Micotoxinas, cap.24, Notas de estudo de Química

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MICOTOXINAS

XXIV

CAPÍTULO

Capítulo XXIV - Micotoxinas

Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital

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Métodos Físico-Químicos para Análise de Alimentos - 4ª Edição 1ª Edição Digital

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Por se tratar de importante problema de saúde pública, à análise de micotoxinas devem ser empregados métodos que proporcionem credibilidade e confiabilidade aos resultados analíticos emitidos pelo laboratório.

Riscos no manuseio de micotoxinas

A micotoxina pura na forma de cristal (sal), especialmente as aflatoxinas, pela sua natureza eletrostática, tende a se dispersar na área do laboratório. Precauções especiais são necessárias para se evitar a contaminação do ar, bancadas, paredes e frascos. Recomenda-se lavar o local contaminado com solução de hipoclorito de sódio a 5% e acetona. Durante o manuseio das micotoxinas, torna-se necessário o uso de luvas e máscaras. O preparo de soluções-padrão a partir de micotoxinas na forma cristalina deve ser realizado em capela de exaustão de vapores orgânicos. Descontamine o material utilizado no laboratório com solução de hipoclorito de sódio a 5% e acetona antes de ser descartado.

As micotoxinas e a amostragem

O processo de amostragem, prévio à atividade laboratorial, é responsável pelo su- cesso ou fracasso de uma informação analítica. Excetuando os líquidos, os outros produ- tos têm uma distribuição heterogênea quando contaminados. Sabe-se que as aflatoxinas em um lote de amendoim podem estar concentradas em até 0,5% dos grãos e que alguns deles podem estar contaminados com teores excessivamente elevados. Até mesmo a distri- buição destas micotoxinas em um único grão de amendoim não é uniforme e pode estar concentrada em uma pequena área superficial do grão.

O conhecimento ou o estabelecimento prévio dos riscos envolvidos na amostra- gem, que é a etapa determinante na variação dos resultados analíticos, torna-se essencial para que todo processo de análise não seja invalidado e, na maioria das vezes, gerando resultados sem qualquer significado analítico.

Considerando as aflatoxinas como exemplo, por serem as mais estudadas, o erro de amostragem tem sido demonstrado ser grande. Os grãos individuais de amendoim podem conter esta micotoxina em até 1000000 ng/g, caroços de algodão mais do que 5000000 ng/g e grãos de milho até 400000 ng/g. Estes extremos na concentração de afla- toxinas em unidades individuais do produto explica a grande variabilidade nos resultados de um lote em particular e a extensão do erro na amostragem.

A literatura descreve vários planos de amostragem que, para aplicação em análises fiscais torna-se inviável, mas como sugestão indicamos algumas referências, para análise de micotoxinas que integram a Resolução-RDC nº 274, de 15/10/2002, publicada no DOU em 16/10/2002 e de uma que consta da Diretiva da Comissão Européia: 1-Directive 98/53/EC 2-FAO Foods and Nutrition Paper, 55, Rome, 1993. 3-Norma FIL-IDF 50 B, 1985. Métodos de amostragem para leite e produtos lácteos.

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4-Norma ISO 950, 1979. Amostragem de cereais em grãos. 5-Waltking, A.E. Amostragem e preparação de amostras de manteiga de amendoim para análise de aflatoxinas. J.A.O.A.C. 63:103-106, 1980.

401/IV Determinação de aflatoxina M 1 em leite por cromatografia em camada delgada

Este método baseia-se na extração com solvente orgânico, limpeza com celite e par- tição liquido-liquido, extração com clorofórmio, separação por cromatografia em camada delgada (CCD), quantificação visual por comparação com padrão e confirmação por de- rivatização com ácido trifluoroacético. O limite de quantificação do método é 0,3 μg/L.

