Guia para Professores: Introdução à Interferência de RNA, Manuais, Projetos, Pesquisas de Tradução

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RNA de interferência para

professores de ensino básico

Claudio Sérgio Estevam

Victor Fernandes de Oliveira

Leandro Marcio Moreira

Prefácio

Talvez uma ampla parcela da sociedade não saiba, mas inúmeras descobertas fascinantes florescem nos laboratórios de pesquisa de todo o mundo continuamente. Experimentos visando a construção de uma nova geração de motores e combustíveis, materiais com novas e inesperadas propriedades, medicamentos inteligentes e nanorobôs multifuncionais. Todos esses dados e informações têm um imenso potencial de transformar a nossa sociedade. E mais: a ciência pode também encantar os olhos de uma criança, despertar a curiosidade de um adolescente e renovar a mente de um adulto. Para que todo este mundo novo chegue aos estudantes de maneira clara e tecnicamente precisa duas peças são fundamentais: o professor e uma fonte confiável e acessível de informações. E foi pensando em tudo isto que o trio de autores concebeu esta obra magnífica: RNAi para professores de ensino básico. Cientes de que a comunicação científica é um grande desafio, os autores elaboraram um texto leve, agradável e repleto de elementos que atraem os olhos e instigam nossos pensamentos. Assim, eles conduzem o leitor por um novo e maravilhoso universo: o da manipulação genética por meio de moléculas de RNA. Mas como isso é possível? Não é o DNA o coordenador de todas as coisas na célula? Como o RNA poderia controlar outros genes? Quais são as aplicações médicas e tecnológicas dos RNAs de interferência? Você já deve ter percebido que nas próximas páginas adentraremos em um mar de novas e curiosas informações derivadas das pesquisas mais recentes. Esperamos que você se encante pelo tema e que, com toda sua paixão, retransmita para seus alunos! Lembre-se: uma nova geração de potenciais cientistas está bem diante de você, em sua sala de aula!

Tiago Campos Pereira Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto Universidade de São Paulo

Lista de abreviaturas

AIDS: Síndrome da imunodeficiência adquirida DMRI: Doença macular degenerativa relacionada à idade DNA: Ácido desoxirribonucleico dsRNA: RNA de dupla fita EAV: Vírus da artrite viral em equinos HCV: Vírus da hepatite C HIV: Vírus da imunodeficiência humana mRNA: RNA mensageiro miRNA: microRNA RISC: Complexo de silenciamento induzido por RNA RNA: Ácido ribonucleico RNAi: RNA de interferência rRNA: RNA ribossômico RSV: Vírus sincicial respiratório siRNA: Pequeno RNA de interferência snRNA: Pequeno RNA nuclear shRNA: Pequeno RNA em formato de grampo tRNA: RNA transportador WSSV: Vírus da síndrome da mancha branca

De professores para professores

Caros professores, a motivação para a construção desta apostila teve origem na percepção das dificuldades enfrentadas por professores e alunos no processo de ensino e aprendizagem de conteúdos de genética envolvendo questões biotecnológicas. Estudos científicos revelam que os conteúdos da genética e biologia molecular são classificados como abstratos e de difícil assimilação, e isto é confirmado por nós professores, em nossa prática diária. Estes conteúdos complexos necessitam da utilização de metodologias alternativas, que comtemplem as necessidades dos professores e alunos durante o processo de interação que envolve o ensino e aprendizagem. Durante experiências em sala de aula e mesmo na academia, já nos deparamos com a seguinte pergunta: por que devemos estudar esta matéria ou conteúdo? Foi assim que percebemos que os profissionais do ensino precisam de uma literatura diferenciada que os possibilitem elucidar a ligação da genética e biologia molecular com o contexto de seus alunos ou, quando impossível, que pelo menos os aproxime de outras ferramentas de apoio pedagógico. Os avanços obtidos em tão pouco tempo de pesquisa são impressionantes, e mesmo que haja alguma transposição do conhecimento científico para a sala de aula, ainda assim é impossível acompanhar tal evolução apenas mediante uso dos livros didáticos. Assim, nossa intenção é colaborar com a introdução de novas informações de uma maneira diferenciada, além de tentar sanar algumas dúvidas que sentimos em nosso dia-a-dia dentro de uma sala de aula. Estamos certos que as dúvidas surgem não por falta de empenho, mas por estarmos inseridos em uma área do conhecimento permeada por um intenso volume de novas informações. Portanto, ao encontro das necessidades do ensino, propusemos realizar uma transposição didática do conhecimento científico e ao final desta leitura esperamos que você, professor, possa ser motivado a continuar estudando e tenha em mãos um facilitador para auxiliá-lo durante a construção do conhecimento com seu aluno. Ótima leitura, e que o conhecimento sobre o RNA de interferência (RNAi) aproxime você de seus alunos e que possa esclarecer o quão belo e intrincado é o mecanismo genético molecular que nos mantém vivos.

