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SIMONE RODRIGUES RIBEIRO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR E DA SENSIBILIDADE A
ANTIMICROBIANOS DE MICOBACTÉRIAS DE CRESCIMENTO
RÁPIDO (MCR) ISOLADAS DE PACIENTES SUBMETIDOS A
PROCEDIMENTOS INVASIVOS DO ESTADO DE MINAS GERAIS
Dissertação, como requisito parcial, para obter o grau de mestre em Ciências Farmacêuticas, submetida ao Programa de Pós-graduação em Ciências Farmacêuticas da Faculdade de Farmácia da Universidade Federal de Minas Gerais.
Orientadora: Profa^ Dra^ Ana Paula Salles Moura Fernandes
- UFMG Coorientadora: Profa^ Dra^ Silvana Spíndola de Miranda - UFMG
Belo Horizonte - MG 2013
Ribeiro, Simone Rodrigues.
R484c
Caracterização molecular e da sensibilidade a antimicrobianos de micobactérias de crescimento rápido (MCR) isoladas de pacientes submetidos a procedimentos invasivos do Estado de Minas Gerais / Simone Rodrigues Ribeiro. – 2013. 117 f. : il. Orientadora: Dra. Ana Paula Salles Moura. Co-orientadora: Dra. Silvana Spíndola de Miranda. Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Minas Gerais, Faculdade de Farmácia, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas.
- Micobactérias - Teses. 2. Infecção – Teses. I. Moura, Ana Paula Salles. II. Miranda, Silvana Spíndola. III. Universidade Federal de Minas Gerais. Faculdade de Farmácia. IV.Título.
CDD: 616.
AGRADECIMENTOS
Primeiro a Deus, pelos ensinamentos, pela força e por colocar pessoas especiais ao meu lado. Agradeço por esta etapa cumprida.
A Profa. Dra. Ana Paula Salles Moura Fernandes, com grande respeito e admiração, pela dedicação, disponibilidade, sabedoria e pela confiança em mim depositada.
A Profa. Dra. Silvana Spíndola de Miranda, pelo incentivo a pesquisa, ensinamentos e apoio.
Ao Programa de Pós Graduação em Ciências Farmacêuticas da UFMG pela minha formação.
Ao Departamento de Análises Clínicas da Faculdade de Farmácia da UFMG pelo apoio ao projeto e pelos excelentes professores.
A Fundação Ezequiel Dias, pela liberação dos dados e amostras, pela oportunidade de realização do mestrado, por acreditar e investir na capacitação de seus profissionais. A todos os servidores que de alguma forma apoiaram a realização do mesmo.
A todos os colegas e estagiários do Serviço de Doenças Bacterianas e Fúngicas, em especial do laboratório de micobactérias, pelo apoio técnico.
Aos colegas do Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de Farmácia da UFMG, em especial Leopoldo e Elaine pelo auxílio na realização do sequenciamento.
Aos colegas do Laboratório de Microbiologia da Faculdade de Medicina da UFMG, em especial Lúcia e Letícia, pelo auxílio na realização do MIC.
A Profa. Dra. Wânia da Silva Carvalho, por fazer parte do inicio da minha trajetória na pesquisa e pelo incentivo.
A Profa. Dra. Regina Maria Nardi Drummond e a Dra. Mireille Ângela Bernardes Souza pelas contribuições.
A João Paulo pelo incentivo, por acreditar em meus objetivos, por estar sempre ao meu lado dedicando amor, carinho e atenção e apoio.
A minha família pelos momentos juntos e pelo amor.
A Lídia e Simone, pela amizade, pelas palavras, pelo incentivo, pelo apoio nas horas difíceis e também pelos bons momentos vivenciados.
Aos Professores, colegas e funcionários da Pós Graduação que de alguma forma contribuíram para realização deste trabalho.
