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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SULINSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS: BIOQUÍMICA
O envolvimento do cálcio e das junções gap na secreção de
S100B em astrócitos de ratos
Marina Concli Leite Orientador: Carlos Alberto Saraiva Gonçalves
Porto Alegre, fevereiro de 2010.
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas: Bioquímicado Rio Grande do Sul como requisito da Universidade Federal parcial para a obtenção do grau deDoutor em Bioquímica
II
Dedico essa tese aos meus pais, que são meus exemplos de vida.
IV
- Parte I 1Resumo Sumário
- Abstract
- Lista de Abreviaturas
- Introdução
- 1.1.Sistema nervoso central e proteínas S100........................................................... 6 Astrócitos e a proteína S100B.....................................................................
- 1.1.1. Células que expressam e secretam S100B
- 1.1.2. Papéis intra e extracelulares da S100B
- 1.1.3. Moduladores da secreção de S100B
- 1.1.4.1.1.5. Mecanismo de secreção da S100B.................................................... 12Dosagem de S100B...........................................................................
- Comunicação entre astrócitos
- 2.1. Junções gap
- 2.1.1. Estrutura e permeabilidade
- 2.1.2.2.1.3. Astrócitos e junções gap 15Hemicanais........................................................................................
- 2.1.4. Regulação metabólica e junção gap..................................................
- 2.1.5. Regulação da junção gap
- 2.2. Sinalização por cálcio
- 2.2.1.2.2.2. Canais e trocadores de cálcio............................................................ 18Estoques intracelulares de cálcio
- 2.2.3. Ondas de cálcio
- Objetivos
- Parte II...............................................................................................................................
- Capítulo I 24Capítulo II
- Capítulo III....................................................................................................................
- Parte III
- Discussão
- 1.1.Dosagem de S100B........................................................................................... 76 Características do imunoensaio.................................................................
- 1.2. Interferentes na técnica
- 1.3. Conclusões
- Comunicação por junção gap e secreção de S100B..........................................
- 2.1.2.2. Secreção de S100B na presença de inibidores de junção gap................... 81Viabilidade celular – cultura de astrócitos e glioma C6
- 2.3. Viabilidade celular – fatias agudas hipocampais
- 2.4. Eficiência no bloqueio de junção gap em astrócitos.................................
- 2.5. Comentários
- 2.6.Mobilização de cálcio e secreção de S100B 87 Conclusões
- 3.1. Secreção basal de S100B
- 3.2. Medidas de cálcio intracelular
- 3.2.1. Estímulos com DMSO, forscolina e EGTA em astrócitos V
- 3.2.2. Variações de cálcio intra e extracelular
- 3.3.3.4. Comentários 90Conclusões
- Considerações Finais
- Perspectivas.......................................................................................................................
- Referências Bibliográficas
Resumo
intracelulares envolvidos no ciclo celular e na regulação do citoesqueleto em astrócitos.^ A S100B, uma proteína ligante de cálcio de 21 kDa, possui muitos alvos Além disso, essa proteína é secretada e possui efeitos autócrinos e parácrinos na glia, plasticidade sináptica e microglia. A expressão de S100B, particularmente a S100B extracelular, é usada como um parâmetro de ativação e/ou morte glial em diversas situações de dano cerebral. Existem muitos imunoensaios para a dosagem de S100B, quediferem em relação à especificidade, sensibilidade, aplicação das amostras e custo. Nós padronizamos dois protocolos para a dosagem de S100B (variando em sensibilidade de 1,9 pg a 10 ng/mL) em amostras de humanos e de ratos, de tecido cerebral, tecido adiposo, soro, líquor, urina e amostras de cultura de células. Muitos secretagogos de S100B já foram identificados, mas o mecanismo de secreção dessa proteína ainda édesconhecido e envolve um mecanismo do tipo não-clássico de secreção. Nós investigamos o papel do Ca 2+^ na secreção de S100B em cultura primária de