Material

Agitador mecânico horizontal, balança semi-analítica, banho-maria ou rotavapor, cabine com lâmpada UV onda longa (λ = 366 nm), capela de exaustão para solventes orgânicos, espectrofotômetro UV/VIS, bastão de vidro, balão volumétrico, béquer de 500 mL, cuba cromatográfica, frasco Erlenmeyer de 500 mL, frasco âmbar de 5 mL, funil, funil de separação de 1000 mL, proveta de 100 mL, pipeta de 10 mL, microsseringas de 10, 25 e 100 μL, papel de filtro qualitativo e cromatofolha ou cromatoplaca de sílica gel G sem indicador de fluorescência (20 x 20) cm.

Reagentes

Acetona Acetonitrila Ácido sulfúrico (1:3) Benzeno Celite Cloreto de sódio Clorofórmio Hexano Isopropanol Metanol Nitrogênio Aflatoxina M 1 padrão Sulfato de sódio anidro Tolueno Ácido trifluoroacético – TFA Solução TFA – Misture ácido trifluoroacético e hexano na proporção de 1:3 v/v

Procedimento

Preparação e veridicação de soluções-padrão – Proceda conforme 403/IV

Capítulo XXIV - Micotoxinas

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Aflatoxina M 1 parece estar associada à fração protéica do leite (caseína), estando assim presente não somente nos tipos fluido ou em pó como também em seus produtos derivados. Este método é aplicado para determinação de Aflatoxina M 1 em amostras de leite. O limite de quantificação (LQ) do método é 0,02 μg/L.

Material

Cabine com lâmpada UV onda longa (λ =366 nm), capela de exaustão para solventes or- gânicos, centrífuga, cromatógrafo líquido de alta eficiência, espectrofotômetro UV/VIS, suporte coletor de amostra a vácuo ( Manifold ), balão volumétrico, cuba cromatográfica, frasco âmbar de10 mL, microsseringas de 10, 50, 100 e 500 μL, cromatofolhas ou croma- toplacas de sílica gel G sem indicador de fluorescência (20 x 20) cm, proveta de 100 mL, seringas de vidro de 10 e 20 mL, tubo para centrífuga de polipropileno de 50 mL e vials para injetor automático de 1 mL.

Reagentes

Ácido acético glacial Ácido trifluoroacético Acetona Acetonitrila, grau CLAE Ácido sulfúrico (1:3) Benzeno Clorofórmio Coluna de imunoafinidade para AFM 1 Coluna fase reversa (C 18 ) para CLAE (25 x 0,4) cm Isopropanol Metanol, grau CLAE Nitrogênio Padrão de Aflatoxina M 1 Tolueno Solução-padrão de AFM1 – Proceda conforme 403/IV

Procedimento

Preparação e tratamento da amostra por CCD – Centrifugue 100 mL de leite por 15 minutos a 3000 rpm. Remova o sobrenadante e aqueça a (30-37)oC. Transfira o leite centrifugado para uma seringa acoplada à coluna de imunoafinidade, e passe a amostra lentamente pela coluna com o fluxo de (2-3) mL/min sob pressão constante. Após passar

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todo o volume, lave com 40 mL de água deionizada. Elimine toda a água residual da co- luna e elua com 2,5 mL da solução de acetonitrila-metanol (3:2), retendo a solução por 30 segundos na coluna antes de iniciar a eluição e, em seguida, com 2,5 mL de metanol, invertendo suavemente o fluxo por 3 vezes durante a eluição. Recolha a amostra em um frasco âmbar. Evapore o extrato eluído sob corrente de nitrogênio.

