Baixe Riscos de Micro-organismos Latentes em Animais: Pesquisa e Saúde dos Funcionários e outras Notas de estudo em PDF para Microscopia, somente na Docsity!
ARTIGO ORIGINAL
Recebido em 23/06/2009. Aprovado, após revisão, em 12/08/2009. Os autores declaram ter recebido suporte financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP).
- Professor-associado da Disciplina de Reumatologia da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP)
- Professor Titular do Departamento de Medicina Veterinária e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP
- Professor Titular aposentado da Disciplina de Doenças Infecciosas e Parasitárias da Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP)
- Assistente Doutora do Hospital das Clínicas da FMUSP
- Pós-graduanda em nível de Doutorado da Disciplina de Reumatologia da FMUSP
- Biologista do Laboratório de Investigação Médica em Reumatologia do Hospital das Clínicas da FMUSP Endereço para correspondência: Prof. Natalino Hajime Yoshinari. Av. Dr. Arnaldo 455, sala 3184. Cerqueira Cesar, SP – CEP: 01246-903. E-mail: yoshinari@ lim17.fm.usp.br
Relato inusitado de micro-organismos
latentes em animais: riscos à pesquisa
e à saúde dos funcionários?
Natalino Hajime Yoshinari^1 , Silvio Arruda Vasconcelos 2 , Arary da Cruz Tiriba^3 , Giancarla Gauditano^4 , Elenice Mantovani^5 , Virgínia Lúcia Nazário Bonoldi^6
RESUMO
Relata-se inusitado achado de micro-organismos, semelhantes às espiroquetas, móveis e de diferentes morfologias e tamanhos, identificados pela microscopia de campo escuro, no sangue de animais do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP. As bactérias não crescem em meios habituais de cultivo, são pouco coradas pelo Giemsa e derivados da prata, e as provas sorológicas e moleculares foram negativas para Borrelia e Leptospira. A microscopia eletrônica revelou presença de micro-organismos com morfologia de Mycoplasma e, devido à sua mobilidade, sugeriu-se a presença de Mollicutes do gênero Spiroplasma. Visualizaram-se micro-organismos com mesmas características em 15 dos 26 funcionários (57,6%) do Centro de Bioterismo da FMUSP; contudo, exames clínicos e laboratoriais indicaram que os indivíduos estavam saudáveis. Estudos adicionais desenvolvidos na Disciplina de Reumatologia da FMUSP mostraram que, aproximadamente, 94% dos pacientes com Síndrome Baggio-Yoshinari (SBY) e 20% dos indivíduos normais também exibiam as mesmas estruturas identificadas no Centro de Bioterismo. A microscopia eletrônica realizada com amostras de pacientes com SBY mostrou bactérias que apresentam semelhanças com Mycoplasma , Chlamydia e Bacteroides. Visto que as sorologias e os testes moleculares foram negativos para estes contaminantes e com base em publicações da literatura médica, sugeriu-se que estes agentes infecciosos latentes fossem bactérias na sua apresentação L, que são definidas como bactérias despojadas de parede celular, assumindo, assim, morfologia de Mycoplasma , sendo, na maioria dos casos, inofensivas aos hospedeiros. Concluímos que os “espiroquetídeos” visualizados em animais e funcionários do Centro de Bioterismo seriam bactérias na forma L, não patogênicas, provenientes de contaminantes do meio ambiente, infecções regulares habituais ou oriundos de micro-organismos endógenos da flora saprofítica normal. Ao contrário, os “espiroquetídeos” identificados na SBY, ao preservarem a capacidade de invadir células in vitro , são potencialmente patogênicos e relacionados com a etiologia da SBY. Interpretamos a SBY como zoonose nova e particular ao território brasileiro, causada por espiroquetas adaptadas às formas latentes, possivelmente provenientes de mutações bacterianas em resposta às condições ecológicas e geográficas próprias do país.
Palavras-chave : espiroqueta, espiroqueta-símile, bactéria forma L, Mycoplasma , síndrome brasileira semelhante à doença de Lyme, síndrome Baggio-Yoshinari, Borrelia , micro-organismo latente, Centro de Bioterismo, animais de experimentação, Brasil.
INTRODUÇÃO
Em portaria publicada no Diário Oficial do Estado de São
Paulo, Poder Executivo, Seção I, 112(64), página 38, publicada
em 6/4/2002, o reitor da USP Prof. Adolfo José Melfi nomeou
Comissão para averiguar inusitados problemas bacteriológicos ligados a Centros de Bioterismo, constituída pelos Professo- res Natalino Hajime Yoshinari (Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo - FMUSP), Silvio de Arruda Vas- concelos (Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da
Relato inusitado de micro-organismos latentes em animais: riscos à pesquisa e à saúde dos funcionários?