Como trabalhar com seus alunos usando este recurso

Para facilitar a discussão ou apresentação dos dados desenvolvemos um personagem que apresentará as informações aos estudantes de forma interativa. Este nosso personagem foi inspirado em um nematódeo de aproximadamente um milímetro de comprimento, não segmentado e com simetria bilateral. Seu nome científico é Caenorhabditis elegans (Figura 1). Por ser um organismo de fácil criação, vida livre, ciclo de vida curto, genoma conhecido e caracterizado como um excelente organismo modelo em estudos nas áreas de citologia, genética, bioquímica e biologia molecular. Motivo que o levou a ser extremamente usado em pesquisas científicas.

Figura 2: Personagem C. elegante com expressões variadas. Cada uma destas expressões será usada ao longo do texto para caracterizar um determinado contexto da informação apresentada.

Por que desenvolvemos esta obra e como ela está estruturada?

Com este livro tentamos criar uma ferramenta de apoio pedagógico que possa dar suporte ao professor na realização da transposição do conhecimento científico. Conhecimento este que embora esteja longe de ser incluso nos livros didáticos, permite ao professor trabalhar os assuntos envolvendo questões biomoleculares de maneira mais elaborada e numa perspectiva mais dinâmica sobre os conhecimentos associados a controle de expressão gênica e proteica. A proposta é que esta obra sirva de aporte a um trabalho de difusão do conhecimento biológico trazendo à tona discussões sobre temas atuais da biologia molecular, imprescindível para o aprendizado de biologia do século XXI para alunos do ensino médio. Em um primeiro momento você terá em suas mãos uma breve revisão de alguns mecanismos biológicos trazidos por meio de ilustrações e pela utilização de uma linguagem que busca facilitar o entendimento do leitor. Fique a vontade

para utilizar estas ilustrações durante a exemplificação de questões classificadas como abstratas. No decorrer da leitura você irá se deparar com o personagem que trará algumas informações e ou mensagens de incentivo para instigar o conhecimento do leitor. Da mesma forma, poderá indicar algumas leituras complementares que facilitarão o processo de mediação do conhecimento científico, por conferir certa ludicidade, necessária ao processo de ensino. Em seguida trataremos uma perspectiva sobre os diferentes tipos de RNAs conhecidos, e um pouco do histórico da descoberta do RNAi e contextualizando algumas possibilidades de sua aplicação. No tópico RNAi na prática você poderá utilizar os textos que produzimos para ilustrar algumas situações práticas no emprego da técnica de RNAi e aproveitar para estabelecer conexões com alguns conceitos da genética. Estes textos foram produzidos tendo como base publicações científicas em diferentes áreas do conhecimento. Ao final destes textos indicamos o artigo em que nos baseamos para a sua construção, a fim de promover uma aproximação entre a construção e divulgação do conhecimento científico. Pelo fato de algumas palavras ou terminologias presentes nesta obra podem ser desconhecidas ou gerar certas dúvidas, resolvermos incluir um glossário contendo expressões e terminologias que consideramos importantes, destacadas em negrito no corpo do texto. Finalmente, caso tenha dúvida sobre alguma abreviatura, não deixe de consultar a lista de abreviaturas para dinamizar sua leitura. Está preparado, então vamos juntos invadir o mundo do RNAi!!!

