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Um estudo experimental sobre as alterações causadas pelo latirismo no ligamento periodontal de ratos. O estudo inclui a análise histopatológica e morfométrica do ligamento periodontal de animais expostos à semicarbazida em duas doses diferentes. Os resultados mostram uma diminuição da largura do ligamento periodontal em 11% em relação aos animais do grupo controlo e uma maior heterogeneidade nas áreas de hialinização no grupo exposto à semicarbazida. A literatura consultada também é citada para contextualizar os resultados.
Tipologia: Esquemas
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Orientador: Professor Doutor António Silvério Cabrita Co-Orientador: Dr. Rodrigo Farinha Autor: Nuno Daniel Esteves Varanda Coimbra 2010
Resumo
O periodonto compreende todos os tecidos que suportam o dente: gengiva, osso alveolar, cemento radicular e o ligamento periodontal. O ligamento periodontal é uma estrutura de tecido conjuntivo que sustenta o dente no alvéolo. O principal constituinte desta estrutura são as fibras de colagénio, denominadas fibras de Sharpey, divididas em grupos, de acordo com a sua orientação e inserção. As funções principais do ligamento periodontal são, para além da sustentação do dente no alvéolo e da função sensorial, pela sua abundante inervação, a transmissão de forças oclusais ao osso alveolar de suporte, formação de células e nutrição deste, bem como do cemento e da gengiva.
Quando o ligamento apresenta patologias como a periodontite, estas funções ficam comprometidas, com consequente extensão aos dentes suportados. As patologias do ligamento periodontal estão relacionadas fundamentalmente com situações infecciosas bacterianas.
O latirismo é uma patologia que cursa com envolvimento do ligamento periodontal, condição patológica originada pela ingestão de sementes de leguminosas da espécies Latirus sativus. Esta doença é rara, sendo mais comum em países como a Etiópia e a Índia.
O neurolatirismo é provocado por neurotóxicos (ácido L-3-oxalilamino-2-aminopropiónico (ODAP ou BOAA)), que lesionam os neurónios pela sua sobre estimulação, que culmina em morte neuronal. O osteolatirismo é provocado por agentes como o aminoacetonitrilo, beta- aminopropionitrilo e cisteamina, inibindo a formação de reticulados de colagénio, pela inibição da enzima lisil-oxidase, responsável pelas ligações cruzadas de colagénio e elastina.
Para estudar os efeitos do latirismo no ligamento periodontal, foram utilizados 30 ratos Wistar macho com quatro semanas de idade divididos em três grupos. O grupo controlo foi alimentado com ração padronizada. Os grupos II e III, foram alimentados com ração em que foi incorporada semicarbazida nas doses de 3g/kg e 6g/kg, respectivamente. Todos os animais foram sacrificados ao fim de quatro semanas de ensaio. Para cada um dos indivíduos foi realizada a análise histopatológica e morfométrica do ligamento periodontal.
Concluímos que não se observa uma diferença estatisticamente significativa entre o valor da área de ligamento periodontal entre os diversos grupos, apesar de se observar uma diminuição desta área nos grupos em que foi administrada semicarbazida, em relação aos animais do grupo controlo. Observa-se ainda a acumulação de hialina no ligamento periodontal dos animais dos grupos teste. A quantidade deste depósito quando comparado
com a área do ligamento periodontal, não apresenta diferença estatisticamente significativa entre o grupo II e o grupo III. No entanto, observámos uma maior heterogeneidade entre os diferentes casos no grupo III, quando comparada a distribuição da área de hialina de cada um dos casos.
Introdução
MORFOFISIOLOGIA DO PERIODONTO
O periodonto compreende todos os tecidos que suportam o dente, ou seja, a gengiva, ligamento periodontal, osso alveolar e cemento radicular. O cemento e o osso alveolar servem de inserção às fibras de colagénio do ligamento periodontal (fibras principais), separadas por tecido conjuntivo laxo que contém vasos sanguíneos, linfáticos e nervos.
O periodonto desenvolve-se no embrião a partir da ectoderme (epitélio) e da mesoderme (tecido conjuntivo da gengiva, ligamento periodontal, cemento e osso alveolar). Na evolução da odontogénese, o saco dentário organiza-se dando as células da sua porção externa origem ao osso alveolar, as da sua porção interna aos cementoblastos responsáveis pela síntese de cemento e aos fibroblastos que se diferenciam e organizam as fibras do ligamento periodontal.