USP-FMZUSP) e Arary da Cruz Tiriba (Universidade Federal de São Paulo-UNIFESP). O problema referente ao Biotério da FMUSP teve início em 2001, quando o Dr. Ismar Cestari detectou a presença de micro-organismos semelhantes às espiroquetas, no cultivo in vitro de células esplênicas de animal proveniente do Centro de Bioterismo da Faculdade de Medicina da USP (FMUSP). No intuito de compreender a extensão do problema, a Comissão realizou microscopia de campo escuro no sangue periférico dos animais e, de fato, confirmou a presença de micro-organismos semelhantes às espiroquetas em 15 das 15 amostras de camundongos (BALB/c, A/SNELLl, SWISS e C57BI/6), em duas das cinco de rato (WISTAR), em cinco das cinco de coelho e em nenhuma das amostras de cobaia. Nova leitura foi realizada no segundo semestre de 2002 e o resultado foi positivo em 28 das 40 amostras de sangue (70%) de diferentes espécies de ratos e camundongos. O mes- mo procedimento foi conduzido com animais provenientes da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP (FMVZUSP), e a microscopia de campo escuro mostrou “espi- roquetídeos” em apenas duas das oito amostras de camundon- gos e em nenhuma das oito amostras de hamsters, indicando ser problema comum aos Biotérios, apesar da frequência deste achado ter sido maior na FMUSP. Do ponto de vista clínico, os animais do Centro de Biote- rismo da FMUSP encontravam-se aparentemente saudáveis. A veterinária Sueli Blanes Damy et al.^1 tinham realizado análises bioquímicas preliminares em “ pools ” com soros de quatro camundongos fêmeas e em amostras com cinco soros de ratos WISTAR e mostraram aumento dos níveis de ureia, fosfatase alcalina, aspartato amino transferase (AST) e alanina amino transferase (ALT), sugerindo existir algum fator infeccioso ou tóxico responsável pelo aparecimento de transtornos bioquí- micos relacionados com alterações da função hepática. Nesse mesmo trabalho, os autores ao realizarem estudos à micros- copia eletrônica e testes imuno-histoquímicos no tecido pul- monar, fígado, baço, coração e rim dos animais, identificaram Mycoplasma pulmonis em quase 100% dos animais residentes em biotérios convencionais e em 18% dos que mantinham barreiras sanitárias adequadas. Reportaram que, na literatura, havia descrições de hepatopatias causadas por Mycoplasma em ovelhas, pombos e cabras, mas não encontraram relatos em ratos. No intuito de confirmar estes achados, repetimos exames à microscopia eletrônica em amostras de sangue de roedores com ¨espiroquetídeos¨ (Figura 1). Uma vez que a microscopia óptica revelava no sangue dos animais a presença de micro-organismos móveis, de tamanhos diversos, que variavam de minúsculos pontos a estruturas
alongadas que chegavam a medir até 15-20 μm, a Comissão julgou, inicialmente, que pudesse tratar-se de espiroquetas. As sorologias para leptospirose, hemoculturas em meio aeróbico, anaeróbicos e BSK, assim como testes Moleculares (PCR) para Leptospira e Borrelia , realizados na FMUSP, FMVZUSP e Instituto Biológico, foram persistentemente negativos. Chamou a atenção dos membros da Comissão o tamanho incomum das estruturas identificadas no sangue periférico dos animais, pois eram grandes e aparentemente incompatíveis com a hipótese de serem Mycoplasma ou Chlamydia. Outro aspecto interessante destas estruturas era a dificuldade de cultivo em meios habituais e a impossibilidade de identificação das bactérias através do
A
B Figura 1. A) Fotomicrografia eletrônica de soro de rato Wistar do Biotério sem tratamento com visualização de micro-organismo com morfologia de micoplasma. Coletado em 6/11/2002. B) Presença de numerosas estrutu- ras com forma e tamanho irregulares, revestimento por uma membrana e conteúdo granuloso, compatíveis com micoplasmas, provenientes de roedor do Centro de Bioterismo.
Relato inusitado de micro-organismos latentes em animais: riscos à pesquisa e à saúde dos funcionários?
A B
C D
Figura 3. A) Visualização de estruturas que sugerem espiroquetas e Mycoplasma à microscopia eletrônica, em sangue de paciente com SBY semeado em meio de cultura SP4, no qual E: Espiroquetídeo; My: Mycoplasma. Aumento de 24.000X; B) Visualização de estrutura que lembra Chlamydia no sangue periférico de paciente com SBY, analisado à microscopia eletrônica. Aumento de 24.000X. C) Visualização de estruturas que lembram espiroquetas à microscopia eletrônica, no sangue periférico de paciente com SBY semeado em meio SP4. Aumento de 6.200X. D) Visualização de estrutura que lembra espiroqueta à microscopia eletrônica, no sangue periférico de paciente com SBY semeado em meio SP4. Aumento de 6.5000X.