astrócitos. Nossos resultados mostraram que o DMSO é um potente secretagogo da S100B. A secreção de S100B induzida por DMSO foi dependente da mobilização de cálcio do retículo endoplasmático, mas não de reorganização do citoesqueleto. A propriedade doDMSO em induzir a secreção de S100B deve ser adicionada à lista de aplicações terapêuticas desse composto, especialmente considerando os efeitos neuroprotetores que têm sido observados da S100B em situações de dano cerebral agudo. Além disso, a utilidade do DMSO como uma ferramenta para investigar a mobilização de cálcio intracelularinteragem e respondem a estímulos gerados pelos neurônios ou pelo dano neuronal e essa deve ser levada em consideração. Sabe-se que os astrócitos sentem, resposta envolve a comunicação por junção gap. A vulnerabilidade neuronal a danos é aumentada quando co-culturas de astrócitos e neurônios são expostas a inibidores de junção gap. Entretanto, a inibição das junções gap pode limitar a extensão de uma lesão. Nós investigamos uma possível relação entre a comunicação por junção gap e a secreçãode S100B. Nossos dados indicam que o bloqueio das junções gap estimula a secreção de S100B em cultura de astrócitos, bem como em fatias agudas hipocampais. A secreção de S100B foi observada com o uso de diferentes tipos de bloqueadores de junção gap e o resultado foi dependente do tempo, da natureza do inibidor, de seu possível alvo intracelular e/ou do tipo de preparação celular utilizada. Fisiologicamente, um bloqueiolocal da comunicação por junção gap associado com a liberação de S100B em uma situação de dano favorece a idéia da existência de um mecanismo comum para limitar a extensão da lesão e, simultaneamente, aumentar as chances de sobrevivência celular.
Abstract
targets involved in cell cycle and cytoskeleton regulation in astrocytes. In addition, this^ S100B, a calcium-binding protein of 21 kDa, has many putative intracellular protein is also secreted and has autocrine and paracrine effects on glia, synaptic plasticity and microglia. S100B expression, particularly extracellular S100B, is used as a parameter of glial activation and/or death in several situations of brain injury. Several immunoassaysspecificity, sensitivity, for S100B sample measurement application, are available,and, of course,which differeconomic with costs.regard Weto standardized two protocols for S100B measurement (range between 1,9 pg and 10 ng/mL) in human and rat samples from brain and adipose tissues, blood serum, cerebrospinal fluid, urine and cell culture. Many S100B secretagogues have been identified, but the underlying mechanism of secretion remains unknown and involves anon-classic export. Herein, we investigate the role of Ca2+ (^) in S100B secretion in primary cultured astrocytes. Results indicate that DMSO is a powerful S100B secretagogue. DMSO induced S100B secretion was dependent on increased intracellular Ca 2+ mobilization from endoplasmatic reticulum and independent of cytoskeleton reorganization. Furthermore, the S100B-secreting property of DMSO should be added tothe list of therapeutic applications of this compound, particularly considering the neuroprotective effects of S100B that have been observed in acute brain damage. In addition, the usefulness of DMSO per se as a tool to investigate intracellular calcium mobilization should be taken into consideration. Astrocytes sense, integrate, and respond to stimuli generated by neurons or neural injury; this response involves gap junction (GJ)communication. Neuronal vulnerability to injury increased when cocultures of astrocytes and neurons were exposed to GJ inhibitors. However, GJ uncoupling could limit the extension of a lesion. We investigated a possible link between GJ communication and S100B secretion. Our data indicate that GJ blocking stimulates S100B secretion in astrocyte cultures and acute hippocampal slices. S100B secretion was observed withdifferent types of GJ inhibitors; the resulting event was dependent on time, the nature of the inhibitor, its putative molecular target of GJ blocking, and/or the cell preparation used. Physiologically, a local GJ closure associated with release of S100B in injury conditions favors the idea of a common mechanism available to limit the extension of lesion and increase the chances of cell survival.
