilas e fibras. As αqueratinas são o componente principal da pele dos vertebrados e de estruturas relacionadas, como cabelo, lã, chifres, unhas, cascos, bicos e penas. Nestas proteínas, são frequentes as pontes dissulfeto entre resíduos de cisteína de cadeias polipeptídicas ou fibrilas adjacentes, conferindo grande resistência às fibras. O padrão de distribuição dessas pontes determina o grau de ondulação do cabelo e da lã. Os tratamentos estéticos, visando tornar o cabelo mais liso ou mais crespo, utilizam o mesmo procedimento, embora pretendam resultados opostos: desfazer as pontes dissulfeto por tratamento com agentes redutores e refazêlas em novas posições por tratamento com agentes oxidantes, depois de posicionar os fios de cabelo na conformação desejada. A tropomiosina, uma proteína componente das miofibrilas também é formada por associação de cadeias polipeptídicas em αhélice. Nas β queratinas , as fibras são formadas por empilhamento de folhas β pregueadas, como acontece na fibroína da seda e das teias de aranha. No caso do colágeno, as cadeias polipeptídicas apresentam uma conformação helicoidal típica, derivada da sua composição peculiar em aminoácidos — alto conteúdo de glicina, prolina e de hidroxiprolina, um aminoácido derivado de prolina — e da grande regularidade na estrutura primária, sendo frequente a sequência glicinaprolinahidroxiprolina. Estas características, diferentes da maioria das proteínas, permitem a associação íntima de três cadeias formando uma hélice tripla, o tropocolágeno, módulo estrutural básico do colágeno. As moléculas de tropocolágeno associamse, formando as fibrilas de colágeno, que são estabilizadas por ligações covalentes entre as cadeias componentes do tropocolágeno e entre moléculas de tropocolágeno adjacentes (Figura 2.14). O colágeno é a proteína mais abundante dos vertebrados. Suas fibras são responsáveis pelas funções mecânicas e de sustentação do tecido conjuntivo, que se distribui por cartilagens, tendões, matriz óssea, córnea etc.; mantém, ainda, a estrutura e a elasticidade do sistema vascular e de todos os órgãos. O número de ligações covalentes do colágeno varia conforme o tecido e aumenta com a idade do animal (o que explica a maior rigidez da carne de animais mais velhos). A estrutura do colágeno é rompida por aquecimento, originando uma proteína desenrolada, mais solúvel, a gelatina. Este é o princípio da fabricação industrial desta proteína, muito frequente na dieta humana. O baixo valor nutricional da gelatina está analisado no Capítulo 18.
covalentemente ligados das lipoproteínas plasmáticas. As primeiras são proteínas conjugadas no sentido estrito, como as lipoproteínas da parede celular de certas bactérias que contêm moléculas de ácidos graxos unidos por ligações covalentes. As lipoproteínas plasmáticas (Seção 6.2.7), por sua vez, são partículas formadas por inúmeras moléculas de lipídios e algumas poucas moléculas de proteína, associadas por ligações não covalentes. Estas partículas atuam no transporte de lipídios pelo sangue (Seção 20.8).
Carga elétrica e solubilidade das proteínas
O valor do pI de uma proteína re䍫ꀀete a sua composição em aminoácidos
A carga elétrica total de uma proteína é o somatório das cargas presentes nas cadeias laterais dos aminoácidos e nos grupos amino e carboxila terminais. Para cada proteína existe um determinado valor de pH — ponto isoelétrico (pI) — no qual a molécula é eletricamente neutra. Neste pH, o número de cargas positivas (grupos básicos protonados) equivale ao número de cargas negativas (grupos ácidos desprotonados). O pI de proteínas, diferentemente do pI dos aminoácidos, não pode ser calculado, de modo simples, a partir dos valores de pKa dos aminoácidos componentes, devido ao seu grande número e, principalmente, porque o valor de pKa dos aminoácidos varia conforme a sua localização na estrutura da proteína (Tabela 2.1). Programas de computador sofisticados permitem grande aproximação no cálculo do ponto isoelétrico de proteínas. O pI das proteínas é de fácil determinação experimental: é o valor de pH no qual elas não migram, quando submetidas a um campo elétrico (Seção 2.10.2). As proteínas exibem valores de pI que refletem a proporção entre aminoácidos ácidos e básicos em sua composição (Tabela 2.5). Para a pepsina, por exemplo, que tem muito mais aminoácidos ácidos (28%), que aminoácidos básicos (2%), a equivalência de cargas é obtida quando a grande maioria das carboxilas dos aminoácidos ácidos está protonada (sem carga) e apenas uma pequena fração desprotonada (com carga negativa), compensando a carga positiva dos aminoácidos básicos. Esta situação é encontrada em um pH muito baixo: o pI da pepsina é igual a 1. No caso do citocromo c, cuja porcentagem de aminoácidos básicos é aproximadamente o dobro daquela de aminoácidos ácidos, o pI é o pH em que cerca da metade dos aminoácidos básicos estão desprotonados, ou seja, um pH alto: o pI do citocromo c é igual a 10,6. Proteínas com pI maior que 7 são chamadas proteínas básicas e aquelas com pI menor que 7, proteínas ácidas. As histonas são proteínas básicas, e no pH celular apresentamse com carga positiva, o que permite sua ligação ao DNA na formação dos cromossomos. O abaixamento de pH resulta sempre em aumento da carga positiva da proteína, por ganho efetivo de carga positiva (protonação de grupamentos básicos) ou perda de carga negativa (protonação de grupamentos ácidos); portanto, em pH menor do que o pI, a proteína apresenta uma carga líquida positiva, tanto maior quanto mais afastado do pI for o pH. Por um raciocínio análogo, concluise que, acima do pI, a proteína apresenta carga negativa porque grupos ácidos desprotonados adquirem carga negativa e grupos básicos desprotonados perdem carga positiva.
