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ESCOLA SUPERIOR DE TECNOLOGIA DA SAÚDE DE LISBOA
Projeto Laboratorial de Bioquímica I Cursos de CBL, de DTN e de FM PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS (Grupos de 2- 3 alunos) OBJECTIVO GERAL Purificar e caracterizar parcialmente o enzima lisozima da clara do ovo. OBJECTIVOS ESPECÍFICOS Espectrofotometria de comprimento de onda fixo, cinética, e espectral; Cromatografia de troca iónica; Electroforese em gel de poliacrilamida contendo SDS; Centrifugação diferencial; Potênciometria; Vórtex. INTRODUÇÃO O estudo de uma proteína implica a obtenção da proteína isolada. A purificação de proteínas é um processo laboratorial que incluí uma enorme variedade de tecnologias e metodologias bioquímica. Os enzimas são catalisadores de natureza proteica verdadeiramente notáveis. Por exemplo, a catalase pode realizar a decomposição de H 2 O 2 a 5x10^6 moles por minuto por mole de enzima ( turnover number
- kcat). Neste trabalho vai-se purificar um enzima, medindo a sua atividade enzimática para acompanhar o processo. O isolamento e purificação duma proteína ou enzima específico é geralmente uma tarefa difícil. Primeiro, o enzima deve ser libertado do tecido de origem mantendo-se activo. O enzima a ser purificado é normalmente apenas uma pequena percentagem da proteína total no extrato bruto do tecido. Os objectivos da purificação de proteínas são a remoção de contaminantes não proteicos e isolamento progressivo da proteína em questão. Uma única etapa de purificação raramente é suficiente para purificar um enzima completamente. Normalmente, vários tipos de processos que exploram diferentes propriedades das proteínas devem ser utilizados. Geralmente, tanto a precipitação com sais (designado de salting out ), a precipitação por solventes orgânicos ou a precipitação isoeléctrica são usados no início do processo. Processos cromatográficos, tais como troca iónica, filtração em gel ou cromatografia de adsorção, são utilizados depois do enzima ser parcialmente purificado por uma das técnicas de precipitação. Infelizmente, o estabelecimento de um processo de purificação da enzima tem ser feito em grande parte por tentativa e erro. Por isso, a avaliação do progresso de um processo de purificação é muito importante. A quantidade de proteína total presente em cada etapa é um dos
parâmetros que tem de ser medido. Pode ser feito recorrendo a qualquer método de doseamento de proteínas adequado. O segundo parâmetro A atividade total e atividade específica são os parâmetros críticos na purificação da enzima. A atividade total de um enzima é definida em determinada unidade, geralmente concentração de produto formado por tempo (por ex. μM.min-^1 ) ou mesmo em quantidade de produto formado por tempo (μmol.min-^1 ). Se o método de deteção de atividade total for espectrofotométrico, implica a utilização da equação da Lei de Lambert-Beer, podendo dar-se o caso do coeficiente de absorção ser desconhecido. Nesse caso, pode-se utilizar ∆A/∆t em vez da atividade em concentração ou em quantidade por tempo. A atividade específica é definida a partir da atividade total dividindo pela massa de proteína total presente. Como o enzima vai sendo purificado, a proteína inactiva é removida sucessivamente e consequentemente a atividade específica vai aumentando. Com os valores de proteína total, atividade total e atividade específica de amostra nos vários passos de purificação, são calculados a %recuperação, a %rendimento e o grau de purificação. A proteína que se vai purificar nesta experiência é o enzima lisozima. Foi um dos primeiros enzimas a ter determinada a sua estrutura tridimensional por difração de raios X. Existe no ovo, no leite, nas lágrimas, no baço e em muitos outros tecidos, incluindo fontes vegetais. O nome sistemático para a lisozima é "mucopeptido N-acetil-muramil-hidrolase". A lisozima catalisa a hidrólise de ligações β- 1,4 entre o ácido N-acetilmurâmico e 2-acetamida- 2 - desoxi-D-glucose em mucopolissacáridos ou mucopéptidos de uma variedade de microorganismos. O enzima lisozima desempenha uma função de antibiótico para os