IFMA: imunoensaio fluorimétrico (“immunofluorometric assay”) IFN-γ: interferon gama IL-1β: interleucina 1 beta IL-8: interleucina 8 IP3: inositol trisfosfato IRMA: imunoensaio imunorradiometrico (“immunoradiometric assay”) LDH: lactate desidrogenase LIA: imunoensaio quimioluminescente (“chemiluminescence immunoassay”) LPA: ácido lisofosfatídico LPS: lipopolissacarídeo NF-kB: fator nuclear kapa B Oct: octanol PKA: proteína cinase A PLC: fosfolipase C PMSF: fluoreto de fenilmetanosulfonil PVP-40: polivinilpirrolidona RAGE: receptor para produtos terminais de glicação (“receptor for advanced glycation end products”) SERCA: Ca 2+^ - ATPase do retículo sarco/endoplasmático SFB: soro fetal bovino SOC: canal de cálcio operado por estoque TNF-α: fator de necrose tumoral alfa VOC: canal de cálcio operado por voltagem
Introdução
- Sistema nervoso central e proteínas S As proteínas S100 foram isoladas pela primeira vez em 1965 no tecido encefálico e foram assim denominadas por serem solúveis em solução 100% saturada de sulfato de amônio (Moore 1965). Até o presente momento já foram caracterizadas 25 proteínas pertencentes à família S100 (Donato et al. 2009). Essas proteínas são ligantes de cálcio do tipo EF-hand e são expressas de forma específica nos diferentes tipos celulares (Donato 2001, Goncalves et al. 2008). Por exemplo, no sistema nervoso central de mamíferos, a S100A1 é expressa em neurônios enquanto que a S100B é expressa em astrócitos. As proteínas S100 apresentam uma grande diversidade de funções intra e extracelulares, como, por exemplo, a regulação do metabolismo energético, do ciclo celular, da inflamação, da coagulação e modulação de proteínas do citoesqueleto (Donato 2001).
1.1. Astrócitos e a proteína S100B Os astrócitos são células gliais que, por muito tempo, foram considerados como sendo apenas um suporte estrutural para os neurônios. Há algumas décadas que essa visão está mudando, devido à descoberta de inúmeras outras funções desse tipo celular (Kimelberg & Norenberg 1989). Os astrócitos possuem um papel de suporte energético para os neurônios (Magistretti 2006, Magistretti & Pellerin 1999), sendo inclusive capazes de modular as sinapses (Perea & Araque 2006) através da liberação de glutamato e ATP, por exemplo. Atualmente, os astrócitos são considerados parte integrante das
celulares é capaz de secretar S100B. Em um estudo com a linhagem OLN-93 de oligodendrócito, foi observada uma liberação de S100B para o meio extracelular (Steiner et al. 2008), bem como em estudos em células de melanoma (Donato 2001). No entanto, a liberação de S100B por outras células do sistema nervoso central, diferentes dos astrócitos, parece ocorrer vinculada à morte celular, o que não indica uma secreção regulada e sim uma liberação por rompimento de membrana celular (Goncalves et al. 2008). A S100B originada do sistema nervoso central é capaz de atravessar a barreira hematoencefálica e contribuir para a concentração sérica dessa proteína. A concentração de S100B no soro é bastante baixa, na ordem de 0,05 ng/mL em humanos adultos saudáveis (Leite et al. 2008). Dessa forma, a S100B pode ser considerada como marcadora de lesão cerebral (Goncalves et al. 2008) e de dano na barreira hematoencefálica (Marchi et al. 2004). A S100B é eliminada através da urina, mas em concentrações muito baixas, podendo ser detectada apenas em urina de crianças recém-nascidas (Leite et al. 2008, Goncalves et al. 2008), que possuem concentração de S100B no soro cerca de dez vezes maior que em adultos (Netto et al. 2005, Portela et al. 2002). O aumento de S100B na urina tem sido estudado como marcador de lesão com valor prognóstico em recém- nascidos (Gazzolo et al. 2009, Liu et al. 2010, Michetti & Gazzolo 2002). Existem também fontes extracerebrais de S100B. Alguns tipos celulares como condrócitos, cardiomiócitos, células da medula óssea, linfócitos (Jonsson et al. 1999, Anderson et al. 2001) e células de melanoma (Harpio & Einarsson 2004) também expressam S100B. Os adipócitos não apenas expressam, mas também são capazes de
secretar S100B, contribuindo para a concentração sanguínea de S100B (Schulpis et al. 2007, Netto et al. 2006, Steiner et al. 2009a, Holtkamp et al. 2008), o que pode dificultar o uso dessa proteína como marcadora de lesão cerebral (Goncalves et al. 2008). Além disso, a S100B também pode ser encontrada no leite humano (Gazzolo et al. 2003).