Separação por cromatografia em camada delgada, quantificação e confirmação – Res- suspenda a AFM 1 com 150 μL de tolueno-acetonitrila (90:10). Aplique, sobre a placa cromatográfica, 50 μL do extrato da amostra e também 1 a 7 μL da solução-padrão de AFM 1 a 0,2 μg/mL. Desenvolva a placa em clorofórmio-acetona-isopropanol (87:10:3). Remova a placa após 12 cm de desenvolvimento do solvente e deixe secar naturalmente ao ar. Sob luz UV (λ=366 nm), localize as manchas fluorescentes indicativas da presen- ça de AFM 1. Manchas fluorescentes com o mesmo Rf e mesma tonalidade do padrão indicam resultados positivos presuntivos. Efetue a quantificação por comparação visual da intensidade de fluorescência da mancha suspeita com a do padrão. Se a intensidade de fluorescência da mancha da amostra for maior ou menor que a dos padrões, dilua ou concentre a amostra e recromatografe. Pulverize a placa com H 2 SO 4 (1+3). Deixe secar e observe sob lâmpada UV longa. A fluorescência da AFM 1 muda de azul para amarelo, indicando a presença da referida micotoxina. Para a confirmação da AFM 1 é utilizado o ácido trifluoroacético (TFA).

Reação com ácido trifluoroacético-hexano (1+3) – Divida uma placa verticalmente em duas regiões e em cada uma delas cromatografe dois pontos da amostra e dois do padrão. Em uma das regiões sobreponha 1 μL da solução de TFA em um dos pontos da amostra e em um dos padrões. Aqueça a placa por 10 minutos a (35 - 40)°C e desenvolva o cro- matograma com clorofórmio-acetona (85+15). Examine a placa sob lâmpada UV longa. A AFM 1 com TFA aparecerá em 1/3 do Rf da aflatoxina original.

Preparação e/ou tratamento da amostra por CLAE – Centrifugue 50 mL de leite por 15 minutos a 3000 rpm. Remova o sobrenadante e aqueça a (30-37)oC. Transfira o leite centrifugado para uma seringa acoplada à coluna de imunoafinidade e passe a amostra lentamente pela coluna, fluxo de (2-3) mL/min sob pressão constante. Após passar todo o volume, lave com 10 mL de água. Elimine toda a água residual da coluna e elua com 1,25 mL da solução de acetonitrila-metanol (3:2), retendo a solução por 30 segundos na coluna antes de iniciar a eluição e em seguida 1,25 mL de metanol, invertendo o fluxo suavemente por 3 vezes durante a eluição. Recolha a amostra eluída em um frasco âmbar. Evapore a amostra eluída sob corrente de nitrogênio até resíduo para o procedimento de separação e quantificação.

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DRAGACCI, S.; GROSSO, F., GILBERT, J. Immunoaffinity Column Cleanup with Liquid Chromatography for Determination of Aflatoxin M 1 in Liquid Milk: Collaborative Study. Journal of A.O.A.C. International, v. 84, n. 2, p. 437-443, 2001.

GALVANO, F.; GALOFARO, V.; GALVANO, G. Occurrence and stability of Aflatoxin M 1 in milk and milk products: a worldwide review. J. Food Prot. , v. 59, n. 10, p. 1079-1090, 1996.

403/IV Determinação de aflatoxinas por cromatografia em camada delgada

Este método é aplicado para a determinação de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 em sementes oleaginosas, cereais e seus produtos e também em rações. As aflatoxinas são extraídas com clorofórmio e com posterior remoção de interferentes por partição líquida com metanol-água-hexano. Os componentes são determinados pela comparação da in- tensidade de fluorescência das amostras com a dos padrões por cromatografia em camada delgada. O método pode alcançar um limite de detecção de 2,0 μg/kg (ppb) e limite de quantificação de 3,0 μg/kg (ppb).

Material

Espectrofotômetro UV/VIS com cubetas de quartzo de 1 cm de caminho óptico, ga- binete com lâmpada ultravioleta de 15 watts e comprimento de onda 366 nm, balan- ça analítica, balança semi-analítica, agitador mecânico, banho-maria com temperatura controlada ou rotavapor, estufa, banho ultra-som, cilindro de nitrogênio, moinho ou liquidificador, peneiras de 20 mesh , capela para solventes orgânicos, béqueres de 10 e 25 mL, frascos Erlenmeyer de 25 mL e de 250 ou 300 mL, provetas 50 e 100 mL, bastão de vidro, funil de vidro, papel de filtro Whatman n°^ 4 ou equivalente, funil de separação de 250 ou 500 mL com torneira de teflon, pipeta graduada 10 mL, microsseringas de 10, 25 e 500 μL, cuba cromatográfica de vidro para placas de (20 x 20) cm, pulverizador para placas cromatográficas, balões volumétricos de 50 e 2000 mL, pipetas volumétricas de 1 e 25 mL e cromatoplacas ou cromatofolhas (20 x20) cm de sílica gel G sem indicador de fluorescência

