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RESUMÃO PROCESSOS BIOTECNOLÓGICOS INDUSTRIAIS
PRINCÍPIOS BÁSICOS DE ENGENHARIA GENÉTICA
DNA – ESTRUTURA
No DNA, as cadeias estão enroladas uma sobre a outra de maneira regular, requerendo cerca de dez nucleotídeos em cada volta completa dessa hélice dupla. O que diferencia dois DNAs de origens diferentes é o valor característico da relação (A+T) / (C+G), que é constante dentro de uma espécie. DNA - REPLICAÇÃO a) O DNA é a única molécula capaz de sofrer autoduplicação. b) A duplicação do DNA ocorre sempre quando uma célula vai se dividir. c) Ocorre durante a fase S da interfase. d) É do tipo semiconservativa (preserva a natureza de metade do nosso DNA original), pois cada molécula nova apresenta uma das fitas vinda da molécula original e outra fita recém sintetizada. Acontece com qualquer célula viva, ele é a base para que outras células sejam produzidas a partir de uma, que acontece desde bactérias até as células de seres vivos eucariontes superiores, como nós humanos. Esse processo de duplicação de DNA mediado por enzimas e a mais importantes delas é a DNA sintetase, essa enzima tem a propriedade de conhecer cada uma das bases na estrutura de DNA e fazer a complementação com a fita correspondente.
TRANSCRIÇÃO
a) Um fragmento de DNA (gene) (geralmente encontrado no núcleo das células, quando não tem núcleo ele está no próprio citoplasma) é utilizado como molde para confeccionar moléculas de RNA (sigla, em inglês, de ribonucleic acid). b) Gene: É um trecho do DNA que pode ser transcrito em RNA. c) Os RNA’s formados podem ser de três tipos:
- RNAm (mensageiro)
- RNAt (transportador)
- RNAr (ribossômico) DNA: citosina, guanina, adenina, timina RNA: citosina, guanina, adenina, uracila TRANSCRIÇÃO – SPLICING Uma vez que o processo de transcrição é feito (a fita de RNA-m é formada), há a necessidade de se produzir um gene, e após a produção do RNA-m, existe um fenômeno chamado Splicing. Nós sabemos que o nosso DNA, tem regiões que são codificadoras (chamadas éxons), ou seja, existem lá mensagens que vão fazer comandos do núcleo para a célula, e outras regiões que não codificantes (chamadas íntrons), somente as partes codificantes são mantidas na fita de RNA-m final. A partir do splicing, tem-se a retirada das regiões íntrons, ficando-se apenas os éxons, e nosso mRNA fica contendo apenas éxons.
PARTICIPANTES DA TRADUÇÃO
Nesse fenômeno, dependemos de uma simples complementariedade entre as bases nitrogenadas, caso a base nitrogenada for alterada, a proteína também será alterada. A nossa biotecnologia ela se baseia nesse processo, estudando aonde se pode alterar a sequência de bases de RNAm produzindo proteínas que se tem interesse. RNA mensageiro ou RNA-m: responsável por levar a informação contida em um gene pra os ribossomos. É uma cópia de um trecho de uma das fitas do DNA, com substituição da base timina (T) por uracila (U). RNA transportador ou RNA-t: transporta os aminoácidos correspondentes aos códigos presentes na fita de RNA-m para a síntese de proteínas. DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR DNA define a sequência do RNA. RNA define a sequência das proteínas. DNA é capaz de definir sua própria síntese. O fluxo da informação é do DNA para proteína. Com uma sequência de nucleotídeos dos ácidos nucléicos, conseguimos definir a sequência de aminoácidos da proteína. RNA também pode dirigir a síntese de proteína. Com base na imagem: O DNA é capaz de replicar a si mesmo, e que a partir da transcrição o DNA pode produzir o RNA, e a partir delas no fenômeno de tradução produz as proteínas. Proteínas podem ser, estruturais ou enzimas (que realizam catalise), as enzimas produzem todas as proteínas que o corpo humano necessita, seno carboidratos, lipídeos etc. Transcrição reversa, acontece apenas em alguns vírus. (RNA-DNA) Exemplo: vírus HIV.
