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Protocolo histologia, Notas de aula de Biologia

Protocolo de histologia atual com referências

Tipologia: Notas de aula

2025

Compartilhado em 09/05/2025

yara-silvino-sales-11
yara-silvino-sales-11 🇧🇷

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TÉCNICA HISTORRESINA/METACRILATO (25/09/2015)
Leica Historesin (7022 31731)
FIXAÇÃO
1. Coletar o material biológico e preparar as amostras, de acordo com os estudos, em
fragmentos de aproximadamente 2x3 mm.
No preparo da amostra deve se levar em conta o planejamento de se colocar o maior
número de fragmentos em um bloco e estes ficarem na posição de corte desejado. Para
tanto considere em preparar a amostra de forma que a face de corte tenha área maior que
a área de altura. O maior número de fragmentos em um bloco otimiza o trabalho.
2. Fixar em FAA 50% ou Karnovsky, até 48 h em recipiente com tampa. Ao iniciar a fixação
submeter o material a vácuo, 180 mmHg, sem a tampa na bomba de vácuo ou utilize uma
seringa.
DESIDRATAÇÃO
3. Desidratar as amostras em etanol. Se fixado em FAA 50% iniciar em solução de etanol 50%,
se em Karnovsky em etanol 10%.
Etanol 10% 1 hora (no mínimo)
Etanol 20% 1 hora (no mínimo)
Etanol 30% 1 hora (no mínimo)
Etanol 40% 1 hora (no mínimo)
Etanol 50% 1 hora (no mínimo)
Etanol 60% 1 hora (no mínimo)
Etanol 70% 1 hora (no mínimo)
Etanol 80% 1 hora (no mínimo)
Etanol 95% 1 hora (no mínimo)
Obs.: casos no laboratório em que a
desidratação é feita até o etanol 100%
Etanol 100% 1 hora (no mínimo)
INFILTRAÇÃO/EMBLOCAMENTO
4. PRÉ-INFILTRAÇÃO (solução 1)
Em um recipiente com tampa, de preferência eppendorf, coloque a SOLUÇÃO PRÉ-
INFILTRAÇÃO até cobrir as amostras por 2 à 48 horas, a temperatura ambiente ou na
geladeira ou freezer. Dependendo da amostra, tamanho/rigidez este tempo poderá ser
estendido.
A ferramenta de laboratório (pipeta/becker/agulha/pinça) utilizada que entrar em contato
com a solução deve ser limpa imediatamente com etanol 95%. Este procedimento deve de
ser executado nas outras etapas, infiltração e inclusão/emblocamento, nesta última
principalmente para evitar a polimerização de restos de metacrilato
5. INFILTRAÇÃO (solução 2)
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TÉCNICA HISTORRESINA/METACRILATO (25/09/2015)

Leica Historesin (7022 31731) FIXAÇÃO

  1. Coletar o material biológico e preparar as amostras, de acordo com os estudos, em fragmentos de aproximadamente 2x3 mm. No preparo da amostra deve se levar em conta o planejamento de se colocar o maior número de fragmentos em um bloco e estes ficarem na posição de corte desejado. Para tanto considere em preparar a amostra de forma que a face de corte tenha área maior que a área de altura. O maior número de fragmentos em um bloco otimiza o trabalho.
  2. Fixar em FAA 50% ou Karnovsky, até 48 h em recipiente com tampa. Ao iniciar a fixação submeter o material a vácuo, 180 mmHg, sem a tampa na bomba de vácuo ou utilize uma seringa. DESIDRATAÇÃO
  3. Desidratar as amostras em etanol. Se fixado em FAA 50% iniciar em solução de etanol 50%, se em Karnovsky em etanol 10%. Etanol 10% 1 hora (no mínimo) Etanol 20% 1 hora (no mínimo) Etanol 30% 1 hora (no mínimo) Etanol 40% 1 hora (no mínimo) Etanol 50% 1 hora (no mínimo) Etanol 60% 1 hora (no mínimo) Etanol 70% 1 hora (no mínimo) Etanol 80% 1 hora (no mínimo) Etanol 95% 1 hora (no mínimo) Obs.: há casos no laboratório em que a desidratação é feita até o etanol 100% Etanol 100% 1 hora (no mínimo) INFILTRAÇÃO/EMBLOCAMENTO
  4. PRÉ-INFILTRAÇÃO (solução 1) Em um recipiente com tampa, de preferência eppendorf, coloque a SOLUÇÃO PRÉ- INFILTRAÇÃO até cobrir as amostras por 2 à 48 horas, a temperatura ambiente ou na geladeira ou freezer. Dependendo da amostra, tamanho/rigidez este tempo poderá ser estendido. A ferramenta de laboratório (pipeta/becker/agulha/pinça) utilizada que entrar em contato com a solução deve ser limpa imediatamente com etanol 95%. Este procedimento deve de ser executado nas outras etapas, infiltração e inclusão/emblocamento, nesta última principalmente para evitar a polimerização de restos de metacrilato
  5. INFILTRAÇÃO (solução 2)