ABSTRACT
Rapidly growing mycobacteria (RGM) are opportunistic pathogens involved mainly in infections associated with invasive procedures. Here, we have characterized RGM isolated from patients undergoing invasive procedures, from the state of Minas Gerais. Microbiological and epidemiological information were reviewed retrospectively from laboratory records. For molecular typing, PCR followed by analysis restriction fragment length of the gene hsp65 (PRA- hsp65 ) and Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus PCR (ERIC-PCR) were applied. Isolates of M. abscessus and M. chelonae were evaluated for sensitivity in vitro as recommended by the Clinical and Laboratory Standards Institute through a colorimetric assay using rezasurina. A total of 31 RGM isolated from specimens of 20 patients were recovered from the strain collection of Ezequiel Dias Foundation, between January 2007 and July 2011. The hsp65 PRA technique allowed the identification of 87.1% RGM isolates, corresponding to M. fortuitum , M. abscessus subsp. abscessus , M. abscessus subsp. bolettii , M. chelonae and M. peregrinum. Invasive surgical represented the majority of cases (60%). Among the surgery, mammaplasty was most common (50% of cases). Cases were concentrated in them Belo Horizonte (30%), Uberaba (10%), Contagem (5%), Lavras (5%), Nova Lima (5%) and Uberlândia (5%). Except for three clinical isolates of M. chelonae , different clinical isolates of RGM studied showed no epidemiological link. Four isolates showed PRA- hsp65 pattern not reported in the literature. The ERIC-PCR was useful for discriminating clinical isolates of RGM, showing a higher degree of genetic heterogeneity as compared to PRA- hsp65, but 100% genetic similarity of two clinical isolates of M. chelonae involved in an outbreak. The two isolates of M. chelonae were susceptible to amikacin, ciprofloxacin, clarithromycin, doxycycline, and sulfamethoxazole but resistant to tobramycin. All isolates of M. abscessus subsp. abscessus were sensitive to amikacin, profile showed intermediate to cefoxitin and were resistant to sulfamethoxazole. All isolates of M. abscessus subsp. bolletii were sensitive to amikacin and clarithromycin, profile showed intermediate to cefoxitin and were resistant to ciprofloxacin, doxycycline and sulfamethoxazole. Keywords: Rapidly growing mycobacteria; infection.
LISTA DE FIGURAS
1 Diagrama dos componentes da parede celular micobacteriana. AG: arabinogalactano. MAPc: complexo formado por ácidos micólicos, arabinogalactano e peptidoglicano. Fonte: HETT & RUBIN, 2008, p. 128. ............................................................................................................ 21
2 Infecções causadas por micobactérias de crescimento rápido. (A) Infecção disseminada de tecido mole após o uso de esteróides sistêmicos. (B) Abscesso após injeção com solução de córtex adrenal contaminada. (C) Infecção associada à redução de mama. (D) Infecção associada à pedicure. (E) Infecção associada à cirurgia cosmética facial. Fonte: GROOTE & HUITT, 2006, p. 1759. ......................................................................................................................... 26
3 Mycobacterium fortuitum (bactéria álcool-ácido resistente) após coloração de Zielh-Neelsen de secção de tecido. Aumento de 1000 vezes (Adaptado de KOTHAVADE et al. , 2012). .................................................................................................................................................... 35
4 Crescimento de micobactérias em meio Löwenstein-Jensen. Da esquerda para a direita: Mycobacterium gordonae, Mycobacterium fortuitum, Mycobacterium avium e Mycobacterium tuberculosis****. Fonte: PALOMINO et al. , 2007, p.104. ....................................................................... 37
5 Montagem da microplaca com as concentrações (μg/mL) em cada orifício para cada antimicrobiano. CCC = Controle de Crescimento da Cepa, CEM = Controle de Esterilidade do Meio, AMK = amicacina, CIP = ciprofloxacino, CLA = claritromicina, DOX = doxiciclina, CEF = cefoxitina, SUL = sulfametoxazol e TOB = tobramicina. ................................................................ 63
6 Bactéria álcool-ácido resistente em esfregaço de cultura de MCR corado pelo método de Zielh-Neelsen. Aumento de 1000 vezes. ........................................................................................... 69
7 Eletroforese em gel de agarose 3% de perfis de PRA- hsp65 de 15 isolados clínicos e de cepas de referência com a enzima de restrição Bst EII****. M: Marcador de 50pb. F1, F2, F3, F4, F5, F6, F7, F8, A1, A2, A3, A4, A5, A6 e A7: isolados clínicos incluídos no estudo. MT: M. tuberculosis ATCC®^ 27294. MA: M. avium subsp. avium ATCC®25291. ....................................... 71
8 Eletroforese em gel de agarose 3% de perfis de PRA- hsp65 de 8 isolados clínicos e de cepa de referência com a enzima de restrição Hae III****. M: Marcador Low Range, Fermentas®. F1, F2,
um mesmo isolado clínico, foram indistinguíveis quando a reação foi realizada com DNA extraído por método de choque térmico ou método CTAB. (1) marcador de peso molecular ΦX174 DNA/ Bsu RI. (2) DNA de isolado de M. fortuitum extraído por método de choque térmico. (3) DNA de isolado de M. fortuitum extraído por método CTAB. (4) DNA de isolado de M. abscessus extraído por método de choque térmico. (5) DNA de isolado de M. abscessus extraído por método CTAB. ............................................................................................................ 113