Reagentes

Metanol Clorofórmio Hexano Acetonitrila Benzeno

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Tolueno Acetato de etila Ácido fórmico Acetona Hhyflo-super cel, tipo celite ou equivalente Solução de NaCl ou KCl 4% m/v Ácido sulfúrico Ácido trifluoroacético (TFA) Solução de TFA-hexano (1:3), recém-preparada Sistema de solventes para desenvolvimento da cromatografia em camada delgada: Tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) Acetona-clorofórmio (10:90) Tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (60:30:10) Clorofórmio-acetona-isopropanol (85:12,5:2,5) Benzeno-metanol-ácido acético (90:5:5) Solução aquosa de ácido sulfúrico (1+3)

Soluções-padrão de aflatoxinas – Dissolva os padrões de B 1 , B 2 , G 1 e G 2 com volumes adequados da mistura benzeno-acetonitrila (98:2), para que se obtenha concentrações aproximadas de (1,0 a 2,5) μg/mL.

Solução de ácido sulfúrico 0,009 M – Pipete 1 mL de ácido sulfúrico, transfira para um balão de 2000 mL e complete o volume com água.

Solução A (K 2 Cr 2 O 7 0,25 mM) – Pese aproximadamente 78 mg de dicromato de potássio previamente dessecado e dissolva em 1000 mL de ácido sulfúrico 0,009 M.

Solução B (K 2 Cr 2 O 7 0,125 mM) – Pipete 25 mL da Solução A, transfira para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M.

Solução C (K 2 Cr 2 O 7 0,0625 mM) – Pipete 25 mL da Solução B, transfira para um balão volumétrico de 50 mL e complete o volume com solução de ácido sulfúrico 0,009 M.

Procedimento

Avaliação de desempenho do espectrofotômetro – Leia as absorbâncias das soluções A, B e C a 350 nm, usando como branco a solução de ácido sulfúrico 0,009 M.

Capítulo XXIV - Micotoxinas

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Tabela 1 – Propriedades físico-químicas de algumas micotoxinas

Micotoxinas Solventes*

Comprimento de onda (λ) nm

Absortividade Molar (ε)

Peso molecular

Aflatoxina B 1

1 2 3 4 5

360 350 350 345 350

21800 19800 20600 20300 19100

312

Aflatoxina B 2 12 362350 2400020900 314

Aflatoxina G 1 12 362350 1770017100 328

Aflatoxina G 2 12 362350 1930018200 330 Aflatoxina M 1 6 350 18815 328

Solvente 1 = metanol Solvente 2 = benzeno-acetonitrila (98:2) Solvente 3 = clorofórmio Solvente 4 = heptano Solvente 5 = tolueno Solvente 6 = benzeno-acetonitrila (9:1)

Nota s Recomenda-se a substituição do solvente contendo benzeno por um outro menos tóxico.

A verificação dos padrões deve ser efetuada de acordo com a periodicidade do uso.

Preparação da amostra – Triture ou moa, de acordo com a natureza da amostra, a fim de que se obtenha massa homogênea, podendo utilizar liqüidificador, moinho ou moedor de carne. Passe a amostra pela peneira de 20 mesh. Homogeneíze novamente e retire uma sub-amostra de 30 g.

