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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA CATARINA
CENTRO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS - CCB LABORATÓRIO MULTIUSUÁRIO DE ESTUDOS EM BIOLOGIA
REVISADO EM 26/07/
Protocolo padrão de técnicas histológicas animal
Para microscopia de luz
GERAL:
1 - Coleta e Dissecação 2 - Fixação 3 - Processamento (desidratação, diafanização e inclusão em parafina) 4 - Emblocamento 5 - Microtomia 6 - Coloração 7 - Montagem das Lâminas com Resina
PASSO A PASSO:
1) COLETA E DISSECAÇÃO
Se o órgão for muito grande deve-se fazer a macrotomia deste antes; Colocar as secções em cassetes e identifica-los a lápis.
2) FIXAÇÃO
Esta etapa consiste na utilização de substâncias que interrompam o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioquímicos intra e extracelulares, mantendo assim a arquitetura normal do tecido. Além disso, os fixadores também fornecem maior resistência ao tecido para suportar as demais etapas; Dependendo do tipo de análise deve-se optar por um fixador específico, por exemplo, para análise em microscopia de fluorescência, é muito utilizado o paraformaldeído tamponado. Neste caso não se deve utilizar o glutaraldeído, pois este gera autofluorescência. Para microscopia de luz branca o glutaraldeído é um ótimo fixador, mas pode-se utilizar também o paraformaldeído. A formalina tamponada também é utilizada para microscopia de luz branca, mas para uma análise histológica mais geral, não é indicada para análises mais detalhadas; O volume do fixador deve ser em torno de 20x o volume das amostras.
FIXADORES:
PARAFORMALDEÍDO 4% TAMPONADO – PH 7,2:
PFA (Paraformaldeído) .............................................. 12 g Água destilada ........................................................... 150 mL PBS 0,2M ................................................................... 150 mL Hidróxido de Sódio ..................................................... 2 pedrinhas ou 3 gotas (1N)
Preparo:
Aquecer a água destilada até 70°C, no misturador, colocar o imã (bailarina) e liga-lo, acrescentando aos poucos o PFA; Jogar duas pedrinhas ou mais de hidróxido de sódio ou de 3 a 5 gotas de hidróxido de sódio 1N até a mistura ficar clara e homogênea (transparente); Por último, acrescentar a solução de PB 0,2M; Medir o pH (pH ~ 7,2) e filtrar a solução.
Observações: O material deve permanecer no fixador de 12-24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação.
FORMALINA NEUTRA TAMPONADA – PH 7,2:
Formol 37% ................................................................. 100 ml Água destilada ............................................................. 900 ml Fosfato de Sódio Monobásico (1 H 2 O ) ......................... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (7 H 2 O ) .............................. 12,2 gramas
ou
Formol 37% ............................................................... 100 ml Água destilada ............................................................ 900 ml Fosfato de Sódio Monobásico (Anidro) ...................... 4,0 gramas Fosfato de Sódio Dibásico (Anidro) ............................ 6,5 gramas
Observações: O material deve permanecer no fixador por aproximadamente 24h; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação.
GLUTARALDEÍDO 2,5% TAMPONADO – PH 7,2:
Glutaraldeído 25% .................................................................. 5mL Tampão Fosfato de Sódio 0,1M ............................................. 45mL
Observações: O material deve permanecer no fixador de 4-24h; O Glutaraldeído não deve ser usado para testes de imunofluorescência; Lavar 3x em tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,2 (30 minutos) e em seguida em H 2 O destilada por 1 hora antes de iniciar a desidratação.
3º INCLUSÃO NA PARAFINA
Parafina I ___________________________ 3 horas Parafina II ___________________________ 3 horas Parafina III __________________________ 3 horas
Importante: A partir da etapa do álcool 70%, O LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Processador de Amostras Leica TP.
4) EMBOCAMENTO
Colocar a parafina no molde de metal e então posicionar a amostra de acordo com o corte que se pretende realizar (longitudinal, transversal...); Após os blocos estarem duros, esperar pelo menos 24 horas para iniciar o seccionamento. O ideal é colocar os blocos na geladeira antes de utilizá-los no micrótomo.
Importante: Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Emblocador de Amostras Leica EG1150H.
05) MICROTOMIA
Fazer os cortes de 5 a 10 micrômetros utilizando um micrótomo rotativo; Pegar a fita e colocar em água aquecida com gelatina a aproximadamente 45 °C, pegar o corte com a lâmina.
Solução para distender o corte no banho-maria
Gelatina em pó incolor _________________ 4 gramas Água aquecida (55ºC) ____________________ 2 litros
Observação: Antes da coloração, colocar previamente as lâminas em estufa entre 40 °C e 55 °C, ideal 50°C, ou placa aquecida para derretimento da parafina, por aproximadamente 1 hora. Isto ajuda a fixar o corte na lâmina.
Importante: Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Micrótomo Rotativo Leica RM.
06) COLORAÇÃO
Nesta etapa ocorre a desparafinização (retirada da parafina) dos cortes na lâmina, em seguida é realizada a hidratação para então ocorrer a coloração do tecido.
COLORAÇÃO H.E. (HEMATOXILINA E EOSINA)
Sequência: 1º - Xilol Puro I (desparafinização) __________________________ 10 minutos 2º - Xilol Puro II (desparafinização) __________________________ 10 minutos 3º - Álcool 100 % I (hidratação) _____________________________ 5 minutos 4º - Álcool 100% II (hidratação) _____________________________ 5 minutos 5º - Álcool 90% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 6º - Álcool 80% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 7º - Álcool 70% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 8º - Álcool 50% (hidratação) ________________________________ 5 minutos 9º - Água (hidratação) _____________________________________ 10 minutos 10º - Hematoxilina de Meyer (coloração) _______________________ 3 minutos 11º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ 10 minutos 12º - Eosina amarelada (coloração) ___________________________ de 8 a 20 minutos 13º - Água Corrente (lavagem) ______________________________ 1 minuto 14º - Álcool 70% (desidratação) _____________________________ 2 minutos 15º - Álcool absoluto I (desidratação) _________________________ 3 minutos 16º - Álcool Absoluto II (desidratação) ________________________ 3 minutos 17º - Xilol I (50% de Álcool100% e 50% de Xilol) _______________ 5 minutos 18º - Xilol II Puro (Fixação do corante e conservação do material) __ 10 minutos
Observação: Na última etapa (Xilol II) pode ficar mais que 10 minutos.
Importante: Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Sistema de Coloração de Lâminas Leica AutoStainer XL.
07) MONTAGEM DA LÂMINA COM LAMÍNULA
Sequência: 1º - Pingar 2 gotas de resina líquida (Entelan, Permount, Bálsamo do Canadá...); 2º - Colocar a lamínula sobre a lâmina; 3º - Pressionar levemente para tirar as bolhas; 4º - Levar as lâminas até a estufa para secagem ou deixar secando ao ar livre; 5º - etiquetar as lâminas.
Importante: Para esta etapa, o LAMEB disponibiliza, aos usuários cadastrados, o Aplicador de Lamínulas Leica CV5030.