organismos que as têm. Esta acção é atribuída à capacidade de destruir bactérias invasoras por hidrolisar os mucopolissacáridos da parede celular. A clara de ovo é particularmente rica em lisozima e, portanto, será a matéria-prima para a sua purificação. A lisozima (14,3kDa) tem uma massa molar inferior à das outras proteínas presentes na clara de ovo e, portanto, uma purificação considerável pode ser alcançada por filtração em gel simples que separa as proteínas com base no tamanho. Além disso, o facto da lisozima ter um pI anormalmente elevado de 10,5, também pode ser explorado através de cromatografia de troca iónica. Além disso, a lisozima é um enzima notavelmente estável e mantém a atividade catalítica, mesmo após o armazenamento por vários dias em temperatura ambiente. Estas características pouco usuais aliadas ao facto de que uma importante fonte de proteína é mais barata obtida na mercearia local
TAREFA 1 – CÁLCULOS E PREPARAÇÃO PARA A CROMATOGRAFIA
MATERIAL:
15 tubos de ensaio de 10mL; 1 suporte de tubos de ensaio; 1 micropipeta automática de 1000; 1 caixa de pontas azuis; 2 copo de reacção de 20 0mL; 1 copo de reacção de 500 mL para lixo; 1 coluna de cromatografia; Proveta graduada de 50mL; Balões volumétricos de 50, de 100 e de 250mL; 1 gaze 1 0x 2 0cm; 2 molas de roupa; Placa de aquecimento; Elétrodo de pH; Centrífuga de bancada; Espectrofotómetro UV/Vis e cuvettes UV e cuvettes Vis REAGENTES Tris [hidroximetil] aminomethane (Tris base) - MW 121,1g/mol Cloreto de sódio (NaCl) - MW 58,44g/mol Di-hidrogeno fosfato de potássio (KH 2 PO 4 hidratado) - MW 136,1g/mol Hidrogeno fosfato de sódio (Na 2 HPO 4 hidratado) - MW 142g/mol Bicarbonato de sódio (NaHCO 3 ) - MW 86,0g/mol H 2 O CM-Sephadex C HCl NaOH
Soluções: Eluente #1 - Tris-NaCl: Tris Base 0,05 M, NaCl 0,05 M (pH 8,2) Prepare 250 mL de Tampão de coluna Tris-NaCl para equilibrar e executar sua cromatografia de troca iónica em coluna. Acerte o pH com HCl antes de ajustar o volume para 250 mL. Eluente #2 - tampão carbonatos (pH 10,5): Prepare 50 mL de 0,2 M bicarbonato de sódio (NaHCO 3 ) para executar sua cromatografia de troca iónica em coluna. Ajustar o pH com NaOH. Note-se que o pH deste tampão é fundamental para o sucesso da sua experiência. CM-Sephadex C50: Prepare 200mL de 0,2% (m/v) de CM-Sephadex C50. Deixe hidratar os 200 mL durante 1 h, em "banho-maria" fervente. Após arrefecer, decantar a água e adicionar 100 mL do tampão Tris-NaCl (ver acima). Agite delicadamente e deixe o gel sedimentar. Decante a fase líquida e repita. Decante a fase líquida, mas deixe um volume aproximadamente igual ao de gel de CM-Sephadex. Preparação da coluna de cromatografia de troca iónica Lave a sua coluna e depois enxague com água destilada. Verifique que tem placa crivosa ou lã de vidro. Certifique-se que a água passa através da coluna. Coloque um funil na parte superior da coluna para introduzir o gel. Coloque a tampa inferior amarela de modo a fechar a saída da coluna. Preencha cerca de 1/4 da coluna com tampão Tris-NaCl 0,05M. Adicionar suficiente CM-Sephadex para preencher cerca de metade da coluna. Tire a tampa inferior amarela e deixe escorrer. Continue a adicionar o CM- Sephadex até que a coluna fique preenchida com cerca de 4 cm (zona estreita, ver figura). NÃO permitir que em algum momento o nível de tampão desça abaixo do nível do gel, ou a coluna quebra- se e não funcionará. Se necessário, remova o excesso CM-Sephadex com uma pipeta Pasteur. Preencher a coluna com tampão e deixe correr por cerca de 15 minutos ou até esgotar o eluente #1. Deve conseguir recolher 20 gotas de eluente em cerca de 2 minutos. É importante quantificar e anotar o volume das 20 gotas. Em seguida, feche a coluna com as duas tampas e reserve.
- Numa caixa de cuvettes de espectrofotómetro (UV), alinhe o mesmo número de cuvettes que de tubos de fração recolhidas.
- Assim que tiver uma fração de 20 gotas recolhida, transfira-as para uma cuvette UV e vá medir e anotar a Absorvência a 260 e a 280nm.
- Proceda assim até que a A260 e a A280nm seja inferior a 0,100. Quando acontecer, coloque a tampa inferior amarela na coluna para parar o fluxo.
