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Um estudo aprofundado sobre a produção de nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano, utilizando o método de temperatura de inversão de fases (pit). Aborda a caracterização físico-química das nanoemulsões, incluindo tamanho de gota, índice de polidispersidade e turbidez, além de avaliar a estabilidade e a liberação dos compostos voláteis do óleo essencial. O estudo também investiga a atividade antibacteriana e antioxidante das nanoemulsões, tanto in vitro quanto em patê de frango, e analisa a influência da adição das nanoemulsões nas características organolépticas do patê.
Tipologia: Teses (TCC)
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Tese apresentada à Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos
Área de concentração: Ciências da Engenharia de Alimentos
Orientadora: Profª Drª Samantha Cristina de Pinho
Co-orientadora: Profª Drª Andrezza Maria Fernandes
Óleo essencial de orégano nanoemulsionado: produção, caracterização físico-química, atividade antimicrobiana e antioxidante in vitro e aplicação em patê de frango
Tese apresentada à Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos da Universidade de São Paulo, como parte dos requisitos para a obtenção do Título de Doutora em Ciências do Programa de Pós-Graduação em Engenharia de Alimentos
Área de concentração: Ciências da Engenharia de Alimentos
Orientadora: Profª Drª Samantha C. de Pinho Co-orientadora: Profª Drª Andrezza M. Fernandes
Data de aprovação: 08 de junho de 2017.
Banca Examinadora:
Profa. Dra. Samantha Cristina de Pinho (Orientadora) Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA/USP)
Profa. Dra. Ana Silvia Prata Soares Faculdade de Engenharia de Alimentos (FEA/UNICAMP)
Prof. Dr. Rodney Alexandre Ferreira Rodrigues Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas (CPQBA/UNICAMP)
Prof. Dr. Marco Antonio Trindade Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA/USP)
Profa. Dra. Ana Maria Centola Vidal Instituição: Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA/USP)
Dedicatória
Dedico esta tese aos meus queridos pais, Dulcineia e Nivaldo, por todo esforço e dedicação para que eu pudesse realizar este trabalho. A melhor parte de mim são vocês.
Aos funcionários do departamento de Engenharia de Alimentos, Guilherme Silva,
Marcelo Thomazini, Carla Monaco Lourenço, Camila Velludo Molina e Fábio Gallo. Obrigada
pelo apoio na realização de análises e pelos conhecimentos ensinados.
Ao pesquisador Dr. Rodney A.F. Rodrigues pelo apoio nas análises de cromatografia
gasosa realizadas no CPQBA/UNICAMP.
À profa^ Dra^ Andrezza Maria Fernandes, pela co-orientação deste projeto na área de
microbiologia.
Ao Prof. Dr. Rodrigo Petrus por disponibilizar a planta piloto para a produção do patê
de frango.
À FAPESP, pelo apoio financeiro nos projetos e bolsas 2012/01460-2, 2011/14443-6,
2011/20916-4 e 2013/25182-4.
À Faculdade de Zootecnia e Engenharia de Alimentos (FZEA/USP), por toda apoio e
ensinamentos recebidos.
“A experiência é o nome que damos
aos nossos erros”
Oscar Wilde
"Quem caminha sozinho pode até
chegar mais rápido, mas aquele que
vai acompanhado, com certeza vai
mais longe."
Clarice Lispector
sofreram oxidação proteica, e portanto, o OEO livre e nanoemulsionado, bem como o
antioxidante sintético BHT, não foram eficientes em inibir a oxidação das proteínas. As análises
de oxidação lipídica mostraram que as nanoemulsões apresentaram maior ação antioxidante do
que o OEO livre e o antioxidante sintético BHT e a análise sensorial do patê de frango indicou
que o OEO nanoemulsionado e livre, nas concentrações empregadas neste estudo, 0,06 % e 0,
% (m /m), afetaram as propriedades sensoriais de odor e sabor do produto cárneo em estudo.