determinado pela Comissão constituída pela Reitoria da USP, para avaliar o estado clínico dos funcionários que lidavam com os animais ou que trabalhavam nas dependências do Biotério. Este protocolo incluía investigação clínica com anamnese e exame físico completos. Com relação aos exames com- plementares foram avaliados: 1. hematológico: hemograma (teste automatizado, microscopia e coloração panóptica); 2. bioquímicos: ureia (teste cinético), creatinina (teste colori- métrico cinético), glicemia (teste enzimático colorimétrico), colesterol total (teste enzimático colorimétrico), triglicerídeos (teste enzimático colorimétrico), ácido úrico (teste enzimático colorimétrico), sódio (teste de eletrodo íon-seletivo), potássio (teste de eletrodo íon-seletivo), calcemia (teste colorimétrico),
ferro sérico (teste colorimétrico), ALT (teste cinético), AST (teste cinético), gama glutamil transferase (gama GT - teste cinético), creatinofosfoquinase (CK - teste cinético); 3. urinálise: urina tipo I; 4. bacteriológicos: hemocultura, coprocultura, protopa- rasitológico de fezes (coloração de Leishman); 5. imunológicos gerais e inflamatórios: proteína C reativa (teste nefelométrico), velocidade de hemossedimentação (teste de Westergren), complemento C3 e C4 (teste nefelométrico), eletroforese de proteínas, imunoeletroforese de proteínas, fator reumatoide (teste de aglutinação), fator antinuclear em células Hep-2 (teste de imunofluorescência) e antiestreptolisina O (teste nefelométrico);
- sorologias para doenças infecciosas: de Lyme realizada no La- boratório de Investigação Médica (LIM-17) do HCFMUSP (teste
Yoshinari et al.
imunoenzimático – ELISA), leptospirose feita na FMVZUSP (teste de soroaglutinação microscópica), e os demais exames de sífilis (ensaio imunoenzimático - ELISA), toxoplasmose (ensaio imunoenzimático em micropartículas – MEIA), hepatites virais A,B (ensaio imunoenzimático em micropartículas – MEIA), hepatite C (teste de quimioluminescência) e citomegalovírus (ensaio imunoenzimático - ELISA), no Laboratório Central HCFMUSP; 7. Imagem: radiografia de tórax e ultrassonografia (US) total do abdome e 8. consultas médicas especializadas quando necessárias. Esse estudo foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa – CAPPesq do HCFMUSP (342/09).
RESULTADOS
Foram examinados 37 funcionários do Centro de Bioterismo da FMUSP, dos quais cinco eram administrativos, no Ambula- tório de Clínica Médica do Hospital das Clínicas da FMUSP. Devido ao fato de tratar-se de Biotério convencional, sem áreas de isolamento, decidiu-se pela não discriminação funcional do pessoal. Vinte e cinco eram do sexo masculino e 12 do feminino. A idade dos funcionários variou de 21 a 54 anos (36,6 + 9,87).
ANAMNESE
Com relação ao interrogatório geral, 12 dos 37 funcionários (32,4%) referiram alguma manifestação alérgica, como asma, rinite ou erupção cutânea. A frequência de “etilismo social”
foi de 62,5%, ou seja, referido por 15 dos 24 indivíduos que responderam a este quesito. Dos 37 entrevistados, dez indivíduos queixavam-se fre- quentemente de cansaço e adinamia (27%), enquanto três referiam episódios recorrentes de febre ou calafrios (8,1%). Com relação ao sistema locomotor, nove (24,5%) queixa- vam-se de dores constantes na coluna, oito (21,6%) referiam artralgia, dois talalgia, um apresentava artrite e um mialgia. Dezesseis funcionários (43,2%) não tinham sintomas osteo- articulares. Quanto às manifestações neurológicas, 12 (32,4%) referiam cefaleia regularmente, nove reportaram episódios frequentes de esquecimento (24,3%). Sete queixavam-se de distúrbios do sono (18,9%), cinco de nervosismo ou irritação (13,5%), três de dificuldade de concentração (8,1%), três com episódios de tontura (8,1%) e um apresentava paralisia facial. Nove funcionários (24,3%) negaram qualquer queixa neurológica. Quanto aos sintomas cardiovasculares, cinco (13,5%) apre- sentavam episódios de palpitações frequentes e três (8,1%) de precordialgia atípica. O interrogatório de outros sistemas mostrou que 12 (32,4%) referiam aumento da frequência diária de evacuações (mais de duas vezes), seis tinham dor de garganta frequente (16,2%) e quatro relatavam episódios constantes de tosse ou infecções de vias respiratórias superiores. Cinco trabalhadores do Centro de Bioterismo negaram qualquer queixa clínica (13,5%).
EXAME FÍSICO
O exame físico não mostrou alterações significativas, observando-se manifestações cutâneas em cinco pacientes (pústulas, erupção eritematomacular, hiper-hidrose, pitiríase versicolor e psoríase). Um funcionário apresentava hepatome- galia e baqueteamento de dedos, um exibia ausculta pulmonar compatível com broncoespasmo, um com artrite compatível com gota e outro com nódulos de Heberden e Bouchard (ar- trose de mãos).
EXAMES LABORATORIAIS
O hemograma mostrou-se normal, com exceção de dois casos com discreta leucocitose, três com leucopenia e cinco funcio- nários com discreta anemia. Não foram observadas alterações da contagem de plaquetas. Os principais resultados dos exames bioquímicos cons- tam da Tabela 1, e chama a atenção o grande número de funcionários com elevação dos níveis de enzimas hepáticas e musculares.