15 Eletroforese em gel de poliacrilamida 8% de ERIC-PCR para comparação de perfis de ERIC- PCR obtidos para casos de pacientes com mais de um isolado clínico de MCR. (1 e 2) Isolados de M. fortuitum****. (3 e 4) Isolados de M. fortuitum****. (5 e 6) Isolados de M. fortuitum****. (7, 8 e 9) Isolados de M. abscessus****. .............................................................................................................. 114
16 Amplificação de fragmento de 764 pb do gene rpo B. M: Marcador de 100pb; B: controle negativo da reação; A5, A6, A7 e C4: isolados incluídos no estudo. ......................................... 117
17 Amplificação de fragmento de 764 pb do gene rpo B a partir dos plasmídeos recombinantes. M: Marcador de 100pb; P: controle negativo do plasmídeo sem o inserto de 764pb; B: controle negativo da reação de PCR; A5, A6, A7 e C4: isolados incluídos no estudo. ........................... 117
LISTA DE TABELAS
1 Infecções de pele e tecidos moles causadas por micobactérias de crescimento rápido. ...... 2 7
2 Testes úteis para a identificação das micobactérias de crescimento rápido mais frequentemente isoladas de material clínico. ................................................................................. 38
3 Antimicrobianos usados para o tratamento de espécies de MCR mais comumente encontradas. ...................................................................................................................................... 45
4 Concentração das soluções de uso de antimicrobianos. .......................................................... 62
5 Critérios de interpretação para microdiluição em meio líquido para MCR. ............................. 65
6 Dados epidemiológicos de pacientes com isolamento de MCR após procedimentos invasivos em Minas Gerais. ............................................................................................................................... 67
7 Distribuição dos casos de isolados de MCR provenientes de pacientes submetidos a procedimentos invasivos em Minas Gerais, quanto ao procedimento. ..................................................................................................................................... 68
8 Distribuição dos casos de isolados de MCR provenientes de pacientes submetidos a procedimentos invasivos em Minas Gerais, quanto ao tipo de procedimento. ..................................................................................................................................... 68
9 Distribuição dos casos de isolados de MCR provenientes de pacientes submetidos a procedimentos invasivos em Minas Gerais, quanto ao município de ocorrência. .......................................................................................................................................... 69
10 Perfis de PRA- hsp65 dos isolados clínicos de MCR de pacientes submetidos a procedimentos invasivos em Minas Gerais. ................................................................................... 70
11 Distribuição dos casos de isolados de MCR provenientes de pacientes submetidos a procedimentos invasivos em Minas Gerais, segundo a espécie de MCR. ..................................................................................................................................................... 73
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
μg micrograma μL microlitro μm micrometro μM micromolar AG Arabinogalactano AMK Amicacina ANVISA Agência Nacional de Vigilância Sanitária ATCC American Type Culture Collection BAAR Bacilo Álcool-Ácido Resistente BLAST Basic Local Alignment and Search Tool Bst EII Endonuclease de restrição isolada de Bacillus stearothermophilus CCC Controle de crescimento da cepa CEF Cefoxitina CEM Controle de esterilidade do meio CIP Ciprofloxacino CLA Claritromicina CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute CTAB Brometo de hexadeciltrimetilamônio DNA Ácido desoxirribonucleico dNTP deoxinucleotídeos trifosfato DOX Doxiciclina EDTA Ácido etilenodiaminotetracético ERIC Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus ERIC-PCR PCR de Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus erm gene metilase induzível Hae III Endonuclease de restrição isolada de Haemophilus aegypticus hsp65 Gene que codifica proteína de choque térmico de 65kDa I Intermediário INCQS Instituto Nacional de Controle de Qualidade em Saúde IPTG Isopropyl β-D- 1 - thiogalactopyranoside
KCl Cloreto de potássio kDa Kilodaltons LACEN-MG Laboratório Central Saúde Pública de Minas Gerais LASIK Laser-Assisted in Situ Keratomileusis MA ácidos micólicos MAPc Complexo formado por ácidos micólicos, arabinogalactano e peptidoglicano MCR micobactéria de crescimento rápido mg miligrama MgCl 2 Cloreto de magnésio MIC concentração inibitória mínima, do inglês, minimum inhibitory concentration mL mililitro mM milimolar MNT micobactéria não tuberculosa MOTT mycobacteria other than tubercle bacilli MS Ministério da Saúde NCCLS National Committee for Clinical Laboratory Standards ng nanograma pb pares de bases PCR Reação em cadeia da polimerase PFGE Eletroforese em gel em campo pulsado, do inglês, P ulsed-Field Gel Electrophoresis PG peptidoglicano pH potencial hidrogeniônico pmoles picomoles PNB ácido p-nitrobenzóico PRA análise dos fragmentos de restrição PRA- hsp65 reação em cadeia da polimerase seguida de clivagem com endonucleases e análise dos fragmentos de restrição do gene hsp R Resistente RAPD Randomly amplification of polymorphic DNA RAPD-PCR PCR Randomly amplification of polymorphic DNA rpm rotações por minuto
LISTA DE SÍMBOLOS
% Porcentagem ºC Grau Celsius ≥ Maior ou igual ≤ Menor ou igual ± Mais ou menos
SUMÁRIO
- 12 MIC de M. chelonae isoladas de pacientes de Minas Gerais.