- Mantenha todas as cuvettes alinhadas na caixa.
- Com uma pipeta de Pasteur, retire o resto de eluente #1 do topo da fase estacionária com cuidado para não tocar na superfície da fase estacionária.
- Com outra pipeta de Pasteur, substitua o eluente #1 pelo eluente #2 (tampão carbonatos pH 10,5). Tenha o mesmo cuidado que anteriormente.
- Retire a tampa amarela e recomece a recolher frações de 20 gotas e a ir medir a A260 e a A280nm até que seja inferior a 0,100.
- Mantenha todas as cuvettes alinhadas na caixa.
- Transfira a totalidade do conteúdo das cuvettes para tubos de Eppendorf marcados e guarde a
- 20ºC, se não for medir a actividade enzimática.
- Certifique-se de também determinar a A260 e a A280nm, para a clara de ovo tamponada, diluindo, se necessário, como descrito na nota técnica abaixo. Notas técnicas: As concentrações de proteína da clara de ovo e mesmo de algumas frações de coluna, podem ser grandes demais para determinar quantitativamente. Assim, deve-se preparar diluições das amostras com A 280 > 1,5. Anote as diluições efectuadas para mais tarde introduzir nos cálculos. Necessita de 2 cuvettes UV cheias com o eluente #1 e 2 com o eluente #2 para servir de brancos do espectrofotómetro. Tratamento de resultados:
- Já determinou a A 260 e A 280 para todas as frações da coluna e para a clara de ovo diluída. Use a equação de Warburg-Christian: [proteína]/(mg/mL) = (1.55xA 280 )-(0.76xA 260 ) para determinar a concentração de proteína para cada fração e para a clara de ovo tamponada. Certifique-se de corrigir as concentrações de proteína com os factores de diluição, se necessário.
- Elabore uma tabela com todos os resultados, como por exemplo: Fração A260 A280 Volume da fração/mL Factor de diluição [proteína]/(mg/mL) Clara de ovo diluída Fração 1 Fração 2 ….
- Em papel milimétrico, construa o cromatograma ([proteína] vs fracção). Não inclui a clara de ovo diluída.
Tratamento de resultados:
- Inclua os valores de ∆A/∆t (min-^1 ) medidos na tabela da tarefa anterior.
- A partir dos valores das atividades (ΔA/Δt) da clara de ovo e das várias frações da coluna, calcule o valor da actividade definida em Unidades (U). 1U = - 0.001 de ΔA/Δt.
- Calcule a quantidade de Proteína Total em cada fracção em mg.
- Calcule a atividade específica, definida em U/mg de proteína.
- Calcule o rendimento proteico, expresso em %.
- Calcule a recuperação de actividade enzimática, expressa em %.
- Calcule o grau de purificação conseguido.
- Construa a tabela da purificação Fração Atividade/U Proteína total/mg Atividade específica/(U/mg) Rendimento/% Recuperação/% Purificação Clara de ovo diluída Fração promissora 1 Fração promissora 2 ….
TAREFA 5 – QUANTIFICAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO PROTEICA DAS FRAÇÕES E DA
CLARA DE OVO PELO MÉTODO DE BRADFORD
OBJECTIVO: Construir uma reta de calibração para determinar a concentração proteica das frações de coluna. As frações obtidas anteriormente têm de ser quantificadas rigorosamente em termos de proteína. O método de Warburg-Christian empregue na parte TAREFA 3 não é suficientemente rigoroso pois sofre contaminação pela presença de ácidos nucleicos. Iremos, assim, utilizar o método de Bradford para quantificar a concentração de proteínas da clara de ovo e das frações de coluna obtidas. INTRODUÇÃO A espectrofotometria do visível (colorimetria) é uma tecnologia muito utilizada em Bioquímica pois permite detectar e quantificar substâncias que existem em baixas concentrações numa mistura complexa. A detecção ou identificação de uma substância baseia-se no facto das moléculas possuírem um espectro de absorção característico. A utilização deste método para quantificar substâncias baseia-se na propriedade descrita pela Lei de
Lambert-Beer: A=Elc ou A=elc. Em que A é a absorvência da solução a determinado