Figura 4. Visualização de espiroquetídeo no interior de célula endote- lial à microscopia eletrônica, após incubação com meio de cultura SP contendo espiroquetídeos em suspensão, obtidos de pacientes com SBY. Aumento de 15.000X.
Yoshinari et al.
IMAGEM
A radiografia de tórax foi normal nos funcionários que realiza- ram o exame. A US total do abdome mostrou alguma alteração em 10 dos 18 casos (55,5%), e as alterações encontradas foram: esteatose hepática em cinco casos, hepatomegalia em quatro, linfonodos peripancreáticos em um, calcificações hepáticas em um, dilatação do hepato-colédoco em um e nódulos hepáticos em um caso.
AVALIAÇÃO HEPÁTICA
Funcionários com alteração à US de abdome foram encami- nhados ao gastroenterologista, porém não foram constatadas alterações significativas que merecessem investigações com- plementares.
DISCUSSÃO
Um grande efetivo de profissionais de diferentes instituições de pesquisa foi mobilizado, com o objetivo de estudar a situação
clínica dos funcionários do Centro de Bioterismo da FMUSP, em decorrência do encontro inusitado de micro-organismos de características latentes nos animais do Centro de Bioterismo da FMUSP, o que poderia indicar a ocorrência de zoonose emergente e nova doença ocupacional. Desde que, não havia nenhuma referência na literatura médica, sobre micro-orga- nismos com as características descritas no sangue de animais e de humanos, encontramos sérias dificuldades para explicar de onde surgiam e qual seria o papel patogênico destes micro- organismos nos hospedeiros. Havia a necessidade urgente de encontrarmos respostas, a fim de tranquilizarmos os funcionários, quanto aos riscos à saúde e a necessidade de retornarmos respostas aos pesqui- sadores da instituição que utilizavam animais do Centro de Bioterismo quanto à interferência desta infecção nas pesquisas com animais. As más condições sanitárias encontradas no Biotério su- geriam que fatores ambientais poderiam estar influenciando o surgimento dos espiroquetídeos, visto que a frequência de contaminantes variava entre as instituições pesquisadas.
Tabela 2 Na coluna A: frequência de soropositivos para doença de Lyme símile brasileira, leptospirose, sífilis, toxoplasmose, hepatites virais e citomegalovírus. Na coluna B: hemoculturas, coproculturas, microscopia de campo escuro e claro, protoparasitológico, pesquisa de leucócitos nas fezes e PCR para Leptospira spp nos Funcionários do Centro de Bioterismo da FMUSP Parâmetros (A) Frequência Parâmetros (B) Frequência Borrelia burgdorferi (IgG) 4/27 (14,8%) Hemocultura (aeróbios) (n = 25) S. epidermidis (1 caso) Borrelia burgdorferi (IgM) 0/27 (0%) Hemocultura (anaeróbios) (n = 25) Negativas Borrelia burgdorferi (IgG ou IgM) 4/27 (14,8%) Coprocultura () (n = 25) Negativas Leptospirose 0/27 (0%) Coprocultura para spp (N=5) () Helicobacter Negativas Sífilis (RSS) 1/25 (4%) PCR para leptospirose (n = 5) () Negativa Toxoplasmose (IgM) 2/25 (8%) “Espiroquetídeos” emcampo escuro (**) 15/26 (57,6%)
Toxoplasmose (IgG) 8/25 (32%) Bacterioscopia em campoclaro (n = 5) (**) Negativas
Hepatite pelo vírus A (IgM) 0/25 (0%) Bacterioscopia em campoescuro (n = 5) () Negativas Hepatite pelo vírus A (IgG) 20/25 (80%) PPF Fezes ( Blastocystis hominis ) 3/25 (12%) HBsAg 0/25 (0%) PPF Fezes ( E. nana ) 1/25 (4%) Anti-HBsAg 1/25 (4%) (vacinada) Presença de leucócitos nas fezes 9/25 (36%) Hepatite pelo vírus C 0 (0%) Citomegalovírus (IgM) 0/25 (0%) Citomegalovírus (IgG) 21/25 (84%) () Coprocultura realizada no Instituto Adolfo Lutz para enterobactérias patogênicas: Salmonella, Shigella, E. coli patogênica, Campylobacter. () Exames realizados no Instituto Biológico em amostras consideradas suspeitas, de funcionários com diarreia e visualização de “espiroquetídeos” à microscopia de campo escuro no LIM-17 do Hospital das Clínicas FMUSP. Bacterioscopia em campo claro foi realizada no sangue periférico, com coloração pelas técnicas de Ryu e Gram. (**) Os ¨espiroquetídeos¨ foram pesquisados no LIM-17 HCFMUSP.
Relato inusitado de micro-organismos latentes em animais: riscos à pesquisa e à saúde dos funcionários?