Tabela 2.5 Ponto isoelétrico (pI) de algumas proteínas e sua composição em aminoácidos ácidos e básicos. Aminoácidos (%) Ácidos Básicos (^) Ácidos pI Asp Glu Arg His Lys Básicos Pepsina 1,0 16,6 11,3 1,0 0,5 0,4 15 Albumina 4,8 10,4 17,4 6,2 3,5 12,3 1, Mioglobina 7,0 4,7 8,3 1,9 7,5 12,8 0, Citocromo c 10,6 3,6 5,9 2,2 2,5 15,2 0,
A solubilidade das proteínas é in䍫ꀀuenciada pela composição do meio aquoso
A solubilidade das proteínas é determinada, fundamentalmente, pela estrutura primária, que define a relação espacial entre os aminoácidos na estrutura tridimensional e sua interação com a água. Por outro lado, características do meio, tais como o pH, a concentração de sais e a constante dielétrica do solvente, interferem na solubilidade. A variação da carga líquida de uma proteína tem implicações na sua solubilidade. No pI a solubilidade é menor do que em outros valores de pH, nos quais as moléculas têm todas a mesma carga e se repelem eletrostaticamente, estabilizandose em solução ( Figura 2.15).
As proteínas apresentam também alteração da solubilidade em função da concentração de sais. Proteínas globulares pouco solúveis em água tornamse cada vez mais solúveis à medida que aumenta a concentração de sal da solução ( Figura 2.15), até certa concentração limitante, que depende da proteína e do tipo de sal escolhido (trecho ascendente da curva da Figura 2.16). Este fenômeno é chamado “salting in”. Acreditase que os íons adicionais (positivos e negativos), presentes em solução, interagem com os grupos carregados das moléculas de proteína, atenuando a interação entre elas. Deste modo, o efeito eletrostático de íons em soluções salinas diluídas é um fator adicional para o aumento da solubilidade das proteínas, além da sua camada de solvatação^5. Por outro lado, quando a concentração de sal atinge valores muito elevados, a solubilidade das proteínas diminui (trecho descendente da curva da Figura 2.16), até sua precipitação. Este efeito, chamado “salting out”, ocorre com sais di ou trivalentes, que competem com a proteína por moléculas de água para solvatação. Em altas concentrações desses sais, ocorre uma desorganização da camada de solvatação da proteína: há tantos íons solvatados que a quantidade de água disponível tornase insuficiente para dissolver todos os solutos. As interações proteínaproteína tornamse mais fortes que as interações proteínasolvente, a proteína sofre agregação e precipita. Como cada proteína precipita em uma concentração salina característica (que depende da extensão da sua camada de solvatação), o salting out pode ser empregado para separar proteínas. De fato, esta técnica costuma ser a etapa inicial de processos de purificação de proteínas. O sal mais utilizado é o sulfato de amônio — (NH 4 ) 2 SO 4 — devido à sua alta solubilidade, que permite obter soluções muito concentradas; além disso, este sal, por razões desconhecidas, estabiliza a estrutura nativa das proteínas, possibilitando que elas precipitem sem sofrer desnaturação.
Figura 2.15 Solubilidade de uma proteína globular em função do pH, em duas concentrações de NaCl. Está assinalado o pH correspondente ao pI da proteína.