1.1.2. Papéis intra e extracelulares da S100B As proteínas da família S100, incluindo a S100B, possuem tanto funções intracelulares como também podem ser secretada e exercerem funções no meio extracelular (Donato 2003). Dentre as funções intracelulares da S100B podemos destacar a inibição da fosforilação protéica, regulação da atividade enzimática, modulação de citoesqueleto e regulação do crescimento e diferenciação celular. Por exemplo, a S100B é capaz de inibir a fosforilação das proteínas de citoesqueleto GFAP e vimentina (Ziegler et al. 1998, Frizzo et al. 2004), bem como de estimular a atividade da proteína fosfatase calcineurina (Leal et al. 2004). As atividades extracelulares da S100B são bastante variadas. Estudos in vitro demonstraram efeitos tróficos da S100B quando em concentrações baixas, variando de altos valores na faixa de picomolar até baixos valores na faixa de nanomolar. Esses efeitos incluem aumento da sobrevivência neuronal, do crescimento de neuritos e da função sináptica. Por outro lado, concentrações mais altas de S100B, na faixa de altos valores de nanomolar e baixos valores na faixa de micromolar, podem causar disfunção e morte neuronal. Esses efeitos tóxicos são mediados pela ativação de astrócitos e microglia, que passam a produzir e secretar citocinas inflamatórias, como IL-1β e TNF-α, bem como NO (Van Eldik & Wainwright 2003). É importante ressaltar que esses estudos
1.1.3. Moduladores da secreção de S100B Alterações na concentração de S100B no meio extracelular estão relacionadas tanto com o desenvolvimento normal (Tramontina et al. 2002), quanto com condições patológicas, como a esquizofrenia (Steiner et al. 2009b, Pedersen et al. 2008), a depressão maior (Zhang et al. 2009) e a doença bipolar (Andreazza et al. 2007), bem como doenças neurodegenerativas. Estudos mostram um aumento de S100B no líquido cefalorraquidiano de pacientes com a doença de Alzheimer (Peskind et al. 2001, Petzold et al. 2003) ou com a Síndrome de Down (Netto et al. 2005). Estudos em culturas de células já identificaram muitos moduladores da secreção de S100B, como amônia (Leite et al. 2006), serotonina (Whitaker-Azmitia et al. 1990), fluoxetina (Tramontina et al. 2008), beta hidroxibutirato (Leite et al. 2004), altas concentrações de glicose (Nardin et al. 2007), glutamato (Ciccarelli et al. 1999, Goncalves et al. 2002), bloqueadores de junção gap (Leite et al. 2009), resveratrol (de Almeida et al. 2007), fármacos neurolépticos atípicos (Quincozes-Santos et al. 2008), IL1-β (de Souza et al. 2009), estresse metabólico (Gerlach et al. 2006), forskolina e LPA (Pinto et al. 2000). Estudos in vivo também demonstraram alterações da concentração sérica de S100B ou no líquido cefalorraquidiano de S100B no jejum (Netto et al. 2006), em ratos tratados com dieta cetogênica (Ziegler et al. 2004), em modelos de demência (Rodrigues et al. 2009, Swarowsky et al. 2008, Vicente et al. 2009) e em filhotes de ratas intoxicadas com mercúrio (Vicente et al. 2004).