Surpreendeu-nos o fato de 15 dos 26 funcionários (57,6%) apresentarem as mesmas estruturas identificadas nos animais, indicando possível transmissão destes micro-organismos aos funcionários no local do trabalho. A Comissão constatou igualmente baixas condições de higiene exibidas pelos funcionários nas dependências do Biotério, pois alimentavam e dormiam no local do trabalho, manipulavam, às vezes, os animais sem luvas, entravam em contato direto com dejetos animais sem botas e havia promis- cuidade entre as diferentes espécies de animais. Neste sentido, a primeira orientação foi a de educar os funcionários quanto aos hábitos higiênicos e estabelecer normas rígidas quanto ao trato de animais. O exame médico dos funcionários mostrou que, de modo geral, eles estavam em boas condições clínicas, entretanto, chamou-nos a atenção a alta frequência de fenômenos alérgicos e de diarreia. Do ponto de vista laboratorial, havia funcioná- rios com provas de atividade inflamatória alteradas, enzimas hepáticas e musculares elevadas, níveis altos de IgA e IgE e presença de leucócitos nas fezes. No início, pensamos estar havendo maior incidência de complicações hepáticas, intesti- nais e alérgicas. Contudo, essa impressão não foi confirmada, pois faltou um grupo-controle com as mesmas características demográficas e de hábitos, mas que não estivessem trabalhando no Centro de Bioterismo. Alguns aspectos chamaram a nossa atenção como a alta incidência de etilismo social no grupo estudado (62,5%), ex- posição contínua dos funcionários aos dejetos animais, rações e produtos biológicos diversos, além do baixo padrão de higie- ne. Julgamos que estes fatores explicassem parte das queixas clínicas e alterações laboratoriais encontradas, e que medidas preventivas contribuiriam na diminuição da frequência da infecção animal e humana, além da “eventual normalização” dos testes de rotina. Tranquilizou-nos o fato de os funcionários com alterações hepáticas à US de abdome e aos exames labo- ratoriais, quando avaliados no Serviço de Gastroenterologia do HC FMUSP, serem considerados normais, sem necessidade de procedimentos auxiliares complementares. O próximo passo do estudo foi o de tentar elucidar a etiolo- gia da infecção latente, demonstrada pelo achado de estruturas semelhantes às espiroquetas, em animais de laboratório e nos funcionários do Centro de Bioterismo (Figura 2A). Exibiam diferentes tamanhos e morfologias, eram móveis, mostravam- se incultiváveis, não se coravam pelo método de Giemsa e, apesar de lembrar espiroquetas, os testes laboratoriais empre- gados foram persistentemente negativos para diagnóstico de Leptospira e Borrelia. Estudos sorológicos foram negativos para síndrome brasileira semelhante à Doença de Lyme, lep-
tospirose e sífilis e os testes de biologia molecular negativos para Leptospira spp e Borrelia spp (dados não apresentados). Conforme apresentado anteriormente, Damy SB et al.^1 ha- viam identificado Mycoplasma pulmonis em 100% dos animais de laboratório mantidos em regime convencional de criação, e relataram que estes micro-organismos poderiam causar lesão hepática, justificando as alterações enzimáticas encontradas nos animais do Centro de Bioterismo da FMUSP. Mycoplasma são considerados os menores organismos autorreplicantes, requerem colesterol para sobreviverem e são desprovidos de parede celular. São a exemplo de Chlamydia , bactérias intracelulares que infectam inúmeras células como as endoteliais, epiteliais e os macrófagos, além de representarem importantes cofatores no aumento da virulência às infecções por outros micro-organismos. 2 Higuchi et al. 3,4^ reportaram que estes micro-organismos influenciam o desenvolvimento de placas instáveis de ateroma. Inclusive, conseguiram visualizar através da microscopia eletrônica formas elípticas e cilíndricas de Mycoplasma de diferentes tamanhos, distribuídas na matriz extracelular de tecidos humanos acometidos. Entretanto, não encontramos referências na literatura médica, quanto ao possível papel de Mycoplasma spp e Chla- mydia spp como agentes zoonóticos. Outro aspecto intrigante era o de que estes micro-organismos são de dimensões dimi- nutas e imóveis, contradizendo os achados de microscopia de campo escuro, que revelava estruturas móveis que chegavam a atingir aproximadamente 15 μm de comprimento. Assim, a hipótese de que os micro-organismos identificados no sangue dos roedores do Centro de Bioterismo da FMUSP (Figura 1) fossem Mycoplasma ficou abalada. Segundo opinião pessoal do Prof. J. Timenetsky do ICBUSP, estudioso de Mycoplasma , a maior parte dos roedores é contaminada por esta bactéria, e, assim, os dados da microscopia eletrônica poderiam ser um achado fortuito e não relacionado com as nossas constatações. Mesmo assim, fomos pesquisar a possibilidade de en- contrar bactérias com morfologia de Mycoplasma , dotadas de movimento e de dimensões maiores. Sabe-se que as bactérias do grupo Mollicutes são constituídas pelos gêneros Myco- plasma , Spiroplasma e Acholeplasma , micro-organismos desprovidos de parede celular e envoltos em membrana celular rica em colesterol. Conforme Shlomo T & Rami G,^5 micro- organismos do gênero Spiroplasma , devido à presença de um citoesqueleto, que funciona como motor propulsor, exibem movimentos circular e elíptico, além de apresentarem capaci- dade quimiotáxica. Podem atingir até 10 μm de comprimento, são sensíveis a eritromicina e tetraciclinas e algumas espécies são patogênicas para ratos, camundongos, hamster e coelhos. Podem ser identificados ainda em plantas, abelhas, carrapatos,
Relato inusitado de micro-organismos latentes em animais: riscos à pesquisa e à saúde dos funcionários?
