Baixe Resumo Completo de Bioquímica Molecular: DNA, RNA, Replicação e Extração e outras Resumos em PDF para Bioquímica, somente na Docsity!
ESTRUTURA DO Características do Material Genético Hesmo antes de sua identificação, biólogos reconheciam quatro caracteristicas essenciais do material genético Armazenamento de Informação Complexa: Replicação Confiável: Deve ser copiado Deve conter instruções para traços e funções com exatidão para transmissão às células de um organismo. descendentes e prole. Codificação do Fenótipo: O genótipo Capacidade de Variação: Deve permitir (material genético) deve ser expresso variação genética entre espécies e indivíduos. para formar o fenótipo (traços), geralmente via RNA e proteinas. Estrutura do DNA Estrutura Primária: Uma cadeia de nucleotídios unidos por Ligações fosfodiéster Cadeia Polinucleotídica: é N Bases Nitrogenadas: Purinas (anel duplo: Nucleotídios são Ligados por , adenina e guanina) e Pirimidinas (anel ligações fosfodiéster entre o grupo HN N simples: citosina, timina - exclusiva do 5 fosfato de um nucleotídio e o á DNA, e uracila - exclusiva do RNA). A base grupo 3 -hidroxila do seguinte. A E Sd CH; (O liga-se ao carbono 1 do açúcar e o fosfato cadeia possui polaridade, com uma Fo) H H/7 ao carbono 5. extremidade 5 (fosfato Livre) e HN H uma extremidade 3 (hidroxila OH H livre). 5 -monofosfato de desoxiguanosina dGME Nucleotídio: Composto por um açúcar pentose (desoxirribose no DNA, ribose no RNA), um grupo fosfato e uma base nitrogenada. A desoxirribose do DNA possui um átomo de hidrogênio no carbono 2, enquanto a ribose do RNA possui um grupo hidroxila (-OH), tornando o RNA menos estável quimicamente. Estruturas Especiais no DNA e RNA Formam-se em fitas únicas de DNA ou RNA Uma fita única de DNA pareia com uma quando sequências invertidas complementares região de DNA dupla-fita, formando uma na mesma fita pareiam, criando uma haste estrutura de três fitas. Ocorre em Longas (região de bases pareadas) e, frequentemente, sequências de purinas ou pirimidinas. O uma alça (bases não pareadas). São importantes H-DNA pode degradar -se mais facilmente, para a função de muitas moléculas de RNA. Levando a maiores taxas de mutação 5 GTCTTCCCTCTTCCCCC | 3 CAGAAGGGAGAAGGGGG Esta Alça TTECCECTeTTECecc r É LS —Haste si DNA triplo Envolve quatro fitas de DNA Modificação do DNA: metilação do DNA é a adição de grupos metila (-CH3) a bases nitrogenadas por enzimas específicas Em bactérias Em eucariotos O DNA é metilado para distingui-lo de DNA A metilação da citosina (formando 5-metilcitosina) estranho (não metilado, como o de vírus), que pode está frequentemente relacionada à regulação da ser clivado por enzimas de restrição expressão gênica; sequências metiladas geralmente têm baixos níveis de transcrição. A extensão da metilação da citosina varia: cerca de 5% em células N H animais, ausente em leveduras, e mais de 50% em algumas plantas. Dq | No Grupo metila (0) N H 5-Metilcitosina Identificação do DNA como Material Genético A jornada para identificar o DNA Levou mais de 100 anos 1868 século XIX 1940-1950 1928 4944 1952 Descoberta da Estrutura Tridimensional do PNA por Watson e Crick (1953) Utilizando dados de difração por raios X de Rosalind Franklin e Maurice Wilkins, e aplicando conhecimentos de química estrutural, James Watson e Francis Crick construíram modelos moleculares. A chave foi a descoberta do pareamento específico das bases: A com T, e G com C, o que explicava as regras de Chargaff. Seu modelo revelou uma dupla-hélice com duas cadeias de nucleotídios antiparalelas, açúcares e fosfatos no exterior e bases no interior, oferecendo um mecanismo para a replicação do DNA. RNA como Material Genético Em alguns vírus, o RNA, e não o DNA, é o material genético FUNDAMENTOS DA Etapas e Reagentes na Extração de Ácidos Nucleicos Remoção de Proteínas e Outros Contaminantes: Após a Lise, o Lisado contém ácidos nucleicos, proteínas, Lipídios, carboidratos e outros metabólitos ad | +, Remota ot a oo calada Clorofórmio: Aumenta a eficiência da Álcool Isoamílico: Reduz a Fanulelone Pero essa efe ne! desnaturação de proteínas e ajuda a remover Lipídios. Também aumenta a densidade