VIDEO AULA 2 – TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE
Essa tecnologia foi desenvolvida a partir da década de 70 quando foram descobertas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição. Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA, considerando sequências específicas, com a perpetuação de tal sequência in vivo. CONCEITOS DE CLONAGEM Seres vivos simples, como bactérias elas são produzidas por meio de fissão binária (aquela reprodução onde uma célula se transforma em duas idênticas), esse processo se baseia nessa reprodução de fissão binária das bactérias. A origem do termo clonagem vem da genética bacteriana. A técnica central do DNA recombinante é a clonagem molecular. Consiste no isolamento e propagação de moléculas de DNA idênticas. A introdução de características que nós desejamos em bactérias como fragmentos de DNA, podem ser facilmente copiadas, visto que essas células têm uma forma de reprodução muito simples, e dentro dessas bactérias que produzimos também moléculas, já que seu aparato bioquímico é idêntico ao nosso. Uma vez que temos o mesmo aparato bioquímico e as ferramentas para isso como os ribossomos, conseguimos por meio das enzimas de restrição isolar, inserir em uma célula que chamamos de vetor e fazer sua propagação em moléculas idênticas. ESTÁGIOS DA CLONAGEM MOLECULAR Para fazer uma clonagem, precisamos seguir algumas etapas: O vetor, em termos de engenharia genética (bacteriana), o vetor seria uma pequena molécula de DNA circular, que é conhecido também como plasmídeo, o plasmídeo ele é uma forma de DNA que as bactérias tem disponível para fazer uma troca de informação genética, mas não chega a ser uma reprodução em si, apenas uma troca de informação que geralmente está ligada a sua resistência e a sua virulência (capacidade de causar danos, infecção).
A partir da década de 70 é utilizada pelo método de CRISPR. Além da endonucleases de restrição, existem também a DNA ligase, que sem ela não era possível fazer essas técnicas. DNA ligase é uma enzima de adesão de DNA. Se dois pedaços de DNA tiverem terminações complementares, a ligase pode ligá-las para formar uma molécula de DNA única e contínua. DNA polimerase é a enzima que faz a multiplicação da molécula de DNA (replicação). Transcriptase reversa ela faz o processo inverso, geralmente em vírus, a partir disso que eles infectam as nossas células (RNA-DNA), exemplo vírus HIV. Polinucleotídeo quinase é usada para transferir o fosfato gama do ATP para o grupo 5’OH livre na extremidade da molécula de DNA ou RNA. Essa enzima tem também uma atividade fosfatásica. Terminal transferase: catalisa a adição de desoxinucleotídeos às extremidades 3'-OH de uma fita dupla de DNA. Exonuclease III: Remove resíduos de nucleotídeos das extremidades 3’ - OH de uma fita de DNA. Fosfatase alcalina (FA) é definida como uma hidrolase, ou seja, uma enzima que possui capacidade de retirar grupos de fosfato de uma distinta gama de moléculas, abrangendo nucleotídeos, proteínas e alcaloides. Como indica o próprio nome, esta enzima é mais ativa em soluções alcalinas. Existem três tipos de endonucleases de restrição: I, II e III;
- I e II geralmente grandes complexos com múltiplas subunidades contendo tanto a atividade endonucleásica como metilase; sua clivagem é aleatória; - III cliva o DNA a cerca de 25pb (pares de bases) da sequência de reconhecimento. Há 2 tipos distintos de clivagens: - Extremidades abruptas: os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequência específica. - Extremidades coesivas: os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria.
EcoRI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI.
- Hind III é isolada da Haemophilus influenzae, linhagem d III.
CONSTRUÇÃO DO DNA RECOMBINANTE
A função das ligases na célula é reparar quebras em fitas individuais, que surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA. Ela atua na clonagem molecular unindo o fragmento de interesse ao vetor utilizado, formando um híbrido vetor/fragmento. Se eu conseguir fazer o corte do fragmento que eu tenho interesse, mas eles não tem uma extremidade coesiva. Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).
TRANSFORMAÇÃO BACTERIANA
As bactérias e o vetor são misturados com uma solução de cloreto de cálcio seguido de um choque térmico de curta duração. Os íons cálcio têm a função de neutralizar as cargas do DNA e da membrana bacteriana, facilitando a passagem do vetor pela membrana no momento do choque térmico.
VETORES USADOS EM ANIMAIS
- Lipossomos
- Retrovírus (integram seu DNA ao do hospedeiro) - Transcriptase reversa (RNA – DNA) e integrase; - Retrovírus: sequências LTR e ψ e gene exógeno; - Vírus assistentes : Genes gag,pol e env (sem ψ – requerida para o empacotamento)
- Adenovírus
- Microinjeção pronuclear
- Transferência de genes por bombardeamento de partículas (biobalística) IMPORTÂNCIA DA APLICAÇÃO DESSATÉCNICAS **- O fim da seleção artificial
- Xenotransplante
- Biorreatores
- Terapia gênica**