Portanto, a ação antibacteriana e antioxidante das nanoemulsões indicou que o OEO
nanoemulsionado pode ser um potencial substituto aos conservantes e antioxidantes sintético
utilizados na indústria de produtos cárneos.
Palavras-chave: nanoemulsões. temperatura de inversão de fases. potencial antibacteriano.
Staphylococcus aureus. Escherichia coli. produto cárneo.
MORAES-LOVISON, M. Oregano essential oil nanoemulsion: production, physical-
chemical characterization, antimicrobial and antioxidant activity in vitro and application
in chicken pâté. 2017. 130 f. Thesis (Ph.D.) – School of Animal Science and Food Engineering,
University of São Paulo (USP) Pirassununga, 2017.
Oregano essential oil (OEO) can be considered a potential antioxidant and antimicrobial agent
due to the presence of phenolic compounds, such as carvacrol and thymol. In recent years, there
has been growing interest in using this oil to reduce or replace artificial antioxidants and
synthetic preservatives, which are widely used in the food industry. However, the direct
incorporation of essential oils in food faces some technological challenges, such as low storage
stability (due to high volatility of some compounds) and the difficulty of incorporation, as they
are hydrophobic. Therefore, the encapsulation of OEO in nanodispersions can be an alternative
to overcome these drawbacks. The main objective of this Thesis was the production and
characterization of nanoemulsions encapsulating OEO to evaluate their antioxidant activity and
antibacterial action, for Staphylococcus aureus and Escherichia coli , in vitro and in chicken
pate, being that this meat product is considered a favorable food for the multiplication of
microorganisms and is also susceptible to lipid and protein oxidation during storage.The
nanoemulsions were produced with 3,25% (NA-3.25) and 5% (NA-5) OEO (m/m), obtained by
the phase inversion temperature method and presented reduced droplet sizes (25.5 ± 0.12 and
42.4 ± 1.7 nm). Both nanoemulsions presented kinetic stability during 90 days of storage, which
made it possible to evaluate the antimicrobial and antioxidant activity of nanoemulsions in vitro
and in chicken pâté. The chicken pâté was submitted to 5 treatments, with the purpose of
evaluating the physical-chemical stability of each treatment during storage: T1- without
antioxidants and preservatives, T 2- 0.06 % (w / w) free OEO, T3 - 6 % (w / w) NA-3.5, T4-
1.2% (w / w) NA-5 and T5: BHT and sodium nitrite. Color parameters determined during
storage show that all treatments were discolored, however, this color change was not observed
by the panelists during the sensory analysis. The lipid oxidation reactions showed that the
nanoemulsions presented higher antioxidant action than free OEO and synthetic antioxidant,
BHT and the sensorial analysis of the chicken pâté indicated that the nanoemulsions and the
free OEO, in the concentrations used in this study, 0.06% and 0.2 % (w / w), affected the odor
and flavor properties of the meat product. Therefore, the antibacterial and antioxidant action of
Figura 1. Estrutura química dos principais compostos que constituem o óleo essencial de orégano: carvacrol, timol e γ-terpineno. ..................................................................................... 4
Figura 2. Esquema das diferentes rotas promovidas pelas nanoemulsões para a interação de óleo essencial com as membranas celulares microbianas: (1) Transporte passivo através da membrana celular, (2) Fusão com a bicamada de fosfolipídio celular, (3) Partição na fase aquosa, e (4) Interação eletrostática com a membrana celular. .................................................. 8
Figura 3. Diagrama esquemático da estrutura das nanoemulsões O/A formada a partir de óleo, água e tensoativo. ..................................................................................................................... 11
Figura 4. Diagrama esquemático da energia livre da formação de nanoemulsões (∆G): as nanoemulsões têm uma energia livre maior do que as fases separadas de água e óleo............ 12