o surgimento de espiroquetas exóticas, talvez mutantes, adap- tadas a sobreviver nos hospedeiros vertebrados e invertebrados no país. Atualmente, sabemos que, Borrelia são capazes de modificar o seu genoma e proteoma durante o seu ciclo de vida, que envolve a infecção de carrapatos e animais.20- 25 Com objetivo de identificar o agente etiológico da SBY no sangue periférico dos pacientes com SBY, com auxílio da microscopia de campo escuro, identificamos ¨espiroquetídeos¨ semelhantes aos encontrados nos animais e funcionários do Centro de Bioterismo da FMUSP. De maneira similar, os ¨espiroquetídeos¨ provenientes de enfermos com SBY não cresciam no meio BSK e tampouco em outros inúmeros meios de culturas testados. No início, acreditamos que estas estruturas fossem Molli- cutes do gênero Spiroplasma, fundamentados nas conclusões do Relatório enviado à Reitoria da USP. Inclusive, reforçando esta hipótese, descobrimos que estas bactérias latentes eram capazes de crescer e manter-se pelo período aproximado de 10 dias em meio adequado ao desenvolvimento de Spiroplasmas , conhecido como SP4 (Figura 2B). Por outro lado, ao semear espiroquetas do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato em meio SP4, ocorria sua degeneração celular, a ponto das Borrelia perderem o movimento helicoidal típico e transformarem-se em estruturas semelhantes às visualizadas na SBY e nos animais do Centro de Bioterismo. Achado surpreendente foi o encontro destes micro- organismos latentes no sangue de indivíduos normais, que não eram funcionários de Centro de Bioterismo e tampouco indivíduos com histórico recente de picada por carrapatos. Ao realizarmos a pesquisa destas estruturas em 52 pacientes com SBY e em 50 indivíduos normais, demonstramos ocorrência destes ¨espiroquetídeos¨ em 49 das 52 amostras (94,2%) dos pacientes com SBY e em apenas 20% dos indivíduos normais (dados não publicados). Mantovani E et al. ,^26 ao analisarem os ¨espiroquetídeos¨ encontrados na SBY à microscopia eletrônica, visualizaram micro-organismos com morfologias sugestivas de Mycoplasma , Chlamydia e espiroquetas. Esta descoberta levou os autores a suporem que a etiologia da SBY estaria vinculada a esta plêiade de micro-organismos latentes, caracterizando uma nova entidade clínica transmitida por carrapatos. Aspecto adicional de grande relevância foi a descoberta de que estes micro-organismos laten- tes, isolados de pacientes com SBY, foram capazes de infectar células endoteliais in vitro , indicando serem potencialmente patogênicos (dados não publicados) (Figura 4). Ao realizarmos exames sorológicos e testes de Biologia Molecular (PCR) para Mycoplasma spp e Chlamydia spp, tanto nos pacientes com SBDL como nos indivíduos normais, nota-
mos que os dois grupos comportaram-se de maneira idêntica, indicando que, na verdade, os ¨espiroquetídeos¨ não seriam os micro-organismos anteriormente imaginados (dados não publi- cados). Neste momento, perdeu força a hipótese das bactérias latentes pertencerem aos gêneros Mycoplasma e Chlamydia. Por analogia, a hipótese dos animais e funcionários do Biotério, estarem contaminados por Mollicutes do gênero Spiroplasma ficou também sob suspeição. Na busca de respostas para estas dúvidas, descobrimos após intensa revisão da literatura médica, que todas as bacté- rias podem assumir morfologia de Mycoplasma , ao perderem constituintes da parede celular, fato que pode acontecer em condições adversas de sobrevivência. 27-29^ Essas bactérias morfologicamente alteradas e com semelhança estrutural de Mycoplasma são conhecidas como formas L, esferoplastos ou bactérias desprovidas de parede ( cell wall deficient bacteria ). Essa mudança fenotípica é igualmente observada com as es- piroquetas dos gêneros Treponema e Borrelia. 30- As espiroquetas quando cultivadas em condições adversas de pH, temperatura ou na presença de antibióticos, sofrem importantes modificações morfológicas, com aparecimento de estruturas atípicas de diferentes tamanhos e formas, que variam desde minúsculos pontos e esporos (conhecidos como blebs ), até formações que lembram bactérias alongadas (¨espiroque- tídeos¨), corpúsculos densos de dupla membrana (semelhantes à Chlamydia ) e cistos de membrana simples (sugestivas de Mycoplasma ), quando analisadas à microscopia eletrônica.^33 Adicionalmente, foram descritas espiroquetas de morfologias atípicas, como as citadas anteriormente, no parênquima cere- bral de pacientes com acometimento neurológico devido às infecções pela sífilis e borreliose de Lyme.34,35^ Sob condições favoráveis de cultivo as espiroquetas na sua forma L costumam reassumir a morfologia helicoidal habitual.^36 A literatura médica considera a maioria das bactérias na forma L como não patogênicas, com raras exceções.^27 O conjunto dos conhecimentos acumulados no LIM-17 HCFM USP, levou-nos a postular que bactérias na apresentação L em animais e homens seriam eventos relativamente frequentes. Consideramos que as fontes habituais de contaminação seriam as infecções regulares e passageiras dos tratos respiratório, digestório e urinário. Em locais com condições sanitárias im- próprias, como acontecia no Centro de Bioterismo da FMUSP, com certeza, haveria uma grande proliferação bacteriana ambiental e contaminação humana e animal, provocando alta frequência de ocorrência de ¨espiroquetídeos¨ (bactérias na forma L) no sangue periférico. Outra fonte de ¨espiroquetí- deos¨ sugerida, em indivíduos normais, seria a proveniente da flora saprofítica habitual.