Figura 4: Representação da dupla fita de DNA contendo as bases nitrogenadas púricas e pirimídicas que devidamente ligadas ao grupo fosfato e ao açucar dão origem a uma estrutura helicoidal.

É importante destacar que, apesar dos RNAs serem sintetizados em fita simples, no caso dos conhecidos RNAs ribossomais e RNAs transportadores, estas fitas simples podem estar conformacionadas de modo a sofrerem um auto-pareamento de bases estabelecendo a configuração de alças (evidente nos tRNAs), ou mesmo estabelecerem ligações com proteínas (evidentes no rRNA), com demonstram as figuras 5A e 5B.

Figura 5. Conformação estrutural dos RNAs transportador (A) e ribossomal (B), demonstando o pareamento das bases em mesma fita ou associado a proteínas. Adaptado de Petrov AS, Bernier CR, Gulen B, Waterbury CC, Hershkovits E, Hsiao C, et al. (2014) Secondary Structures of rRNAs from All Three Domains of Life. PLoS ONE 9(2): e

O DNA tem a capacidade de sofrer replicação. Este processo é de fundamental importância e acontece no momento em que uma célula necessita se duplicar (mitose) dando origem a células filhas que recebem uma cópia exata do DNA presente na célula de origem. Processo este conhecido como replicação semi- conservativa. Aconselhamos aqui uma leitura e visualização dos experimentos e resultados obtidos por Matthew Meselson e Franklin Stahl que evidenciou este processo. É durante a replicação que as características hereditárias são passadas de gerações a gerações, incluindo possíveis mutações que possam ocorrer. Estas características genéticas tão retratadas na biologia como decorrentes de dois processos dependentes e seriados, a transcrição e a tradução. Todas as proteínas fundamentais aos organismos eucariontes e procariontes advém destes processos, e qualquer alteração nas suas produções podem levar a danos celulares que podem culminar na morte dos indivíduos, daí a importância de serem altamente eficientes e finamente regulados. É importante destacar que no caso de organismos eucariontes a transcrição ocorre ainda no núcleo enquanto o processo de síntese proteica pode acontecer ou no citoplasma ou no retículo endoplasmático rugoso, enquanto em procarioto

O código genético e sua degeneração: um conceito elementar

Mesmo com a ação de enzimas reparadoras, existe a possibilidade de erros aconteçam durante a replicação do DNA possibilitando que as novas gerações carreguem estas modificações. Estas trocas, inserções ou deleções de nucleotídeos, únicos ou em bloco, que ocorrem na fita do DNA são classificados como mutações. Para facilitar a descrição do código genético degenerado,vamos aqui nos ater às trocas de nucleotídeos simples, daqui por diante compreendidas como SNPs, ou polimorfismos de um único nucleotídeo (do inglês single-nucleotide polymorphism ). Existem diferentes combinações de trinucleoítdeos (códons) que codificam um mesmo aminoácido, isto faz com que o código genético seja considerado degenerado. Pois é! Só para codificar o aminoácido serina, por exemplo, existem seis diferentes códons (Figura 7). Esta característica depõe a favor do código genético, pois existe a possibilidade de que ocorram SNPs sem alteração do aminoácido codificado pela trinca. Assim, quando o SNP não muda a composição do aminoácido correspondente, denominamos isso de mutação sinônima, e quando muda não sinônima. A ambiguidade também é uma característica do código genético, nela cada códon corresponde a apenas um aminoácido, mas, um aminoácido pode corresponder a mais de um códon.

Figura 7: Código genético em modelo circular. De dentro para fora os círculos representam respectivamente: 1ª base do códon, 2ª base do códon, 3ª base do códon, abreviatura do nome do aminoácido com três e com uma letra respectivamente. A classificação dos aminoácidos quanto a seu perfil químico se encontra disposta por cores como explicitado em legenda apropriada.