da fase orgânica, facilitando a separação das fases. formação de espuma durante a para a interfase entre a fase aquosa mistura das fases. (contendo ácidos nucleicos) e a fase orgânica. O fenol deve ser tamponado com Tris (pH 8,0 para DNA; pH =4,5-5,3 para RNA, pois em pH ácido o DNA é desnaturado e retido na fase orgânica/interfase). Precipitação Salina ("Salting Out"): Colunas de Sílica (Extração em Sais Caotrópicos: Além de Altas concentrações de sais (ex: Fase Sólida): Lisar células e desnaturar Acetato de Potássio, Cloreto de Baseia-se na capacidade dos proteínas, promovem a Sódio) diminuem a solubilidade das acid leicos d T Licacão do ácid leico à cet [ESSO É a ácidos nucleicos de se Ligarem igação do ácido nucleico à Pro aa , preciprtação. reversivelmente a uma sílica, desidratando o fosfato Os ácidos nucleicos permanecem em a V. . - membrana de sílica na presença do esqueleto do ácido nucleico solução e podem ser separados por . . non . . js de altas concentrações de sais e expondo-o para adsorção à centrifugação. Este método é menos caotrópicos (ex: Guanidina, membrana tóxico que a extração com feno Isotiocianato de Guanidina) FUNDAMENTOS DA Etapas e Reagentes na Extração de Ácidos Nucleicos Precipitação dos Ácidos Nucleicos Esta etapa concentra os ácidos nucleicos a partir da solução aquosa obtida após a remoção de contaminantes. ad | =, Etanol (E+OH): Usado em y ] Isopropanol: Usado em Acetato de Sódio (NaOAc), Acetato de concentrações finais de 30-100% concentrações finais de —0,6-1 Amônio ((NH4)20Ac), Cloreto de Sódio (geralmente 2-2,5 volumes de volume. É mais eficaz para precipitar (NaCl) ou Cloreto de Lítio (LiCL): etanol absoluto gelado). O etanol estdas meados em volimos Fornecem cátions (ex:Na+) que reduz a constante dielétrica da solução e desidrata os ácidos nucleicos, tornando-os menos neutralizam as cargas negativas dos grupos fosfato no esqueleto do ácido nucleico, reduzindo sua solubilidade em menores, pois requer um volume menor gue o etanol. No entanto, pode , coprecipitar mais sais , = a solúveis e promovendo sua álcool e facilitando a precipitação precipitação na presença de cátions Após a adição do álcool e do sal, a solução é geralmente incubada em baixas temperaturas (ex: -20'C ou -80'C) para maximizar o rendimento da precipitação, seguida de centrifugação para formar um pellet de ácido nucleico. Lavagem do Pellet O pelLet de ácido nucleico é Lavado para remover sais coprecipitados e outros contaminantes residuais Etanol a 10-80% (gelado): Remove os sais e outros solutos que foram coprecipitados com os ácidos nucleicos, enquanto os próprios ácidos nucleicos permanecem insolúveis. É importante usar etanol gelado para minimizar a perda de ácido nucleico. O pellet não deve ser ressuspenso durante a Lavagem Após a Lavagem, o pellet é seco ao ar ou sob vácuo suave para remover o etanol residual, pois este pode interferir em reações enzimáticas subsequentes. O excesso de secagem pode dificultar a ressuspensão ELETROFORESE ore uma técnica que A eletroto as et a ú compo detrico. po negativas antro NE o o ositivo do , p a positivas pa ara O Lo ne! tivo A velocidade com que se movem depende de: Força do campo elétrico e carga da partícula: quanto maiores, mais rápida a migração. Atrito (Ligado ao tamanho e forma da partícula e ao meio): quanto maior, mais lenta a migração. Após a separação eletroforética, as moléculas precisam ser visualizadas Para Ácidos Nucléicos: Corantes fluorescentes intercalantes: Brometo de etídio (EtBr) - um intercalante potente, mas mutagênico; SYBR Safe, GelRed, GelGreen - alternativas mais seguras. Estes corantes se Ligam ao DNA/RNA e fluorescem sob luz UV. Coloração com prata: Método mais sensível, mas mais complexo. Para Proteínas: Western Blotting; Após a eletroforese, as proteinas são transferidas para uma membrana e detectadas usando anticorpos específicos. Diversos fatores influenciam a separação das moléculas durante a eletroforese Carga da Molécula: Quanto maior a carga Líquida da molécula, maior será sua velocidade de migração em direção ao polo oposto. O pH do tampão é crucial, pois pode alterar o estado de ionização das moléculas. Força