Figura 5. Mecanismos físicos-químicos de desestabilização das nanoemulsões: separação gravitacional (sedimentação ou cremeação), floculação, coalescência ou maturação de Ostwald. .................................................................................................................................................. 13
Figura 6. Diagrama do comportamento formulação-composição por inversão de fases transicional e catastrófica. ........................................................................................................ 18
Figura 7. Diferentes tipos de sistemas coloidais que são formados de acordo com a geometria molecular dos tensoativos......................................................................................................... 19
Figura 8. Diagrama esquemático da dependência da temperatura com a curvatura espontânea das monocamadas de tensoativo e sua influência nas propriedades de uma emulsão. ............. 20
Figura 9. Mecanismo de geração das nanoemulsões pelo método PIT: (a) a temperatura está abaixo da temperatura de inversão de fases (emulsãoO/A); (b) ocorre o aumento da temperatura e os tensoativos se tornam gradualmente lipofílico (são solubilizados pela fase oleosa); (c) sistema está na temperatura de inversão de fases: microemulsões bicontínuas; e (d) resfriamento rápido do sistema tensoativo-óleo-água, onde ocorre a migração espontânea e rápida do óleo para a fase aquosa: formação das nanoemulsões. ..................................................................... 22
Figura 10. Mudanças na condutividade e na turbidez em função da temperatura, em uma inversão transicional. ................................................................................................................ 24
Figura 11. Reação entre malonaldeído (MA) e ácido 2- tiobarbitúrico que ocorre durante a análise de TBARS originando um composto de coloração rosa. ............................................. 32
Figura 12. Fluxograma das etapas experimentais realizadas durante a Tese. ......................... 34
Figura 13. Estrutura química dos tensoativos utilizados na formulação das nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano. ................................................................................. 35
Figura 14. Fluxograma da produção do patê de frango e os tratamentos aplicados. *Quantidade determinada pela concentração inibitória mínima dos testes in vitro : 0,2 % (m/m) para as nanoemulsões NA-3,25 e 0,06 % (m/m) para as nanoemulsões NA-5. **Valores máximos de adição de BHT (100 mg/kg) e nitrito de sódio (150 mg/kg) permitidos pela legislação brasileira (BRASIL, 2007). ...................................................................................................................... 45
Figura 15. Condutividade elétrica em função da temperatura das nanoemulsões, produzidas pelo método PIT, para determinação da temperatura de inversão de fases: (●) nanoemulsões NA-3,25 e (■) nanoemulsões NA-5. ........................................................................................ 55
Figura 16. Curvas de distribuição de tamanho de gotas para as nanoemulsões NA 3,25 e NA- 5 durante o início e o final do armazenament sob refrigeração: ( ) dia 1 e ( ) dia 90. ...... 59
Figura 17. Aspecto visual das nanoemulsões NA-3,25 (A) e NA-5 (B), produzidas pelo método PIT, no dia 1 e após 90 dias de armazenamento. ...................................................................... 60
Figura 18. Valor de r3 (nm3) das nanoemulsões vs tempo, durante o armazenamento sob refrigeração: (●) nanoemulsões NA-3,25 e (■) nanoemulsões NA-5. ..................................... 62
Figura 19. Cromatograma do óleo essencial de orégano puro. ............................................... 63
Figura 20. Quantificação dos compostos voláteis presentes no óleo essencial de orégano nanoemulsionado durante o período de 60 dias de armazenamento sob refrigeração das nanoemulsões NA-3,25: (●) carvacrol, (■) γ-terpineno e (▲) timol. ...................................... 64