1.1.4. Mecanismo de secreção da S100B A secreção protéica pode ser classificada em dois grandes grupos: secreção clássica e secreção não-clássica. No mecanismo de secreção clássico, a proteína é sintetizada e direcionada para o retículo endoplasmático através de uma seqüência peptídica sinalizadora específica em sua estrutura. A proteína é então encaminhada para o complexo de Golgi, de onde é exportada na forma de vesículas (Nickel 2003). Já no mecanismo de secreção não-clássico, não há o envolvimento do sistema retículo endoplasmático/complexo de Golgi (Nickel 2003). Existem diferentes mecanismos já identificados para esse tipo de secreção, como o “flip-flop” de membrana, o “blebbing” de membrana, a secreção através de transportadores específicos e por vesículas endolisossômicas (Nickel 2003, Prudovsky et al. 2008). Atualmente já foram identificadas proteínas que, apesar de conterem a seqüência peptídica sinalizadora para a secreção clássica, não são secretadas via complexo de Golgi e, portanto, seu mecanismo de secreção também é considerado como sendo não-clássico (Nickel & Rabouille 2009). Apesar de muitos mecanismos já terem sido identificados, pouco se sabe sobre as vias de sinalização que modulam a secreção não-clássica (Prudovsky et al. 2008). O mecanismo de secreção de S100B ainda não foi completamente elucidado; entretanto, sabe-se que sua secreção é via um mecanismo não clássico, ou seja, independente do complexo retículo endoplasmático/complexo de Golgi, visto que a S100B não possui a seqüência peptídica sinalizadora para a secreção clássica (Donato 2001). Além disso, um estudo em glioblastomas demonstrou que a S100B é secretada por um mecanismo vesicular e dependente da concentração de cálcio intracelular (Davey et al. 2001). É importante ressaltar que esse estudo foi realizado em linhagens celulares, que
2.1.1. Estrutura e permeabilidade As junções gap são formadas por proteínas transmembrana chamadas conexinas. Essas proteínas se agrupam em hexâmeros, que são chamados de conexons. Esses conexons formam um poro na membrana plasmática. Quando dois conexons se ligam não-covalentemente a junção gap está formada (Yeager & Harris 2007). A distância entre as duas células que participam da junção gap é apenas de 2-4 nm e o tamanho do poro formado é de cerca de 1 kDa (Mese et al. 2007). Sendo assim, compostos como glicose, glicose 6-fosfato, inositol trisfosfato, glutamato, glutamina, ATP, ADP, AMP e glutationa são capazes de passar de uma célula a outra através de junções gap (Tabernero et al. 2006). Existem pelo menos 21 isoformas de conexinas no genoma humano. As junções gap podem ser formadas por apenas uma ou por várias isoformas, podendo ser classificadas como homoméricas ou heteroméricas (se as conexinas de um mesmo conexon são todas iguais ou se são diferentes, repectivamente) e homotípicas ou heterotípicas (se os dois conexons são idênticos ou se são diferentes entre si, respectivamente) (Mese et al. 2007). As isoformas de conexinas variam de acordo com o tipo celular, não sendo específicas de apenas um tipo celular. No sistema nervoso central, os neurônios expressam predominantemente Cx32 e Cx43 e os astrócitos expressam predominantemente Cx43, podendo também expressa Cx30, entre outras (Rouach et al. 2002, Rozental et al. 2000). A expressão de conexinas varia ontogeneticamente e também em algumas condições patológicas (Rouach et al. 2002).
2.1.2. Astrócitos e junções gap A comunicação por junção gap no sistema nervoso central ocorre em grande quantidade nos astrócitos, formando uma verdadeira rede de comunicação entre esse tipo celular (Rouach et al. 2002, Rozental et al. 2000). Essas células podem formar junções gap do tipo astrócito-astrócito, astrócito-oligodendrócitos (Orthmann-Murphy et al. 2008) e até mesmo astrócito-neurônio (Froes et al. 1999). Os astrócitos podem até mesmo formar junções gap dentro da mesma célula, junções gap autocelulares, que unem diferentes prolongamentos celulares (Wolff et al. 1998). A função desse tipo de junção gap ainda não foi completamente elucidada, mas acredita-se que está envolvida com a facilitação da homeostase de íons e mensageiros intracelulares entre diferentes processos, independente de uma regulação do corpo celular (Rouach et al. 2002).
2.1.3. Hemicanais Alguns conexons não formam junções gap; entretanto, permanecem funcionais na membrana celular, comunicando o meio intracelular com o meio extracelular. Esses canais são chamados hemicanais e estão presentes em astrócitos (Ye et al. 2003, Saez et al. 2003). Pouco se sabe sobre a modulação dos hemicanais, apesar de já ter sido demonstrado que parecem ser regulados pela concentração de cálcio extracelular. Baixas concentrações de cálcio extracelular em culturas de astrócitos são capazes de abrir os hemicanais, liberando glutamato (Bennett et al. 2003, Ye et al. 2003) e também aminoácidos e glutationa (Rana & Dringen 2007, Stridh et al. 2008) para o meio extracelular.