- 13 Interpretação de MIC de M. chelonae isoladas de pacientes de Minas Gerais.
- 14 MIC de M. abscessus isoladas de pacientes de Minas Gerais
- 15 Interpretação de MIC de M. abscessus isoladas de pacientes de Minas Gerais.
- 1 INTRODUÇÃO
- 1.1 Micobactérias
- 1.2 Micobactérias não tuberculosas
- 1.3 Micobactérias de crescimento rápido
- 1.4 Micobactérias de crescimento rápido de interesse clínico
- 1.4.1 Grupo Mycobacterium fortuitum
- 1.4.2 Grupo Mycobacterium chelonae-abscessus
- 1.4.3 Grupo Mycobacterium mucogenicum
- 1.4.4 Grupo Mycobacterium smegmatis
- 1.5 Diagnóstico de infecção por MCR
- 1.5.1 Diagnóstico microbiológico de infecções por MCR
- 1.6 Identificação de micobactérias
- 1.7 Métodos moleculares
- 1.8 Testes de sensibilidade aos antimicrobianos
- 1.9 Epidemiologia de infecções por MCR no Brasil
- 1.9.1 Casos notificados
- 1.10 Prevenção
- 2 JUSTIFICATIVA
- 3 OBJETIVOS
- 3.1 Objetivo geral
- 3.2 Objetivos específicos
- 4 MATERIAL E MÉTODOS
- 4.1 Aspectos éticos.
- 4.2 Seleção de isolados.
- 4.3 Critérios de inclusão
- 4.4 Critérios de exclusão
- 4.5 Dados epidemiológicos
- 4.6 Obtenção dos isolados
- 4.7 Triagem fenotípica
- 4.8 Identificação e tipagem molecular
- 4.8.1 Extração de DNA
- 4.8.2 PRA- hsp65
- 4.8.3 ERIC-PCR
- 4.9 Teste de sensibilidade aos agentes antimicrobianos
- 4.9.1 Agentes antimicrobianos
- 4.9.2 Preparo da solução de uso de antimicrobianos
- 4.9.3 Preparo das diluições em microplaca
- 4.9.4 Preparo da suspensão bacteriana (inóculo)
- 4.9.5 Inoculação e incubação das microplacas
- 4.9.6 Leitura do teste
- 4.9.7 Interpretação dos resultados
- 5 RESULTADOS
- 5.1 Identificação bacteriana
- 5.2 ERIC-PCR
- 5.3 Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos
- 6 DISCUSSÃO
- 7 CONCLUSÕES
- 8 PERSPECTIVAS
- 9 CONSIDERAÇÕES FINAIS
- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
- ANEXO A - Aprovação no Comitê de Ética em Pesquisa
- (MCR) após procedimentos médicos invasivos ANEXO B - Ficha de notificação de caso de micobacteriose não tuberculosa
- APÊNDICE A – Protocolo para extração de DNA utilizando CTAB
- APÊNDICE B – Padronização do método de extração para ERIC-PCR
- colhidos em momentos distintos, pela técnica de ERIC-PCR APÊNDICE C – Comparação de isolados clínicos de um mesmo paciente,
- APÊNDICE D – Protocolos para sequenciamento parcial do gene rpo B
- APÊNDICE E – Primeiros resultados do sequenciamento do gene rpoB