comprimento de onda (λ) e não tem unidade. O λ a utilizar é escolhido após a realização dum espectro de absorção. c é a concentração da substância que absorve ao comprimento de onda utilizado. E é uma constante específica de cada soluto que absorve radiação e tem unidades que dependem da unidade de concentração ( c ). Por exemplo, se c tiver unidades de mg/L, como A é adimensional, E terá unidade de (mg/L)-^1 .cm-^1 e designa-se coeficiente de absorção específico. Se c tiver unidades de molar (M), então ficará M-^1 cm-^1 e chamar-se-á coeficiente de absorção molar (e em vez de E). l é o percurso óptico (distância percorrida pela luz quando atravessa a amostra), normalmente 1cm (largura da cuvette ). Matematicamente, a lei de Lambert-Beer diz-nos que a absorção de radiação de um determinado λ é proporcional à concentração do soluto. Concretamente, sabendo a absorvência de uma determinada substância, ao comprimento de onda em que se mede a absorção, podemos calcular a sua concentração e vice-versa. Geometricamente, e constituí o declive duma recta em que as ordenadas são “ A ” e as abcissas são “ c ” e que a ordenada na origem não existe (y = mx + 0). O Método de Bradford é simples, rigoroso e rápido por isso mais o indicado para a detecção e quantificação de proteínas solubilizadas em meios sem detergentes. O método possui uma grande estabilidade colorimétrica, com pouca ou nenhuma interferência de sais. O r ea g e n t e d e B r a d f o r d c o n t é m c o m o s e u
Reagentes: 1 - Albumina de soro bovino (BSA) 2 - Amostras desconhecidas (frações de coluna). H 3 PO 4 85% Azul de Coomassie Brilliant Blue G H 2 O Soluções: 1mL de solução padrão de BSA 0.1% (m/v) Reagente de Bradford:
- Preparar 50 mL de uma solução metanólica 0. 1 % (m/v) de Azul de Coomassie BBG 250.
- Adicionar 100 mL de ácido fosfórico 85% (m/m).
- Adicionar 350 de água e dissolver.
- Aferir o volume para 1000mL
- Filtrar o volume aferido com papel Whatman nº1. Guardar a 4ºC protegido da luz. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
- Coloque 6 tubos em fila consecutiva (reta de calibração) e mais outra fila com três tubos: Clara de ovo diluída: fração 1 e fração prometedora.
- Adicionar os volumes da solução padrão de BSA aos 1 tubos, de acordo com a tabela.
- Adicionar água até perfazer 100 μL, de acordo com a tabela.
- Adicionar em Vórtex 1000 μL de reagente de Bradford a cada tubo de ensaio, de acordo com a tabela.
- Em paralelo aos pontos 2, 3 e 4, adicionar 25 μL de cada fração de coluna, de água e de Reagente de Bradford, de acordo com a tabela.
- Incubar 2 minutos a temperatura ambiente (RT).
- Transferir as soluções para cuvettes Vis, respeitando a ordem.
- Ler a absorvência das cuvettes a 595nm. Se algum valor de absorvência der superior a 1,5 de deve-se diluir 10x e voltar a medir.
- Preencher a tabela.
- Efetuar os espectros de absorção entre 400 e 700nm das cuvettes da reta de calibração. Imprimir o gráfico.
Tratamento de resultados:
- Calcular as concentrações de BSA em cada um dos 6 tubos iniciais em μg/μL
2. Representar em papel milimétrico os 6 pontos iniciais (A 595 vs [BSA])
- Traçar a recta de regressão linear com uma régua.
- Calcular o coeficiente de absorção específico.
- Calcular a concentração das soluções desconhecidas, corrigindo se tiver havido diluição. CURVA DE CALIBRAÇÃO Cuvette 1 2 3 4 5 6 Clara de ovo diluída Fração 1 Fração prometedora BSA 0.1% (m/v) (μL) 0 3 5 10 15 20 25 * 25 * 25 * Água (μL) 100 97 95 90 85 80 qbp 100 qbp 100 qbp 100 Bradford (μL) 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 1000 A595nm *Estes valores podem ser alterados se necessário. Nota técnica: amostras com absorvência superior a 1,5 devem ser diluídas com água e medidas, sendo a concentração real obtida por correcção da diluição.