Figura 21. Quantificação dos compostos voláteis presentes no OEO nanoelsionado durante o período de 60 dias de armazenamento sob refrigeração das nanoemulsões NA-5: (●) carvacrol, (■) γ-terpineno e (▲) timol. ..................................................................................................... 64
Figura 22. Curvas de multiplicação para S. aureus e E. coli : (■) controle negativo (sem agente antibacteriano); (▲) nanoemulsão NA-3,25 na concentração inibitória mínima; e (♦) controle positivo (antibiótico cloranfenicol: 1 mg/ml). .......................................................................... 69
Figura 23. Curva de multiplicação para S. aureus e E. coli : (■) controle negativo (sem agente antibacteriano); (▲) nanoemulsão NA-5 na concentração inibitória mínima; e (♦) controle positivo (antibiótico cloranfenicol: 1 mg/ml). .......................................................................... 70
Figura 24. Concentração de óleo essencial de orégano (mg/mL) vs. % redução dos radicais DPPH•^ ....................................................................................................................................... 71
Figura 25. Porcentagem de redução dos radicais DPPH•^ durante o período de 24 semanas de armazenamento das nanoemulsões sob refrigeração: (●) nanoemulsões NA-3,25 (com 3,25% de OEO) e (■) nanoemulsões NA-5 (com 5 % de OEO). ........................................................ 73
Figura 34. Distribuição da renda familiar dos provadores que participaram da análise sensorial do patê de frango: (■) de 1 a 3 salários mínimos (R$ 880,00 a R$ 2.640,00); (■) de 3 a 6 salários mínimos (R$ 2.640,00 a R$ 5.280,00); (■) de 6 a 10 salários mínimos (R$ 5.280,00 a R$ 8.800,00); (■) mais de 10 salários mínimos (acima de R$ 8.800,00). ..................................... 90
Figura 35. Distribuição da frequência de consumo de patê dos provadores que participaram da análise sensorial: (■) sempre (uma vez por semana ou mais); ( ■ ) frequentemente (de 2 a 3 vezes por mês); ( ■ ) moderadamente (1 vez por mês); ( ■ ) algumas vezes (menos que 1 vez por mês); ( ■ ) raramente (somente em ocasiões especiais). ...................................................................... 91
Figura 36. Porcentagens de provadores correspondente aos atributos de cor utilizando a escala de diferença do controle: 0= nenhuma diferença do controle, 1= ligeiramente diferente do controle, 2= pouco diferente do controle, 3= muito diferente do controle, 4= muitíssimo diferente do controle, 5= extremamente diferente do controle. (■) T1: sem antioxidantes e conservantes, (■) T2: adição de 0,06 % (m/m) de óleo essencial de orégano não-emulsionado, (■) T3: adição de 6 % (m/m) das nanoemulsões NA-3,25 e (■) T4: adição de 1,2 % (m/m) das nanoemulsões NA-5. ................................................................................................................ 92
Figura 37. Aspecto visual dos patês de frango nos dias 1 e 90 de armazenamento. Da esquerda para direita: T 1: sem antioxidantes e conservantes, T 2: adição de 0,06 % (m/m) de óleo essencial de orégano não-emulsionado, T3: adição de 6 % (m/m) das nanoemulsões NA-3,25, T4: adição de 1,2 % (m/m) das nanoemulsões NA-5 e T5: adição de BHT e nitrito de sódio. 96
Figura 38. Distribuição da intenção de compra dos provadores em relação as amostras de patê de frango: (■) certamente não compraria o produto; (■) possivelmente não compraria o produto; (■) talvez compraria / talvez não compraria; (■) possivelmente compraria o produto; (■) certamente compraria o produto. Tratamentos: T1: sem antioxidantes e conservantes, T2: adição de 0,06 % (m/m) de óleo essencial de orégano não-emulsionado, T3: adição de 6 % (m/m) das nanoemulsões NA-3,25, T4: adição de 1,2 % (m/m) das nanoemulsões NA-5 e T5: adição de BHT e nitrito de sódio. ........................................................................................... 100
Tabela 1. Classificação dos sistemas coloidais baseada no tamanho de diâmetro das gotas e na estabilidade termodinâmica. ..................................................................................................... 10