Yoshinari et al.
Conforme comentado, na maioria das vezes, estes micro-or- ganismos na forma L não seriam patogênicos, como havíamos concluído no Relatório apresentado à Reitoria da USP. Con- tudo, em nossa opinião, os ¨espiroquetídeos¨ encontrados na SBY apresentariam comportamento distinto do habitual, pois ao preservarem a capacidade de invadir as células endoteliais, revelavam alto potencial patogênico. Uma vez que espiroquetas na sua forma espiralada helicoidal jamais foram cultivadas e isoladas no Brasil, passamos a admitir que a etiologia da SBY estivesse vinculada a espiroquetas na forma L. Acreditamos que o agente etiológico da SBY adaptou-se de maneira permanente à sua morfologia atípica, devido a perdas irreversíveis do seu conteúdo genético e de lipoproteínas da parede celular (Osp), visando à sobrevivência em condições adversas, como, por exemplo, a ausência de carrapatos do complexo Ixodes ricinus no Brasil. Nesse sentido, têm surgido recentes publicações mostrando que a diversidade genética das diferentes espécies de espiroquetas do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato , sofrem influências regionais e continentais.37- 39 Finalmente, ao se aceitar que a SBY seja causada por es- piroquetas na sua morfologia atípica, conseguimos justificar todas as particularidades clínicas e laboratoriais desta zoonose tipicamente brasileira. Essa teoria explica as recorrências clíni- cas e a evolução da SBY para enfermidades crônicas ditas idio- páticas; justifica as dificuldades no tratamento, especialmente das enfermidades de longa evolução; explica a interferência dos micro-organismos no sistema imunológico, provocando surgimento de reações imunoalérgicas; compreende-se por- que as bactérias são de difícil cultivo e pouco coradas pelas metodologias habituais de impregnação; entende-se porque esses micro-organismos suscitam baixa reatividade imunoló- gica contra Borrelia burgdorferi; e justifica porque os testes moleculares como o PCR são persistentemente negativos, possivelmente em decorrência da perda parcial de plasmídeos. A teoria de que no Brasil a SBY seja causada por espiroqueta mutante, geneticamente modificada e desprovida de boa parte da parede celular (Osp) e de flagelos periplásmicos, tem suporte adicional da literatura médica, pois já foi descrita Borrelia burg- dorferi mutante desprovida de Osp A, B, C e D.^40 Essas proteínas de superfície são importantes para distinguir as diferentes espé- cies de espiroquetas do complexo Borrelia burgdorferi sensu lato , e participam na patogenicidade e no desencadeamento da resposta imunológica do hospedeiro ao micro-organismo. Adicionalmente, a mobilidade e a forma helicoidal das Borrelia são dependentes dos 7-11 flagelos periplásmicos41,42^ e quando
ocorre mutação do gene flaB (gene principal da flagelina), a espiroqueta assume morfologia bacteroide,^43 lembrando a forma como é visualizada no Brasil através da microscopia eletrônica. Assim, espiroquetas com perdas de flagelos e lipoproteínas de parede, assumiriam aspecto de ¨espiroquetídeos¨ à microscopia de campo escuro e de Mycoplasma e Chlamydia quando vistas à microscopia eletrônica. Hoje, após 20 anos de pesquisas, ousamos definir a SBDL ou SBY como enfermidade original brasileira, causada por espiroqueta de comportamento latente e morfologia atípica na apresentação L, transmitida por carrapatos que não perten- cem ao complexo Ixodes ricinus , que reproduz manifestações clínicas semelhantes às observadas na DL, exceto pela alta frequência de recorrências, tendência à cronicidade e reações imunoalérgicas.