vs. Rf (distância migrada pelo polipéptido em causa no gel de separação a dividir pela distância migrada pela frente de migração). Este gráfico é aproximadamente linear. A aplicação usual da técnica de SDS-PAGE é a separação e determinação aproximada de massas moleculares de polipéptidos. As unidades utilizadas para a massa molar de proteínas é o kDa (o Da – Dalton, é sinónimo de g/mol). Outra aplicação para o SDS-PAGE é o finger-printing de proteínas (ou mapa peptídico), que permite estabelecer relações de filogenéticas entre organismos diferentes. As similaridades do padrão electroforético obtido serão maiores quanto mais próximos forem os organismos analisados. Outra aplicação, mais fina é o método de SDS-PAGE 2D. É muito semelhante ao método referido, mas é mais eficiente na separação de proteínas provenientes de amostras biológicas. É uma técnica muito produtiva porque permite a separação de centenas de proteínas e permite a monitorização específica da expressão genica. Noutro contexto, se se separar num gel, uma mistura tratada com SDS e a mesma mistura não tratada com SDS nem com agentes redutores, pode-se inferir sobre a existência de estruturas quaternárias. MATERIAL E REAGENTES Material: Sistema de electroforése Mini Protean 3 (ver figura) Tubos de Eppendorf 1.5mL Suportes de tubos Eppendorf 1.5mL Pipetas automáticas e pontas de 1000; 200; 20 μL Banho seco a 100ºC Fonte de tensão BioRad
Papel de filtro, Gobelets vários Reagentes:
- TEMED;
- Perssulfato de amónio (APS) 10% (m/v);
- H 2 O;
- etanol 70% e 35% m/m em água;
- Tampão de Laemmli 2x (Tris-HCl, pH6.8, 120mM; SDS, 4% (m/v); Glicerol 20% (v/v); Azul de bromofenol 0.02% m/v; DTT 8.5mg/mL)
- 10 mL de solução 1 2 % (m/v) de acrilamida-bis com Tris-HCl 0,375M pH8.8, SDS 0,1% (m/v)
- Solução 5 % (m/v) de acrilamida-bis com Tris-HCl 0,125M pH6.8, SDS 0,1% (m/v)
- Tampão de electroforese (10x): 1000 mL de 3% (m/v) de Tris base, 14, 4 % (m/v) de glicina, e 1 % (m/v) de SDS. O pH do tampão deve ser 8.3 e não deve ser necessário ajustar pH
- Marcadores proteicos de Massa Molar
- Frações de coluna (solução de clara de ovo, fração 1 e fração prometedora)
- Solução de coloração: Azul de Coomassie Brilliant Blue R250 0.25% (m/v) dissolvido em 50% (v/v) CH 3 OH, 10% (v/v) de CH 3 COOH, 40% (v/v) H 2 O
- Solução de descoloração: 50% (v/v) C 2 H 5 OH, 10% (v/v) de CH 3 COOH, 40% (v/v) H 2 O PROTOCOLO EXPERIMENTAL Preparação de gel de SDS-PAGE Enchimento das Placas: Gel de separação:
- Colocar uma placa fina e uma grossa em cima de uma folha de papel zigzag.
- Esfregar com etanol 70% até evaporar.
- Montar as placas nas molas
- Montar as molas com as placas no suporte de enchimento
- Transferir 10mL de Solução 1 2 % (m/v) de acrilamida-bis para um gobelet
- Adicionar 10 0μL de APS 10%
- Agitar
- Adicionar 4 μL de TEMED
REALIZAÇÃO DA SDS-PAGE
- Retirar o pente do gel e montar as placas no suporte de electroforese
- Inserir na tina
- Deitar tampão de electroforese no reservatório central até ao topo
- Deitar tampão de electroforese no reservatório central até mesmo nível do reservatório central
- Aplicar as amostras no gel (para o gel de 0.75mm, não ultrapassar os 20μL por poço)
- Ligar à fonte de tensão
- Correr a 50 mA constante por gel (libertar a V) até que o azul de bromofenol apareça perto do fundo das placas.
- Retirar o gel com uma faca de plástico (nunca usar metal).
- Corar o gel com solução de Azul de Coomassie Brilliant Blue R250 durante 45s no micro- ondas. Deixar incubar à temperatura ambiente por mais 10 min.
- Reservar a solução corante e limpar o gel com água para remover restos de corante. Descartar a água.
- Incubar o gel com a solução descorante durante 45s no micro-ondas. Deixar incubar à temperatura ambiente até a revelação estar completa.
- Fotografar Tratamento de resultados:
- Sobre a fotografia impressa, calcular todos os Rf dos marcadores de massa molar. Usar as massas molares fornecidas para construir um gráfico de curva de calibração de logMW vs Rf.
- Utilizar a curva de calibração para estimar a massa molar dos polipéptidos de interesse.
- Comparar os perfis electroforéticos obtidos. BIBLIOGRAFIA
- Berg J.M., Tymoczko J.L., Stryer L, (2015). “Biochemistry”. Chapter 3. 8ª Ed. WH Freeman and Co. New York.
- Bradford, M. M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry 72 : 248 - 254.