Você pode acessar esta ferramenta e conhecer suas funcionalidades pelo link: http://biomodel.uah.es/biomodel-misc/codgen/inicio.htm

Figura 8: Diagramas simulando a identificação do códon digitado no mapa circular, bem como a estrutura da cadeia lateral do resíduo de aminoácido correspondente ao códon selecionado.

Amigo professor, para trabalhar conteúdos relacionados a síntese proteica indicamos a você uma estratégia diferenciada e bem legal. Entendo que vai facilitar a compreensão de seu aluno quanto a importância do código genético na formação de uma proteína (Figura 8).

Na ferramenta os alunos poderão digitar a sequência correspondente a um códon desejado e a partir dois eventos concomitantes acontecem:

a) Um ponteiro sinaliza o códon e o respectivo aminoácido correspondente na figura do código genético circular.

B) A estrutura do aminoácido é inserida na cadeia polipeptídica dando ênfase à cadeia lateral do respectivo aminoácido selecionado correspondente.

Figura 9: Analogia representando a diferenciação de celular promovida pela expressão gênica diferencial dada por diferentes estímulos em tempos diferentes resultando em estruturas celulares diversificadas.

Imagine que dois cromossomos de um indivíduo 2N (A e B), possuem 12 genes cada em sua estrutura (cada uma das barras verticais ou horizontais na estrutura que faz analogia aos cromossomos). Durante a diferenciação celular um conjunto destes 24 genes é ativado de forma a originar uma célula muscular, outro para a formação de células sanguíneas e outro na formação de células nervosas. Note, no entanto, que alguns genes são expressos nas células de maneira continua (vermelho), enquanto outros são apenas expressos nos respectivos tecidos individualizados (verde, roxo e azul). Na maioria das vezes estes genes rotineiramente expressos estão intimamente ligados a viabilidade das células no que diz respeito à manutenção das suas funções essenciais. Estes genes são classificados como genes constitutivos, pois, estão relacionados a processos fundamentais como geração de energia e manutenção do material genético. Em contrapartida, os genes diferencialmente expressos são aqueles que possuem sua expressão reprimida ou ativada por diversos fatores, e que resultam numa característica única da célula ou tecido em questão.

A expressão de um gene pode ser confirmada por meio da presença do polipeptídio por ele codificado na célula. Em outras palavras, um gene presente no núcleo da célula pode ter sua ativação confirmada ou não por meio da presença de seu produto final no citoplasma desta célula. Desta forma para que um gene tenha sua expressão garantida culminando na síntese de sua respectiva proteína deve obedecer fluxo de cinco etapas: transcrição, processamento do transcrito, transporte para o citoplasma, tradução, endereçamento e ativação do polipeptídio por ele formado (Figura 9).

Figura 9: Esquema representativo das etapas de regulação da expressão gênica.

São justamente estas cinco etapas as possibilidades de regulação da expressão gênica. Assim, a intervenção em uma ou mais etapas deste processo pode culminar no silenciamento gênico. Agora que você sabe que podemos regular a expressão de um gene em cinco possíveis etapas e que qualquer uma destas etapas quando bloqueadas culmina no silenciamento gênico, vamos então aprofundar o assunto e conhecer outros tipos de RNAs que estão diretamente associados com eventos de silenciamento de genes.

Agora que você sabe que outros três tipos de RNAs existem (snRNA, miRNA e siRNA) além de outros três classicamente estudados, vamos compreender o que é o RNA de interferência.

RNA de interferência: um incrível mecanismo de regulação da

síntese proteica

Nos processos de transcrição e tradução, existem algumas moléculas que estão relacionadas com o resultado final da síntese proteica, além do mRNA, rRNA e tRNA, entre elas os denominados micro RNAs (miRNAs) e os pequenos RNAs de interferência (siRNAs) (vide quadro 1). As células podem utilizar miRNAs ou siRNAs para realizarem o silenciamento de genes com ação indesejada em um determinado momento fisiológico. Estas pequenas moléculas são capazes de inativar o mRNA necessário para a tradução de proteínas específicas. Este mecanismo de silenciamento gênico é conhecido como RNAi, ou interferência de RNA mediada por RNAi. O RNAi é mediador de uma espécie de manutenção do genoma por meio do silenciamento de genes prejudiciais ou provenientes de infecções virais e ocorre de forma natural nas células. Em outras palavras, ao longo da evolução as células desenvolveram um mecanismo eficiente para se defender de invasores, os RNAi. O início desta descoberta começou nos anos de 1990, quando pesquisadores foram surpreendidos ao tentarem acentuar a cor de petúnias, cujas pétalas são violetas (Figura 10).