Extração e purificação – Pese 30 g da amostra previamente homogeneizada e transfira para um frasco Erlenmeyer. Adicione cerca de 10 mL de água aquecida a 60oC para facili- tar a penetração do solvente orgânico nos tecidos hidrofílicos. Homogeneíze com bastão de vidro. Adicione 100 mL de clorofórmio, tampe o frasco com algodão e agite manu- almente por 30 segundos. Prossiga esta operação com agitador mecânico por mais 30

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minutos. Filtre o extrato clorofórmico em funil de vidro com papel de filtro qualitativo. No caso de amostra de amendoim ou derivados, adicione pequena quantidade de celite ao funil para acelerar a filtração. Colete 50 mL do extrato em outro frasco Erlenmeyer e evapore em banho-maria a 80oC até que todo o clorofórmio tenha sido eliminado. Res- suspenda o resíduo com 50 mL de metanol, transfira quantitativamente para o funil de separação, adicione 50 mL da solução de NaCl a 4% e agite lentamente. Extraia as gor- duras e os demais interferentes com três porções de 50 mL de hexano. Descarte a fração com hexano (superior). Recolha o extrato metanólico em béquer ou frasco Erlenmeyer. Transfira quantitativamente o extrato metanólico para um funil de separação limpo e ex- traia as aflatoxinas com 50 mL de clorofórmio, agitando o funil de separação suavemente por três minutos. Deixe as fases se separarem e recolha a inferior (clorofórmio) em frasco Erlenmeyer de 250 mL. Repita a operação com mais 50 mL de clorofórmio. Recolha o total de clorofórmio juntamente com o extrato da primeira partição e evapore em banho- maria a 80oC ou rotavapor a (50-60)°C. O resíduo deve ser transferido quantitativamente com clorofórmio para um frasco Erlenmeyer de 25 ou 50 mL e evaporado sob corrente de nitrogênio. Para efetuar a cromatografia em camada delgada, dissolva o resíduo em clorofórmio em quantidade adequada, normalmente entre 200 a 500 μL e utilize banho de ultra-som por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução das aflatoxinas.

Triagem das micotoxinas por cromatografia em camada delgada – Aplique em placa de sílica gel, 5 a 10 μL da amostra e alguns pontos de cada padrão, separadamente, fazendo sobrepor no segundo ponto do padrão 5 μL da amostra. Desenvolva o cromatograma em cuba previamente preparada para garantir a saturação com tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10). Remova a placa depois de 12 cm de desenvolvimento do solvente e seque. Observe o cromatograma sob lâmpada de luz UV de comprimento de onda longo. Amostras suspeitas de conterem aflatoxinas devem ser quantificadas e confirmadas sepa- radamente.

Quantificação – Aplique, nas placas 1, 3, 5, 7 μL dos padrões e 5 e 10 μL de cada amostra. Desenvolva as placas em clorofórmio-acetona (90:10) ou em tolueno-acetato de etila-áci- do fórmico (50:40:10). Compare a intensidade da fluorescência da mancha da micotoxi- na da amostra com a dos padrões e determine qual das manchas da amostra corresponde a do padrão. Se a intensidade da fluorescência da mancha de menor volume utilizado da solução de amostra for maior do que a do padrão, dilua a amostra e recromatografe.

Confirmação da identidade das aflatoxinas – Realize a cromatografia bi-dimensional, uti- lizando a fase 1: clorofórmio-acetona-hexano (85:15:20) ou clorofórmio-acetona (90:10) e a fase 2: tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (50:40:10) e faça o teste químico com ácido sulfúrico (1+3) e reação com ácido trifluoroacético, descrito a seguir:

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INSTITUTO ADOLFO LUTZ Normas analíticas do Instituto Adolfo Lutz. v.1, Métodos químicos e físicos para análise de alimentos. 2a^ ed. São Paulo: IMESP, 1976. p. 323-325.

PRZYBYLSKI, W. Formation of aflatoxin derivatives on thin-layer chromatographic plates. J. Assoc. Off. Analyt. Chem. , v. 58, p. 163-164, 1975.

VELASCO, J. Replacement of benzene as a solvent for aflatoxin standards. J. Am. Oil Chem. Soc. , p. 938A-940A, 1981.

STACK, M.E.; POHLAND, A.E. Colaborative study of a method for chemical confirmation of the identity of aflatoxin. J. Assoc. Off. Analy. Chem. , v. 58, p. 110- 113, 1975.