do Campo Elétrico: O aumento da voltagem acelera a migração das moléculas. No entanto, voltagens excessivas podem gerar calor, desnaturar amostras (especialmente proteinas) e comprometer a resolução da separação. Tampão de Eletroforese: O tampão mantém o pH constante, o que é essencial para a carga das moléculas, e conduz a corrente elétrica. A força iônica do tampão também influencia a mobilidade; tampões de alta força iônica podem Levar a maior geração de calor e bandas mais difusas. Tamanho e Forma da Molécula: Moléculas menores e mais compactas tendem a se mover mais rapidamente através da matriz do que moléculas maiores ou com formas irregulares, devido ao menor atrito. Em géis, o efeito de peneiramento molecular é predominante. Heio de Suporte (Matriz): A natureza e a concentração da matriz (por exemplo, gel de agarose ou poliacrilamida) afetam a migração. Matrizes mais concentradas formam poros menores, retardando mais eficientemente moléculas maiores (efeito de peneiramento). Temperatura: O aumento da temperatura diminui a viscosidade do meio e aumenta a mobilidade das moléculas. No entanto, o calor excessivo pode ser prejudicial. Tipos Comuns de Eletroforese Existem diversas variações da técnica de eletroforese, cada uma adaptada para diferentes tipos de moléculas e propósitos analíticos Eletroforese em Gel E a forma mais comum, onde a separação ocorre em um gel que atua como meio de suporte e peneira molecular Eletroforese em Gel de Agarose: em si), e geralmente corridos horizontalmente Aplicações: Usada principalmente para separar fragmentos de DNA e RNA de tamanhos relativamente grandes (geralmente >50 pares de bases). A concentração de agarose (tipicamente 0.5% a 2%) determina o tamanho dos poros e, portanto, a faixa de resolução Eletroforese em Gel de Poluacrilamida (PAGE) (A) Matriz: Poliacrilamida, um polímero sintético formado pela polimerização de acrilamida e td o bisacrilamida (um agente de reticulação). A
O superenrolamento ocorre quando a hélice do DNA 2 a A está sujeita à tensão por supercontorção (positivo) —— ou subcontorção (negativo). o, O estado relaxado do B-DNA tem aproximadamente 10 é - me pb por volta. nn O DNA superenrolado ocupa menos espaço que o DNA relaxado. Ocorre quando as extremidades não podem girar livremente, como em DNA circular ou em algas estabilizadas por proteínas. A maior parte do DNA nas células apresenta superenrolamento negativo, o que facilita a separação das fitas durante a replicação e transcrição e permite acondicionamento em menor espaço. Topoisomerases são enzimas que adicionam ou removem rotações da hélice do DNA. qd QUE Cromossomos Politênicos: Encontrados em Drosophila, surgem de replicações um de DNA sem divisão celular. "Puffs" cromossômicos são intumescências | E localizadas, regiões de cromatina relaxada e transcrição ativa Dj Sensibilidade à DNase |: Uma enzima que digere DNA. DNA firmemente Ligado a . histonas é menos sensível; DNA não Ligado é mais sensível. Genes ativos para BA transcrição são sensíveis à DNase | (ex: genes da globina em eritroblastos de galinha) 7 Acetilação: Enzimas acetiltransferases prendem grupos acetila a aminoácidos Lisina nas caudas da histona. Isso reduz as cargas positivas, desestabiliza a “euiê estrutura do nucleossomo, e as histonas seguram o DNA com menos firmeza Outras modificações: Metilação e fosforilação de histonas, proteinas de remodelagem da cromatina. Alterações Epigenéticas: Modificações estáveis da estrutura da cromatina ou do DNA (como metilação do DNA) que são herdadas por células ou organismos, mas não alteram a sequência de DNA. Muitas vezes influenciadas por fatores ambientais. Ex: cor do pelo em camundongos agouti Centrômeros e Telômeros Eucarióticos Centrômero Extremidades naturais de um cromossomo Região contraída do cromossomo onde as fibras do fuso se prendem; essencial, que o estabilizam para o movimento correto do | Permitem a replicação das extremidades do cromossomo Anáfase da cromossomo Fragmentos de cromossomo sem Compostos por unidades repetidas de uma série centrômero são perdidos na de nucleotídeos adenina ou timina seguida por mitose vários nucleotídeos guanina (forma geral 