Tabela 2. Estudos recentes sobre a aplicação de nanoemulsões em diversos tipos de alimentos. .................................................................................................................................................. 14
Tabela 3. Descrição das formulações (% m/m) das nanoemulsões encapsulando óleo essencial de orégano produzidas pelo método de temperatura de inversão de fases. .............................. 39
Tabela 4. Valores médios do diâmetro hidrodinâmico (DH), índice de polidispersidade (PDI) e turbidez das nanoemulsões NA-3,25 durante o período de 90 dias das amostras armazenadas sob refrigeração. ....................................................................................................................... 58
Tabela 5. Valores médios do diâmetro hidrodinâmico (DH), índice de polidispersidade (PDI) e turbidez das nanoemulsões NA-5 durante o período de 90 dias das amostras armazenadas sob refrigeração. .............................................................................................................................. 59
Tabela 6. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) (mg de óleo essencial de orégano/mL), das nanoemulsões NA-3,25, para Staphylococcus aureus e Escherichia coli , durante o período de 90 dias de armazenamento. .......................... 66
Tabela 7. Concentração inibitória mínima (CIM) e concentração bactericida mínima (CBM) (mg de óleo essencial de orégano/mL), das nanoemulsões NA-5, para Staphylococcus aureus e Escherichia coli , durante o período de 90 dias de armazenamento.......................................... 67
Tabela 8. Composição centesimal do patê de frango. Tratamentos: T1: sem antioxidantes e conservantes, T2: adição de 0,06 % (m/m) de óleo essencial de orégano não-emulsionado, T3: adição de 6 % (m/m) das nanoemulsões NA-3,25, T4: adição de 1,2 % (m/m) das nanoemulsões NA-5 e T5: adição de BHT e nitrito de sódio........................................................................... 75
Tabela 9. Valores de L, a, b, Croma (C), ângulo Hue (H*) e diferença total de cor (∆E) durante o armazenamento (16 semanas). .................................................................................. 83
Tabela 10. Valores médios de substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) durantes 16 semanas de armazenamento. Tratamentos: T1: sem antioxidantes e conservantes, T2: adição de 0,06 % (m/m) OEO livre, T3: adição de 6 % (m/m) das nanoemulsões NA-3,25, T4: adição de 1,2 % (m/m) das nanoemulsões NA-5 e T5: adição de BHT e nitrito de sódio. ................. 88
Tabela 11. Valores médios das notas atribuídas para os atributos de sabor e odor utilizando a escala de diferença do controle: 0= nenhuma diferença do controle, 1= ligeiramente diferente do controle, 2= pouco diferente do controle, 3= muito diferente do controle, 4= muitíssimo diferente do controle, 5= extremamente diferente do controle. Tratamentos: T2: adição de 0,
A/O – água/óleo
BHT – hidroxitolueno butilado
CBM – Concentração Bactericida Mínima
CIM – Concentração Inibitória Mínima
E. coli – Escherichia coli
EIP – e mulsion inversion point (ponto de inversão de emulsão)
HLD –desvio hidrofílico-lipofílico
IC50 – concentração referente à redução de 50 % dos radicais de DPPH•
NA 3,25 – nanoemulsões contendo 3,25 % (m/m) de óleo essencial de orégano
NA 5 – nanoemulsões contendo 5 % (m/m) de óleo essencial de orégano
O/A – óleo/água
OE – óleo essencial
OEO – óleo essencial de orégano
PIC – phase inversion composition (composição de inversão de fases)
PIT – phase inversion temperature (temperatura de inversão de fase)
S. aureus – Staphylococcus aureus
SOR – razão tensoativo/óleo
TBARS – substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
WOR – razão água/óleo
DPPH – 2,2-difenil-1-picrilhidrazila
ττττ - turbidez
p - parâmetro de empacotamento do tensoativo
∆G - energia livre de Gibbs
ω - taxa de maturação de Ostwald
C* - intensidade de cor (Croma)
H* - ângulo de Hue
L* - luminosidade
a* - teor de vermelho
b* - teor de amarelo
∆E - diferença total de cor entre o início e o fim do armazenamento
