PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM
DEAE -CELULOSE
•Os assuntos abordados nessa aula são:
- Dosagem de proteínas
- Métodos cromatográficos para separação de
proteinas e para a separação de imunoglobulinas
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Guias e Dicas
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Encontrar documentos
Prepare-se para as provas com trabalhos de outros alunos como você, aqui na Docsity
Pesquisar documentos Store
Os melhores documentos à venda: Trabalhos de alunos formados
Videoaulas
Prepare-se com as videoaulas e exercícios resolvidos criados a partir da grade da sua Universidade
Quiz
Responda perguntas de provas passadas e avalie sua preparação.
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Comunidade
Pergunte à comunidade
Peça ajuda à comunidade e tire suas dúvidas relacionadas ao estudo
Ranking universidades
Descubra as melhores universidades em seu país de acordo com os usuários da Docsity
Guias grátis
Os eBooks que salvam estudantes!
Baixe gratuitamente nossos guias de estudo, métodos para diminuir a ansiedade, dicas de TCC preparadas pelos professores da Docsity
Métodos de Separação de Proteínas: Dosagem de Proteínas e Métodos Cromatográficos, Notas de aula de Materiais
Nesta aula, abordamos os assuntos de dosagem de proteínas e métodos cromatográficos para separação de proteínas e imunoglobulinas. Aprenda sobre os métodos baseados em mudanças espectrales, interações com proteínas, e métodos de lowry e biureto. Além disso, saiba como medir o conteúdo de proteínas e separá-las usando cromatografia de troca iônica e gel filtração.
O que você vai aprender
- Como funciona a interação entre proteínas e reagentes em métodos de dosagem de proteínas?
- Quais são as vantagens e desvantagens da cromatografia de troca iônica e gel filtração?
- Qual é a função do método de Lowry na determinação de conteúdo de proteínas?
- Qual é a importância de dosar proteínas em biologia molecular?
- Quais são os métodos cromatográficos utilizados para separação de proteínas?
Tipologia: Notas de aula
2022
1 / 22
Esta página não é visível na pré-visualização
Não perca as partes importantes!
Documentos relacionados
Pré-visualização parcial do texto
Baixe Métodos de Separação de Proteínas: Dosagem de Proteínas e Métodos Cromatográficos e outras Notas de aula em PDF para Materiais, somente na Docsity!
PURIFICAÇÃO DE IgG ATRAVÉS DE
CROMATOGRAFIA DE TROCA IÔNICA EM
DEAE -CELULOSE
- Os assuntos abordados nessa aula são:
- Dosagem de proteínas
- Métodos cromatográficos para separação de
proteinas e para a separação de imunoglobulinas
Métodos de Isolamento de Biomoléculas
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede
os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D
e a compreensão de suas propriedades biológicas.
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada proteína
individualmente. Não há como prever quais métodos serão os mais
eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.
Métodos de
purificação
1 proteína
isolada
Proteínas de uma célula
ORGANELAS
Lisossomos^ Lisossomos Mitocôndria^ Mitocôndria Golgi Golgi Núcleo Núcleo
SOBRENADANTE
F (^1) F 2 F 3 F (^4)
F (^2) .1 F^2 .2 F (^2).
F (^2) .3.1 F^2 .3.2...... F (^) 2. 3.N
Precipitação com Sal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatografia Troca Iônica
Cromatografia Troca Iônica (pH ou resina diferente)
F (^2) .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
O fluxograma ao lado representa a
“marcha” de purificação de uma proteína,
mostrando as etapas sucessivas, cada
uma consistindo de método, que levam ao
isolamento de uma proteína presente
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas
(100g) presente no material inicial e
quanto da proteína purificada se obtém no
final (0,001g). Esses números são típicos
para a purificação da maioria das
proteínas, em especial enzimas.
Em cada etapa, a proteína de interesse é
separada das demais com base em uma
propriedade diferente. Consequente-
mente, as proteínas ainda misturadas com
aquela que está sendo isolada são cada
vez mais semelhantes em suas
características físico-químicas, exigindo
métodos cada mais sensíveis , capazes
de explorar pequenas diferenças, para se
chegar à proteína pura.
BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou 4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
Reagente Bradford = Coomassie Brilliant Blue G-
Método baseado em uma mudança espectral do reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor azul), quando interage com proteínas. Interação com proteínas se dá através de forças de Van der Waals e ligações iônicas, especialmente com arginina, mas também com resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e fenlialanina.
Ìons Cu2+^ reduzidos a Cu+^ em presença de proteínas reagem fortemente com o BCA formando um composto azul,
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+^ em tartarato
Cu2+^ reage com as ligações peptídicas e produz um complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm
- Cu2+^ é quelado pela proteína [ Cu2+-proteina ]
- Reação redox Cu2+^ + (ligações peptídicas) —> [ Cu+^ -proteína]
Ìons Cu2+^ reduzidos a Cu+^ em presença de proteínas e cadeias laterais de aminoácidos aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo- mobidênio-tungstênio), dando um composto de cor azul.
Método de Lowry
Métodos para medida do conteúdo de proteína:
2.2.- Método:-
2.2.1.- Deixe o volume de tampão imediatamente acima da coluna abaixar
abrindo cuidadosamente a coluna, e aproveite para regular o fluxo da coluna
para 12 gotas por minuto. Quando não houver mais tampão acima da resina e
com a coluna fechada, deve ser adicionada a solução de gama globulina, com
muito cuidado e com o auxílio da micropipeta. Em seguida, abrir vagarosamente
a coluna para deixar a solução de gama globulina entrar na resina, fechando a
coluna quando isso ocorrer. Adicionar, a seguir, com muito cuidado, um volume
de tampão de eluição. Conectar com o frasco de tampão com cânula e sifonado
de modo a permitir um fluxo continuado de tampão para a coluna de resina. Abrir
o fluxo da coluna, começar a colher as frações de 3 ml cada uma, aferindo o
fluxo novamente para 12 gotas por minuto.