5-(A Sítios de Ligação para o cinetócoro teca, ou T)mGn-3) No telômero humano, a unidade repetida é definida por alterações epigenéticas S-TTAGGG-3, repetida de centenas a milhares . . ] na estrutura da cromatina, não por de vezes ro Após citocinese q sequências de DNA específicas A fita rica em G se sobressai na extremidade Nucleossomos nos centrômeros | 3 (protuberância 3 ), medindo 50-500 nucleotídeos em mamíferos A maioria dos centrômeros é frequentemente têm uma histona Fragmentos de . cromossomo se degradam variante chamada CenH3 no lugar da , Na R A ms ; Proteínas especiais Ligam-se à protuberância, e o complexo H3, promovendo a formação do . . : . , P ç multiproteico shelterina protege as extremidades do DNA. cinetócoro A protuberância pode formar uma estrutura em Laço-t (t-Loop) para proteção adicional Tipos de Seguências de DNA em Eucariotos A densidade gênica varia muito entre e dentro dos cromossomos (ex: cromossomo 19 humano: —26 genes/ milhão de pb; cromossomo 13: 6,5 genes/milhão de pb) O projeto ENCODE concluiu que pelo menos 80% das sequências do genoma humano são funcionais, muitas ajudando DNA moderadamente repetitivo: Sequências a controlar a expressão gênica de 150 a 300 pb (ou mais) repetidas milhares de vezes. Inclui genes para RNAs ribossômicos (rRNAs) e RNAs de transferência (tRNAs) DNA moderadamente repetitivo: Sequências de 150 a 300 pb (ou mais) repetidas milhares de vezes. Inclui genes para RNAs ribossômicos (rRNAs) e RNAs de transferência (FRNAs) Repetições em tandem: Aparecem Repetições intercaladas: Dispersas DNA altamente repetitivo pelo genoma. A maioria são (DNA satélite): Sequências remanescentes de elementos curtas (geralmente <10 pb) transponíveis repetidas em tandem centenas de milhares a milhões de vezes. Agrupadas em centrômeros e telômeros. Raramente uma após a outra, agrupadas transcrito em RNA REPLICAÇÃO DO Camptotecina, Topoisomerase e Câncer A camptotecina, descoberta em 1966 por Monroe Wall e Mansukh Wani, mostrou atividade anticâncer Análogos como topotecano e irinotecano são A camptotecina impede a religação das usados hoje contra cânceres de ovário, pulmão fitas pela topoisomerase |, parando a e cólon replicação e a proliferação celular . A replicação do DNA é um alvo para Topoisomerases removem o o dos. : tratamentos de câncer devido à rápida divisão superenrolamento do DNA durante a , nas . das células cancerosas replicação, cortando e religando as fitas Precisão e Velocidade da Replicação A cópia do DNA deve ser extremamente precisa e rápida O genoma humano tem 6,4 bilhões de :) pares de base (pb) E. coli replica seu DNA (4,6 milhões de pb) a 1.000 nucleotídeos/segundo, com erro < 1/bilhão, dividindo-se a cada 20 min conservative semiconservative dispersive [1] parent DNA o . . E new DNA Gs: A replicação é semiconservativa: generation cada fita de DNA original serve first como molde para uma nova fita remo o N PN a second generation second replication Modos de Replicação Replicação Teta (0): Comum em DNA circular (ex: E. coli) Inicia na origem, formando uma bolha de replicação com forquilhas de replicação Geralmente bidirecional Visualizada por John Cairns (1963) via autorradiografia A Modelo teta Fita lider EB O DA se desers . na origem Fita y h) ra o” ) tardia a Fita lider A eplicaçã com uma Replicação por Círculo Rolante Em alguns virus e no fator F da E. coli Iniciada por uma quebra em uma fita; novos nucleotídeos são adicionados à extremidade 3 da fita quebrada, deslocando a extremidade 5 8 Modelo por circulo rolante ED Asintese de DNA contin começa na extremidade Fita lider Replicons: Unidades de replicação, cada uma origem Exigências da Replicação Molde de DNA de Tita única (após desenrolamento) Matérias-primas: trifosfatos de desoxirribonucleosídio (dNTPs) Enzimas e outras proteinas A síntese ocorre pela adição de nucleotídeos ao grupo 3-OH da fita crescente Replicação Eucariótica Linear Cromossomos lineares com múltiplas origens (milhares) Replicação bidirecional a partir de cada origem; as forquilhas se fundem € Replicação eucariotica linear — Fita N tardia 3 Fita lider Fita lider i o Fita N tardia Cm mm Ja 3 da fita de nucleotídios rompida 