AGRADECIMENTOS
Prof. Dr. Flair Carrilho-Professor Titular do Departamento de Gastroenterologia FMUSP Prof. Dr. Milton Arruda Martins - Professor Titular de Clínica Médica FMUSP Dr. José Antonio Atta - Professor Colaborador FMUSP Profa. Dra. Maria de Lourdes Higuchi - Professora Associada do INCOR FMUSP Eliana Scarcelli Pinheiro - Pesquisadora Científica do Instituto Biológico Margareth Elide Genovez - Pesquisadora Científica do Instituto Biológico Prof. Dr. Paulo Yasuda - Professsor Aposentado ICB USP Profa. Silvia Barreto C. Ortiz - Responsável pelo Centro de Bioterismo FMUSP Robson José da Cruz - Biologista do Centro de Bioterismo FMUSP Sueli Blanes Damy - Médica-veterinária do Centro de Bioterismo FMUSP Dr. Cristiano Correa de Azevedo Marques - Diretor Geral do Instituto Adolfo Lutz Dra Vera Simonsen - Chefe da Bacteriologia do Instituto Adolfo Lutz
Yoshinari et al.
528 Bras J Rheumatol 2009;49(5):506-
- Singh SK, Girschick HJ. Molecular survival strategies of the Lyme spirochete Borrelia burgdorferi. Lancet Infect Dis. 2004; 4:575-83.
- Mantovani E, Costa IP, Gauditano G, Bonoldi VLN, Higuchi ML, Yoshinari NH. Description of Lyme disease-like syndrome in Brazil. Is it a new tick borne disease or Lyme disease variation? Braz J Med Biol Res 2007; 40:443-56.
- Dominique GJ, Wood HB. Bacterial persistence and expression of disease. Clin Microbiol Ver 1997; 10:320-44.
- Alla EJ, Hoischen C, Gumper J. Bacterial L form. Adv Appl Microbiol 2009; 68:1-39.
- Austrauskiene D, Bernotiene E. New insights into bacterial persistence in reactive arthritis. Clin Exp Rheumatol 2007; 25:470-9.
- Mursic VP, Wanner G, Reinhardt S, Wilske B, Busch U, Marget W. Formation and cultivation of Borrelia burgdorferi spheroplast- L-form variants. Infection. 1996; 218-6.
- Murgia R, Cinco M. Induction of cystic forms by different stress conditions in Borrelia burgdorferi. APMIS. 2004; 112:57-62.
- Ovcinnikov NM, Delektorskij VV. Current concepts on the morphology and biology of Treponema pallidum based on electron microscopy. Br J Vener Dis. 1971; 47:315-28.
- Kersten A, Poitschek C, Rauch S, Aberer E. Effects of penicillin, ceftriaxone, and doxycycline on morphology of Borrelia burgdorferi. Antimicrobial Agents & Chemotherapy. 1995; 39: 1127-33.
- Miklossy J, Kasas S, Zurn AD, McCall S, Yu S, McGeer PL. Persisting atypical and cystic forms of Borrelia burgdorferi and local inflammation in Lyme neuroborreliosis. J Neuroinflammation. 2008; 5:40; published online doi: 10.1186/1742-2094-5-
- Duray PH, Yin SR, Ito Y et al. Invasion of human tissue ex vivo by Borrelia burgdorferi. J Infect Dis 2005; 191:747-54.
- Brorson O, Brorson S. A rapid method for generating cystic forms of Borrelia burgdorferi , and their reversal to mobile spirochetes. APMIS 1998; 106:1131-41.
- Derdáková M, Lencáková D. Association of genetic variability within the Borrelia burgdorferi sensu lato with the ecology, epidemiology of Lyme borreliosis in Europe. Ann Agric Environ Med. 2005; 12:165-72.
- Kurtenbach K, Hanincová K, Tsao JI, Margos G, Fish D, Ogden NH. Fundamental processes in the evolutionary ecology of Lyme borreliosis. Nature Reviews/Microbiology. 2006; 4:660-9.
- Malawista SE, Montgomery RR, Wang XM, Fu LL, Giles SS. Geographic clustering of an outer surface protein A mutant of Borrelia burgdorferi. Possible implications of multiple variants for Lyme disease persistence. Rheumatology. 2000; 39:537-41.
- Sadziene A, Denée T, Barbour AG. Borrelia burgdorferi mutant lacking Osp: Biological and Immunological characterization. Infection and Immunity. 1995; 63:1573-80.
- Sal MS, Li C, Motalab MA, Shibata S, Aizawa S, Charon NW. Borrelia burgdorferi uniquely regulates its motility genes and has an intricate flagellar hook-basal body structure. J Bacteriol. 2008; 190:1912-21.
- Motaleb MA, Corum L, Bono JL et al. Borrelia burgdorferi periplasmic flagella have both skeletal and motility functions. Proc Natl Acad Sci USA. 2000; 97:10899-904.
- Motaleb MA, Sal MS, Niles WC. The decrease in FlaA observed in a flaB mutant of Borrelia burgdorferi occurs posttranscriptionally. J Bacteriol. 2004; 186:3703-11.