Retorne a SOLUÇÃO PRÉ-INFILTRAÇÃO para o recipiente de estoque (se a solução estiver amarelada despreze-a), retire as amostras do eppendorf e elimine o excesso desta solução com o auxílio de papel higiênico, recoloque as amostras no eppendorf. Cubra as amostras com SOLUÇÃO INFILTRAÇÃO por 24 h à 48 h a temperatura entre 4 Cº(geladeira) a -10 Cº (freezer).

  1. INCLUSÃO ou EMBLOCAMENTO (polimerizador/hardener) – ver PAIVA 2011. Utilizando um HISTOMOLD limpo e seco enchê-lo até a borda com SOLUÇÃO DE EMBLOCAMENTO (mantenha o histomold e solução de emblocamento sobre gel de gelo, a baixa temperatura retarda a polimerização, evite a condensação de água). Retirar a amostra a ser emblocada da solução de infiltração, com o auxílio de papel higiênico absorver o excesso desta solução. Mergulhar a amostra na SOLUÇÃO DE EMBLOCAMENTO que está no HISTOMOLD orientando-a para a posição de corte. Enrole o conjunto de emblocamento (histomold/solução de emblocamento/amostra) em filme de PVC para impedir o contato com água (condensação), deixe-o a temperatura de - 10 Cº (freezer) por 48 horas no mínimo (há casos no laboratório do conjunto ficar uma semana ou mais). A baixa temperatura retarda a polimerização do metacrilato dando tempo da solução de emblocamento penetrar nas células. Se não tiver mais amostras no eppendorf retorne a SOLUÇÃO INFILTRAÇÃO para o recipiente de estoque (se a solução estiver amarelada despreze-a), caso ainda tenha peças no eppendorf guarde-o no freezer ou geladeira (esta com o tempo poderá se polimerizar se).
  2. Após retirar do freezer o conjunto de emblocamento (histomold/solução emblocamente/amostra) retire o filme de PVC e verifique se a amostra está na posição para corte. Submeta o conjunto à estufa de até 60º C para que a polimerização seja feita mais rapidamente. Outra forma é manter o conjunto a temperatura ambiente tampado com papel até o completo endurecimento.
  3. Desenforme o bloco de resina. Lixe a face que será colada no suporte para corte (bloco de madeira) de forma a ficar plano, otimizará a colagem do bloco de resina com o bloco de madeira. Use cola do tipo Super Bond.
  4. Faça cortes em micrótomo entre 5 a 6 micrômetros. SOLUÇÕES Kit Leica Historesina (7022 31731)  Resina base (metacrilato) – 500ml  Ativador (dibenzolperoxide) – 10 packets de 0,5 g  Polimerizador (hardener) SOLUÇÃO PURA (solução 3) – solução estoque de uso resina base 50 ml ativador 1 packet de 0,5g Obs.: usada para preparo da solução emblocamento. Guardar a 4º C.