A gengiva divide-se em várias partes: gengiva livre ou marginal, sulco gengival e gengiva aderida ou fixa. A gengiva livre corresponde à região terminal que contorna os dentes. Estende-se desde a margem gengival até ao fundo do saco gengival. A sua largura varia de 0,5 a 2mm. É coberta por epitélio pavimentoso, estratificado queratinizado ou paraqueratinizado.
O sulco gengival é um espaço estreito que rodeia o dente, limitado internamente por este e externamente por epitélio da margem livre da gengiva. A profundidade de sondagem clínica normal varia de um a três milímetros. O epitélio do sulco gengival é fino e não queratinizado.
A gengiva aderida estende-se deste o sulco gengival até à linha muco gengival. Encontra-se firmemente aderida ao periósteo do osso alveolar e ao cemento radicular por fibras de colagénio. A sua largura pode variar de nove milímetros na face vestibular dos incisivos até um milímetro na zona dos pré-molares e caninos. Tal como na gengiva livre, o epitélio da gengiva aderente é pavimentoso, estratificado queratinizado ou paraqueratinizado.
Como verificámos anteriormente, a gengiva encontra-se em íntimo contacto com o dente, mantendo o selamento epitelial através de fibras gengivais. Estas fibras são agrupadas da seguinte forma: fibras gengivais livres que vão desde o cemento até à gengiva livre; fibras papilares, desde o cemento até à extremidade das papilas; fibras transeptais, que se estendem no espaço interproximal interdentário, por cima da crista óssea; fibras circulares,
que rodeiam o dente; fibras cemento alveolares, desde o cemento até ao osso alveolar; fibras alveologengivais; fibras verticais e fibras dentogengivais.
As células do tecido conjuntivo que estão presentes na gengiva em maior abundância são os fibroblastos, responsáveis pela síntese de novas fibras de colagénio. Na gengiva normal e saudável, existe uma pequena quantidade de células plasmáticas, linfócitos e neutrófilos.
Um outro constituinte do periodonto é o cemento. É um tecido mesenquimatoso calcificado que recobre a face externa da raiz. Não tem inervação, aporte sanguíneo directo, nem drenagem linfática. Não é tão duro como a dentina, mas tem as mesmas características minerais e cristalinas que o osso e a dentina. As fibras de colagénio, conhecidas como fibras de Sharpey incorporam-se no cemento durante a formação dentária.
Existem dois tipos de cemento radicular: aceluar ou primário e celular ou secundário. O cemento acelular é transparente e amorfo, produzido por cementoblastos. Contudo, não ocorre a inclusão destes no cemento, como acontece no cemento celular. O cemento acelular recobre a porção cervical da raiz, mas por vezes pode até cobrir a raiz por completo. Através de microscopia electrónica e microrradiografia pode-se observar que o cemento acelular contém muito menos cálcio do que o cemento celular e observam-se fibras de colagénio compactadas de modo denso com as típicas bandas de colagénio entre as fibras adjacentes, representando a continuação das fibras de Sharpey.
O cemento celular recobre a porção média e apical da raiz do dente. Este é constituído por cementoblastos, que depois da calcificação do cemento ficam retidos em lacunas, designando-se por cementócitos. Os seus prolongamentos citoplasmáticos anastomosam-se entre si.
Uma das funções do cemento, é a transmissão das forças oclusais ao ligamento periodontal. As fibras de colagénio aderidas no cemento e os cementoblastos possuem um elevado nível de renovação quando estimuladas por forças oclusais. A reabsorção cementária patogénica também pode ser provocada pelo movimento ortodôntico, quistos, tumores, dentes sem antagonista assim como em doenças periodontais e periapicais. A hipercementose também pode surgir em situações de grandes cargas funcionais.