Figura 10: Representação da variação de diversos fenótipos de uma mesma planta, induzido por interferência de RNA.

No estudo em questão foram introduzidas cópias adicionais do gene que codificava para uma enzima envolvida na indução de cor violeta das flores, na tentativa de fazê-las terem o tom violeta ainda mais evidenciado em suas pétalas. No entanto, e de forma inesperada, com a adição de mais cópias do gene em questão os pesquisadores obtiveram um bloqueio parcial ou total da via de produção da enzima relacionada com a síntese da cor violeta. Assim, ao invés de aumentar a síntese do pigmento, descobriram que haviam desligado (por um mecanismo até então desconhecido) o gene que expressava o fenótipo de interesse. Este é um ótimo exemplo de que em ciência não existe resultado certo ou errado, existe sim resultados esperados e não esperados. Note que

este resultado não esperado deu início a uma das descobertas mais fascinantes da biologia molecular. Imagine como esta técnica poderia revolucionar o comércio de plantas ornamentais. Através da técnica de RNAi poderiam, por exemplo, serem criados diversos fenótipos de uma mesma planta. Embora intrigante, nesta época o fenômeno do RNAi ainda não havia sido elucidado, mas o experimento já possibilitava o vislumbre de um mar de expectativas no campo da genética. Após várias pesquisas e experimentos o mecanismo de interferência de RNA foi revelado, ganhou impulso e passou a ser compreendido de melhor forma, por meio de estudos que utilizaram C. elegans dentre outros organismos modelos. Com estes estudos foi possível compreender a função de um gene específico deste nematódeo. Os pesquisadores utilizaram uma metodologia que permitiu o silenciamento de determinado gene pela introdução de moléculas de RNA de fita simples. Com os avanços das pesquisas surgiram diversas hipóteses para explicar o silenciamento de genes ocasionados pela introdução de RNA. Para se explicar tal fato, pensou-se em moléculas de RNA aberrantes e em moléculas de dsRNA, esta última hipótese foi comprovada em um trabalho que também utilizou o C. elegans como modelo. Andrew Fire e Craig Mello trabalharam a potente e específica interferência genética por RNA de cadeia dupla em C. elegans. Por meio da introdução experimental de moléculas de RNA, os pesquisadores investigaram a entrega e aspectos estruturais da molécula de RNA que interferiam em genes endógenos do organismo em questão, a fim de manipular sua expressão gênica. Neste trabalho descrevem as moléculas de dsRNA como mais eficientes no processo de interferência em relação a introdução de moléculas RNA de cadeia simples. Em outro estudo Fire e Parrish analisaram a clivagem de moléculas de dsRNA para produzir uma população inicial de siRNA em C. elegans mutante para rde- 1 e rde-4, dois genes que não são necessários para a viabilidade do organismo ou para sua fertilidade. Porém desta vez os pesquisadores utilizaram molécula dsRNA para interferirem na expressão de um gene específico. Percebeu-se uma diminuição dos transcritos do gene alvo como resultado da introdução de moléculas de dsRNA homólogas ao gene de interesse. O estudo foi além e possibilitou observar que a injeção dsRNA não era efetiva quando direcionada a região promotora ou a íntrons, fato que permite associar a necessidade de transcrição da sequência alvo para que haja silenciamento do gene de interesse. A descoberta do RNAi revolucionou a maneira que os pesquisadores encaravam o funcionamento da célula. Além de conceder o prêmio Nobel em medicina e fisiologia aos pesquisadores Andrew Fire e Craig Mello, a técnica foi considerada uma provável alternativa na luta contra as mais variadas doenças, estimulando mercado farmacêutico (figura 12).