2.2.2.- Testar de cada fração colhida, por coloração rápida e com reativo
apropriado em uma microplaca, a presença de proteína, misturando-se l da
fração com l do reativo.
2.2.3.- Faça a leitura das frações colhidas em espectrofotômetro UV, no
comprimento de onda de 280nm, contra um branco de tampão fosfato 0,005M
pH 8,0.
2.2.4.- Faça um pool das frações com maior concentração proteíca e armazene
a -20ºC para ser testada na próxima aula, por imunoeletroforese.
Gama-Globulina
3ml
12 gotas/min
Assunto 04- figura 01
Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é
necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
Membrana de celofane
solvente
solução a ser dialisada
Aos precipitados obtidos com sal ou
solvente, adiciona-se água.
Ao precipitado obtido com variação
de pH, retornar ao pH original.
início final
Dt
Concentração Tempo ou volume
Coletor de frações
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo 1
Mais tampão é colocado na coluna, forçando os componentes da amostra a interagirem com a resina
Componentes da amostra se separam e saem da coluna com diferentes volumes de tampão
Tempo 2 Tempo n
Líquido que sae da coluna é recolhido em tubos de um coletor de frações
Os componentes da mistura são separados por interação diferenciada com a resina, com base em propriedades moleculares como:
- massa molecular
- carga elétrica
- solubilidade
- afinidade
Amostra com diferentes componentes
Resina embebida em tampão
Tempo zero
Um cromatograma, como o gráfico ao lado, é a maneira usual de se representar o resultado de uma cromatografia.
Cromatografia de gel filtração ou peneira molecular
grãos (beads) da resina com poros
grão da resina poroso
proteína grande proteína pequena
Tampão “empurra” moléculas através da resina
tubos
Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo).
Proteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com um
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
Absorbância a 280 nm
volume
Medida da ativ. biológica
Moléculas maiores
Moléculas menores
Kav
Massa molecular (kD)
20 40 60 80 100 120 mL
25 50 75 100 125 mL
volume de eluição
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Curva de calibração
traçado da medida de atividade biológica nas frações
Medir o volume de eluição da fração mais ativa. Transportar para a curva de calibraçao.
Ler a massa correspondente
Observa r a escala log
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção
Eluição
Moléculas com a mesma carga, ou sem carga, não interagem com a resina, sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em competição entre os íons em solução e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl-^ +
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas:
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a
mesma carga;
2) eluição das proteínas adsorvidas.
+
+ +
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a
interação entre as proteínas e a resina.
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da
concentração do sal no tampão, pois alterações
de pH podem desnaturar proteínas, levando-as a
precipitar dentro da coluna.
ácido PI
básico
neutro^ -
-COOH -COO
-NH 3
H+
H+
-NH 2
Como funciona a Cromatografia de Troca Iônica
O processo da cromatografia de troca iônica depende da diferença de ponto isoelétrico
das proteínas na amostra e das condições escolhidas de pH e de força iônica.
Proteína P.I. Pepsina <1, Ovalbumina galinha 4, Albumina sérica humana 4, Tropomiosina 5, Insulina bovina 5, Fibrinogênio humano 5, Gama-globulina 6, Colágeno 6, Mioglobina equina 7, Hemoglobina humana 7, Ribonuclease A bovina 7, Citocromo C equino 10, Histona bovina 10, Lisozima, galinha 11, Salmina, salmão 12,
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas apresentam carga positiva quando em meio ácido em relação ao seu PI, e carga negativa, quando em meio alcalino em relação ao seu pI. Nesse caso, a referência para se dizer que o meio é ácido ou básico é o PI da proteína, e não o pH do meio.
A carga das proteínas varia em função do pH do meio, pois o pH influencia o estado de dissociação das cadeias laterais dos aminoácidos ácidos e básicos.
Tipos de Resina de troca Iônica
Tipos de Resina de troca Iônica
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH 2 N+(CH 3 ) 3 Troca aniônica resina de polistireno Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO 3 - H Troca Catiônica resina de polistireno DEAE -celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH 2 CH 2 N+(C 2 H 5 ) 2 ácidas e neutras CM -celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH 2 COOH básicas e neutras DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração básico - CH 2 CH 2 N+(C 2 H 5 ) 2 e troca iônica de proteínas ácidas e neutras CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração ácido - CH 2 COOH e troca iônica de proteínas básicas e neutras
- Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio- Gel: Bio Rad Laboratories
Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
por competição com o ligante livre
Desprezar proteínas não retidas
Lavagem
Eluição pH 2,0 ou sal
Antígeno A puro
Anti-A interage apenas com a proteína A
-
Mistura de proteínas
Coluna empacotada com esse gel
Partículas de gel recobertas de anticorpos anti-A
Adsorção
Complexo Ag-AC é desfeito
Um dos métodos mais eficientes para a purificação de proteínas, possibilitando um alto rendimento com número reduzido de etapas.
A separação de moléculas tem como base a interação específica do analito (molécula-alvo) com um ligante imobilizado na matriz. Forças envolvidas nessa interação podem ser não covalentes (eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de H)
ou covalentes (p.e., ponte dissulfeto).