O osso alveolar forma os alvéolos dentários, é constituído pela parede interna; a lâmina cribiforme, formada por osso compacto; osso de sustentação, formado por osso esponjoso trabecular e pelas tábuas ósseas vestibulares e palatinas. É formado por uma matriz calcificada com osteócitos encerrados em espaços que se designam de lacunas, desde o
À medida que a idade avança, existe uma alteração na profundidade de penetração óssea das fibras alveolares do ligamento periodontal. A adesão das fibras alveolares ao osso, restringe-se a uma pequena área, sem se estender pelos sistemas haversianos. No cemento, as fibras periodontais aparecem sob a forma múltiplos prolongamentos relativamente delgados divididos pelos seus elementos celulares.
O ligamento periodontal é também constituído por tecido conjuntivo laxo, o qual contém vasos sanguíneos, linfáticos e a cadeia nervosa do ligamento. A maior parte dos vasos sanguíneos do ligamento surgem a partir da medula óssea do osso de suporte e também de prolongamentos dos vasos periapicais. Os vasos linfáticos conduzem a linfa para o canal dentário inferior da mandíbula, ao canal infraorbitário no maxilar superior e ao grupo submaxilar de gânglios linfáticos. O ligamento periodontal é inervado por ramos do nervo trigémio. As terminações nervosas encontram-se entre as fibras do ligamento periodontal. Permitem a localização de estímulos da mastigação, ao mesmo tempo que emitem estímulos que permitem o controlo dos músculos da mastigação e da força exercida. São muito sensíveis à dor. No tecido conjuntivo do ligamento periodontal, encontramos ainda alguns elementos celulares: cementoblastos, cementoclastos, fibroblastos, osteoclastos, osteoblastos, células do sistema imunológico como macrófagos e mastócitos e restos epiteliais de Malassez.
As funções do ligamento periodontal são a transmissão das forças oclusais ao osso através do sistema principal de fibras, formativa, nutritiva e sensorial. A resposta do ligamento periodontal está relacionada com a função oclusal. Quando as forças de oclusão excedem a capacidade de defesa do ligamento, surgem lesões morfológicas associadas ao trauma oclusal. As células presentes no ligamento periodontal actuam na formação e reabsorção deste tecido. Esta estrutura é responsável pela nutrição do cemento, osso e gengiva, pela sua rica vascularização. Tem ainda função sensorial relacionada com a abundante inervação, que lhe confere uma extrema sensibilidade táctil e propriocectiva.
Do curso das doenças periodontais consta uma sequência de processos até ao surgir de lesões características, incluindo a formação de bolsas periodontais, perda de inserção da gengiva, perda de tecido conjuntivo periodontal e reabsorção do osso alveolar. A doença periodontal tem um forte carácter infeccioso, com invasão dos tecidos periodontais por microrganismos que se instalam no ligamento periodontal e permanecem nas bolsas gengivais. Considera-se que as bactérias são o agente patológico primário das gengivites e da periodontite. As bactérias que provêm da placa dentária podem provocar gengivite incipiente e também periodontite, quando estão presentes em grande quantidade. As principais espécies de bactérias que estão na génese das doenças periodontais são a Wolinella recta Bacterioides forsythus, Eikenella corrodens, Fusobacterium nucleatum, espécies de Eubacterium, Peptostreptococcus micros, Capnocytophaga, espiroquetas , B. gingivalis e A. actinomycetemcomitans. Estas bactérias não são preponderantes na flora oral normal e por isso, quando estão presentes em elevadas quantidades, podem funcionar como indicador de uma possível periodontite. Quando ocorre infecção no ligamento periodontal há uma resposta do hospedeiro de modo a combater os microorganismos e evitar que estes de disseminem para o resto do organismo. Os A. actinomycetemcomitans podem provocar abcessos cerebrais e endocardite bacteriana subaguda. As infecções sistémicas graves causadas por bactérias periodontais não são frequentes se a resposta do hospedeiro for efectiva, limitando-se assim à destruição periodontal local.