404/IV Determinação de aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 por CCD após separação em coluna de imunoafinidade

O objetivo do método refere-se à determinação das aflatoxinas B 1 , B 2 , G 1 e G 2 em milho, amendoim e produtos derivados. As aflatoxinas são extraídas com solução aquosa de metanol e purificadas em uma coluna de imunoafinidade, onde anticorpos mono- clonais específicos ligam-se aos antígenos, as aflatoxinas, sendo posteriormente eluídas, cromatografadas em placas de sílica gel e visualizadas as fluorescências sob luz ultravioleta. O limite de quantificação (LQ) do método é 2 μg/kg.

Material

Liqüidificador, provetas, balança semi-analítica, coluna de imunoafinidade para aflato- xinas, funil, manifold , béqueres, frasco âmbar, papel de filtro Whatman no^ 4, seringas de vidro de 10 mL, pipeta de 2 mL, cromatoplacas, microsseringas e cuba cromatográfica.

Reagentes

Metanol Metanol, grau CLAE Cloreto de sódio

Procedimento

Preparação da amostra – Pese 50 g da amostra previamente triturada, e 4 g de NaCl, e

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transfira para o copo do liqüidificador juntamente com 250 mL de uma solução de meta- nol-água deionizada (60:40). Triture por 1 minuto em alta velocidade. Ao término deste tempo, adicione 250 mL de água deionizada. Misture e filtre aproximadamente (25 a 50) mL em papel de filtro Whatman no^ 4. Transfira 10 mL do filtrado para a seringa de vidro acoplada à coluna de imunoafinidade sobre o manifold. Na coluna de imunoafinidade, passe a amos- tra em um fluxo de 2 a 3 mL por minuto, lave com 20 mL de água deionizada e elimine toda a água residual da coluna. Elua as aflatoxinas passando 2 mL de metanol e colete em frasco âmbar. Evapore até à secura sob corrente de nitrogênio.

Cromatografia em camada delgada – Ressuspenda o resíduo em clorofórmio ou tolueno- acetonitrila (9:1) em quantidade adequada, normalmente 100 μL e utilize banho de ul- tra-som por cerca de 30 segundos para assegurar total dissolução das aflatoxinas. Aplique, em cromatofolha ou cromatoplaca de sílica gel, 10 μL da amostra, duas vezes. Sobre a 2ª mancha do extrato, aplique uma quantidade adequada dos padrões (B 1 +B 2 +G 1 +G 2 ). Na mesma placa aplique: 1, 3, 5 e 7 μL de padrão de aflatoxinas. Desenvolva o cromatograma em cuba cromatográfica previamente saturada com tolueno-acetato de etila-ácido fórmi- co (5:4:1) ou clorofórmio-acetona (9:1). Remova a placa após 12 cm de desenvolvimento e deixe secar naturalmente ao ar. Sob luz UV de comprimento de onda longa, localize as manchas fluorescentes com o mesmo Rf e mesma tonalidade do padrão. As amostras suspeitas de conterem aflatoxinas devem ser quantificadas e confirmadas.

Quantificação – Para a quantificação de aflatoxinas, separe-as previamente desenvolvendo as placas em clorofórmio-acetona (9:1) ou tolueno-acetato de etila-ácido fórmico (5:4:1). Compare a intensidade da fluorescência da mancha da amostra com a do padrão e deter- mine qual das manchas da amostra corresponde a uma dos padrões. Se a intensidade da fluorescência da mancha de menor volume de amostra for maior que a do padrão, faça a diluição necessária e recromatografe.

