MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS
PARA QUANTIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS
Universidade Estadual do Rio Grande do Sul
Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia
Unidade em Bento Gonçalves
Profª Francine Fioravanso Tramontina
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Quantificação espectrofotométrica de proteínas, Slides de Bioquímica
Explica como a absorção de energia por moléculas proteicas pode ser utilizada em sua quantificação
Tipologia: Slides
2023
1 / 42
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MÉTODOS
ESPECTROFOTOMÉTRICOS
PARA QUANTIFICAÇÃO DE
PROTEÍNAS
Universidade Estadual do Rio Grande do Sul Engenharia de Bioprocessos e Biotecnologia Unidade em Bento Gonçalves Profª Francine Fioravanso Tramontina
Áreas de interesse
Diferentes áreas
Interesse comum
Controle de qualidade de
bioprocessos, purificação de
proteínas e enzimas, indústria de
alimentos, análises clínicas,
diferentes áreas de pesquisa,
nutrição humana e animal,
ecologia, química de proteínas...
Quanta proteína
tem na minha
amostra?
Espectro eletromagnético
- (^) Espectro ultra-violeta
Espectro eletromagnético
- (^) Espectro visível
Natureza da luz
- (^) O movimento ondulatório é caracterizado pelo comprimento de onda (λ), o qual corresponde à distância linear entre duas cristas, medido em nanômetros (nm), que corresponde a 10-9^ m. A luz é uma forma de radiação eletromagnética que possui características de onda e de partícula (fóton).
Absorção da Luz
- (^) Todas as espécies (átomos, moléculas etc.), sejam coloridas ou não, absorvem algum tipo de radiação eletromagnética;
- (^) Moléculas que absorvem luz (UV ou visível) possuem muitos elétrons capazes de absorver energia que passam para um estado de maior energia;
Absorção da Luz
- (^) Deve-se utilizar um feixe de luz monocromática de comprimento de onda adequado, capaz de excitar o composto estudado, nos métodos de dosagem colorimétrica.
- (^) O procedimento para escolha do melhor comprimento de onda é simples e consiste em submeter uma solução com a substância de interesse a feixes de luzes monocromáticas de diferentes comprimentos de onda e verificar qual deles é mais absorvido pela solução.
Absorção da Luz - Cromóforos
- (^) Parte ou conjunto de átomos de uma molécula que absorvem na região do ultravioleta ou visível.
- (^) Também pode ser definido como uma substância que possui muitos elétrons que tem a capacidade de absorver energia ou luz visível (ressonância).
- (^) A presença desses grupos funcionais que contém muitos elétrons é responsável pela cor de uma molécula.
- (^) Entre os compostos cromóforos temos os que apresentam instaurações (ligações duplas ou triplas), como os alcenos, alcenos conjugados, alcinos, carbonilas, carboxila, amido, azo, nitro, nitroso, nitrato e aromáticos. Heme da hemoglobina
Espectrofotometia
Colorimétricos X Absorção Quantificação indireta: compara com curva padrão Quantificação direta: mensuração de ponto único Reação entre corante-amostra proporciona cor específica que pode ser mensurada utilizando luz visível. Proteína absorve luz UV Amostras impuras Amostras puras – acompanhamento de processos de purificação
- (^) Medida de absorção ou transmissão de luz em uma solução
- Utilizam a característica das moléculas de absorver a luz luz ultra-violeta e/ou visível (UV- Vis)
Métodos Espectrofotométricos
Lambert e Beer
- (^) Observou a relação existente entre a
transmissão e a concentração do meio
onde passa o feixe de luz
Beer A intensidade de um feixe de luz monocromático decresce exponencialmente à medida que a concentração da substância absorvente aumenta aritmeticamente ". I = Intensidade da luz transmitida Io = Intensidade da luz incidente k = Constante denominada coeficiente de absorção c = Concentração do meio absorvente
Medida da transmissão de
luz
fração da radiação transmitida através do meio
Transmitância (T): 𝑇^ =^
0 I 0 é a intensidade da luz incidente, I é a intensidade da luz transmitida, Absorbância (A):
fração da radiação absorvida através do meio
𝐴 = − log 𝑇 𝐴 =log 𝐼 0 / 𝐼
Absortividade molar (ε)
- (^) Ou coeficiente de extinção molar é a capacidade que um mol de substância em atenuar luz incidida em um dado λ;
- (^) Indica o quão fortemente uma substância absorve radiação num determinado λ;
- É uma propriedade intrínseca das substâncias.
- (^) A absortividade molar depende da substância, do comprimento de onda utilizado (pois substâncias podem ter diferentes absorções para diferentes comprimentos de onda), da temperatura e do solvente no qual estão dissolvidas.
- (^) A absortividade molar é obtida através de medidas espectrofotométricas.
Lei de Lambert-Beer
- (^) A fração da luz incidente absorvida por uma solução em um determinado comprimento de onda está relacionada à espessura da camada de absorção (comprimento do caminho) e à concentração da substância que absorve; A absorbância é proporcional à concentração da espécie química absorvente, sendo constantes o comprimento de onda, a espessura atravessada pelo feixe luminoso e demais fatores.