A histopatologia das lesões periodontais tem sido amplamente estudada em seres humanos. Os tecidos periodontais são considerados normais quando o sulco gengival se encontra com pouca placa bacteriana, o número de leucócitos no sulco gengival, epitélio de união e tecido conjuntivo gengival subjacente é baixo e quando o sulco gengival é pouco profundo (menos de um milímetro). O epitélio de união saudável não apresenta prolongamentos digitiformes e está bem suportado por fibras, bem orientadas. (Genco, 1993)
Na fase inicial da gengivite, o epitélio de união apresenta os primeiros sinais de doença, com vasculites do plexo dos vasos laterais. Este epitélio apresenta-se infiltrado por um grande número de neutrófilos que migram dos vasos sanguíneos subjacentes, alguns macrófagos e linfócitos que se estendem ao tecido conjuntivo gengival. (Genco 1993) Nesta etapa inicial também se perde grandes quantidades de colagénio (Genco 1993), a gengiva endurece, há hemorragia e tumefacção que constituirá o uma das principais manifestações clínicas de gengivite. Histologicamente, os tecidos caracterizam-se pela acumulação de um infiltrado celular inflamatório no tecido conjuntivo gengival subjacente ao epitélio de união. (Genco, 1993) Nestas lesões iniciais os linfócitos, integram 75% do total do infiltrado
O colagénio pode ser encontrado em todos os tecidos conjuntivos, ossos, derme, tendões, ligamentos assim como no ligamento periodontal e contribui para a integridade estrutural de todos os órgãos. É uma proteína amplamente distribuída pelos organismos e representa uma das mais abundantes proteínas naturais à face da terra.
Há aproximadamente vinte tipos diferentes de colagénio no corpo humano. Os principais são os primeiros cinco tipos de colagénio e o mais abundante é o tipo I. Representa 90% do total de colagénio existente no corpo humano. Cada proteína de colagénio tipo I é constituída por três cadeias de proteínas, e cada proteína corresponde a uma cadeia alfa. As duas primeiras cadeias alfa são muito semelhante e designadas de alfa-I. A terceira cadeia é um pouco diferente e é designada por alfa-II. As três cadeias encontram-se enroladas em si mesmas, formando uma estrutura tripla helicoidal a que se chama monómero de colagénio tipo I. Esta configuração confere à proteína estabilidade e resistência.
Figura n.º 1 - Tripla cadeia helicoidal da molécula de colagénio.
O colagénio tipo II é encontrado exclusivamente nos tecidos cartilaginosos e a sua principal função é absorver choques nas articulações e vértebras. O colagénio tipo III encontra-se na pele, paredes de vasos sanguíneos e órgãos internos e confere flexibilidade à pele e vasos sanguíneos. O colagénio tipo IV encontra-se na membrana basal. A membrana basal da cápsula do cristalino do olho desempenha um papel fundamental na filtração e interpretação da luz. No rim, a membrana basal participa no processo de filtração do sangue. O colagénio tipo V é encontrado em quase todos os tecidos e está associado aos tipos I e II.
A via responsável pela produção de colagénio é muito complexa. Cada tipo específico de colagénio é codificado por um gene específico que se encontram dispersos em vários cromossomas. A primeira etapa de produção de colagénio é a transcrição, com produção das cadeias de mRNA a partir do DNA. Depois ocorre a produção das cadeias pro-alfa no retículo endoplasmático rugoso. O percursor do colagénio é designado procolagénio. O
Cadeia alfa
procolagénio contém extensões proteicas nos terminais designados de amino ou carboxi procolagénio ligados por ligações dissulfídicas. A forma não helicoidal é muito solúvel, o que permite que a proteína se movimente facilmente no interior da célula e um correcto alinhamento das três cadeias de procolagénio para posterior formação da estrutura helicoidal, com correcto enrolamento das três cadeias.
O segundo passo da formação da proteína de colagénio é a hidroxilação da prolina e da lisina, através de enzimas específicas designadas por hidroxilases, formando assim a hidroxilisina e a hidroxiprolina. As hidroxilases são enzimas que têm como cofactores a vitamina C e o ferro. Nos pacientes com défice em vitamina C esta reacção não ocorre, o que impede a formação da estrutura tridimensional, helicoidal da molécula de colagénio, sendo esta molécula de procolagénio destruída mais rapidamente devido ao seu enfraquecimento estrutural. É esta situação que constitui a base molecular do escorbuto.
A hidroxilisina é glicosilada através da adição de açúcares como a galactose e glicose. As enzimas que catalisam a etapa da glicosilação são a galactose transferase e glicose transferase que têm como cofactor o manganésio (Mn+2). A molécula de procolagénio é transportada para o espaço extracelular através de microtúbulos. As extensões terminais de péptidos do procolagénio são removidas por uma enzima designada por procolagénio proteinase. Parte destas extensões removidas re-entram dentro da célula, regulando a síntese de novas moléculas de procolagénio, constituindo assim um mecanismo de auto- regulação. Neste momento a molécula produzida é já designada por colagénio.
No espaço extracelular, a molécula de colagénio sofre nova modificação, com formação de ligações cruzadas entre o colagénio e a elastina, promovidas pela lisil-oxidase. Este é um passo crítico, pois confere resistência à molécula de colagénio.
Normalmente, o colagénio é renovado de forma muito lenta e controlada. No entanto, durante o crescimento rápido e em algumas doenças, como na artrite e em doenças oncológicas, a degradação do colagénio pode ser bastante mais rápida. Em condições normais apenas as colagenases que pertencem à família das metaloproteínases (MMPs) podem degradar a molécula de colagénio. Possuem capacidade de síntese de MMPs os fibroblastos, os macrófagos, os neutrófilos, os osteoclastos e algumas células tumorais. Uma das razões porque os tumores podem ser tão invasivos está relacionada com a produção de colagenases que degradam o colagénio saudável, podendo mesmo romper a membrana basal dos vasos sanguíneos e contribuindo assim para a metastização.
O quadro clínico do neurolatirismo inicia-se com sintomas de cãimbras nos membros inferiores e algumas vezes também podem aparecer nos membros superiores, fraqueza progressiva dos músculos das pernas, ocasionalmente pode-se observar tremores que não afectam a cabeça nem a língua, movimentos involuntário dos membros superiores, sensação de formigueiro nos membros inferiores e nas costas, micção frequente e urgente, espasmos vesiculares e esfincterianos e disfunção eréctil. (Spencer 1987) Os sintomas vão- se instalando progressivamente, surgindo paralisia com espasticidade, hiperreflexia tendinosa e reflexos plantares extensores. Estes sintomas podem estabilizar quando se suspende o agente causal. Nas crianças o crescimento é afectado. Se não for suspensa a ingestão do agente causador, as lesões observadas podem agravar-se e conduzir à morte. (Siebald 2003; Fernandez 1992; Grueso 2006)
O osteolatirismo é produzido por agentes latirogénicos como aminoacetonitrilo, o beta- aminopropionitrilo e a cisteamina, inibindo a formação da estrutura terciária da molécula de colagénio, pela inibição da enzima lisil-oxidase, responsável pelas ligações cruzadas de colagénio e elastina, diminuindo a resistência e a elasticidade da molécula. Estas toxinas produzem alterações ósseas e cartilaginosas e fragilidade muscular, conduzindo a deformidades corporais e envolvimento das paredes dos vasos sanguíneos. (Dawson 2002; Siebald 2003; Fernandez 1992; Grueso 2006)
O aminoacetonitrilo e o beta-aminopropionitrilo interferem no desenvolvimento do gérmem dentário (Hetem 1988), embora seja compatíveis com odontogénese. Existe uma concentração mínima de aminoacetonitrilo e β-aminopropionitrilo, em meio de cultura, suficiente para provocar efeitos deletérios no desenvolvimento e interferir na morfogénese dentária.
No rato sujeito a uma dieta latirogénica, ocorre maior susceptibilidade à formação de cálculo dentário, explicado por alterações metabólicas dos mucopolissacarideos e mucoproteinas da saliva. Observam-se também alterações funcionais das glândulas salivares no rato (Devoto e Abramovich 1969)
A ingestão de legumes da espécie Lathyrus durante várias semanas, é responsável por defeitos na síntese de colagénio, nomeadamente a inibição da lisil oxidase, com a não das ligações cruzadas das moléculas de colagénio. Esta alteração da estrutura do colagénio afecta a resistência e tensão das fibras do ligamento periodontal (Taverne AA, Lemmens IG, Tonino GJ; 1986)
No rato em que foi induzido o latirismo crónico, através da administração de β- aminoproprionitrilo durante 6 semanas, surgem lesões do ligamento periodontal típicas. Observa-se aumento da vascularização em especial da região apical, zonas de hialinização e calcificação das fibras transeptais, reabsorção do cemento e osso alveolar, formação típica de zonas de hialina cercadas por fibroblastos atípicos a que se dá o nome de corpos latíricos e um aumento do número de mastócitos. A acumulação de hialina está relacionada com a agressão directa ou indirecta ao ligamento periodontal, seguida da tentativa da sua reparação, com aumento da actividade fibroblástica. (Baden e Bouissou 1983; Shore 1984)
No rato latírico, observa-se uma diminuição da largura do ligamento periodontal em 11% relativamente aos animais de controlo. (Gardner 1958) Ao fim de uma semana de alimentação com sementes latirogénicas foram encontradas zonas do ligamento com hialinização parcial. Os fibroblastos apresentam-se edemaciados e delimitam as zonas de hialina, dando ao ligamento um aspecto estriado. Estas zonas de hialinização vão aumentando ao longo das semanas. Algumas das trabéculas ósseas ficam delimitadas por osteoclastos, o que indica reabsorção óssea activa. (Gardner 1958; Gardner 1960; Shore
A indução de defeitos periodontais através da colocação de uma membrana em volta dos dentes e os seus efeitos, é comparável aqueles observados aquando da indução do latirismo utilizando β-aminopropionitrilo durante 40 dias, em termos de evolução do processo inflamatório. (Keles 2005) Observam-se níveis comparáveis de IL-1β e IL-6 nas duas situações, bem como semelhanças no número e tipo de populações celulares do processo inflamatório observado, que apresentam uma predominância de linfócitos e de macrófagos. (Keles 2005)
Material e Métodos
PREPARAÇÃO DOS ANIMAIS
Neste estudo foram utilizados 30 ratos Wistar macho, com quatro semanas de idade no início do ensaio, provenientes do Biotério Central da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra. Antes de iniciar o estudo todos os animais foram submetidos a uma semana de quarentena.
Os animais foram distribuídos aleatoriamente por três grupos com igual número de indivíduos: o grupo controlo (Grupo I) e os grupos teste (Grupos II e III), cada um com 10 animais. Os animais de cada grupo foram distribuídos por gaiolas com três elementos. Os grupos II e III foram submetidos à administração de semicarbazida incorporada na dieta nas doses de 3g/kg e 6g/kg respectivamente.
Os ratos foram mantidos nas condições padrão do biotério: temperatura de 22 ºC e 60-65% de humidade, com regime de 12 horas de luz e 12 horas de escuridão. Os animais do grupo controlo, foram mantidos com água ad libitum e ração standardizada durante quatro semanas, findas as quais foram sacrificados todos os animais. Os elementos dos grupos teste, foram mantidos com água ad libitum e a ração modificada durante quatro semanas, após as quais foram sacrificados.
A vigilância para rastreio de alterações patológicas foi diária, com observação dos seus hábitos alimentares.
Todos os animais foram eutanasiados ao fim de quatro semanas de estudo e necropsiados. A eutanásia foi realizada por sobredosagem anestésica utilizando a associação cetamina 50mg/ml (Ketalar®, Pfizer) e cloropromazina 50mg/2ml (Largatil IV, Lab. Victória) por injecção intramuscular.
Na necrópsia foram registados os dados referentes à observação do hábito externo, observação detalhada do hábito interno e fragmentos de tecidos colhidos e respectiva finalidade, em modelo próprio em utilização no Instituto de Patologia Experimental.
Em todos os animais foram colhidos para histopatologia de rotina as hemimandíbulas direita e esquerda.
Todos os fragmentos colhidos para histopatologia de rotina, depois de descalcificados em solução de EDTA, foram incluídos em parafina e foram realizados cortes no micrótomo com quatro micrómetros de espessura. Destas amostras foi feito o estudo histológico de rotina, usando a metodologia padrão para coloração de Hematoxilina e Eosina.
Para cada hemimandíbula de cada indivíduo, foram realizadas 2 fotografias dos cortes histológicos transversais corados com Hematoxilina e Eosina.
A análise morfométrica foi realizada com o auxílio do programa SigmaScan Pro®, que permitiu a medição das áreas de hialinização e do ligamento periodontal, com cada uma das fotografias em pixel.
Para que seja possível a comparação entre os diferentes casos, estudamos um rácio R, em que comparamos a área de hialinização com a área de ligamento periodontal (R= área total de hialinização/ área do ligamento periodontal).