Teste confirmatório da presença de aflatoxinas – Poderá ser realizado pelas seguintes téc- nicas:

a) reação com ácido sulfúrico – Pulverize a placa com H 2 SO 4 (1+3). Deixe secar e observe sob lâmpada UV. A fluorescência da aflatoxina muda de azul (AFB 1 ) ou verde (AFG 1 ) para amarelo. Este teste somente confirma a ausência de aflatoxinas nas amostras que não mudarem para a cor amarela.

b) reação com TFA (ácido trifluoroacético) – Marque uma placa verticalmente, di- vidindo-a em duas regiões e em cada uma delas cromatografe dois pontos de amos- tra e dois de padrão. Em uma das regiões, sobreponha 1 μL de TFA em um dos pon-

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Reagentes

Padrão de desoxinivalenol (DON) Acetonitrila Clorofórmio Acetona Isopropanol Tricloreto de alumínio Alumina ativada Carvão ativo Celite Sílica gel G 60 Hexano

Solução de AlCl 3 a 15% m/v – Pese 15 g de tricloreto de alumínio. Transfira para um balão volumétrico de 100 mL, dissolva e dilua ao volume com a mistura de etanol-água (1:1).

Solução-padrão de DON – Dissolva o padrão em acetato de etila tal que a concentração final seja aproximadamente 100 μg/mL.

Procedimento

Verificação da concentração da solução-padrão de DON – Faça a leitura da absorbância no espectrofotômetro UV/VIS a 260 nm e calcule a concentração de DON conforme fórmula abaixo:

A = absorbância PM = peso molecular do padrão f = fator de correção do aparelho ε = absortividade molar do DON em acetato de etila (1410)

Preparação da amostra – Pese 50 g de amostra moída. Adicione 200 mL da mistura de acetonitrila-água (84:16) e deixe em contato com agitação mecânica por 30 minutos. Filtre e transfira 20 mL do filtrado para funil de separação. Extraia a gordura com hexano três vezes com 50 mL (o hexano fica na parte superior). Reserve o extrato e passe pela coluna cromatográfica.

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Preparação da coluna cromatográfica – Coloque lã de vidro na parte inferior da colu- na, em quantidade suficiente para bloquear a fase estacionária. Pese e homogeneíze em um frasco Erlenmeyer de 25 mL, a mistura de 0,7 g de carvão ativo, 0,5 g de alumi- na e 0,3 g de celite. Coloque esta mistura aos poucos, na coluna cromatográfica com ajuda da bomba de vácuo. Lave a coluna com 10 mL da solução de acetonitrila-água (84:16) e descarte o solvente de lavagem. Passe os 20 mL do filtrado na coluna e lave com 10 mL de solução de acetonitrila-água (84:16) e recolha o extrato em frasco Erlenmeyer de 50 mL. Evapore em banho-maria até secagem. Elua, em frasco Erlenmeyer de 10 mL, com ± 5 mL de acetato de etila e evapore em banho-maria sob corrente de nitrogênio. Elua o resíduo com 200 μL de uma mistura de clorofórmio-acetonitrila (4:1). Aplique na cro- matoplaca de sílica gel G sem indicador de fluorescência, 10, 20, 30 μL da amostra e 5 e 10 μL do padrão. Desenvolva o cromatograma com clorofórmio-acetona-isopropanol (80:10:10). Remova a placa após 12 cm de desenvolvimento e deixe secar naturalmente ao ar. Pulverize com solução de AlCl 3 a 15%. Aqueça em estufa a 120°C durante 7 minu- tos e observe sob luz UV longa.

Quantificação – Compare a intensidade da fluorescência da mancha de desoxinivalenol da amostra com as do padrão e determine qual das manchas da amostra corresponde a uma das do padrão. Se a intensidade da fluorescência da mancha correspondente ao me- nor volume aplicado de amostra for maior que a do padrão, a amostra deverá ser diluída convenientemente e recromatografada.

Cálculo

S = μL da solução-padrão de micotoxina com mancha com fluorescência igual à da amos- tra Y = concentração da micotoxina padrão em μg/mL usada na cromatografia V = μL do solvente requerido para diluir o extrato final Z = μL do extrato da amostra com mancha de intensidade da fluorescência igual a do padrão W = gramas de amostra contida no extrato final.

Referências bilbiográficas

ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS. Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists .15 th^ ed., v. 2. Arlington: