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Um estudo sobre a determinação do sexo em aves, utilizando três diferentes técnicas de extração de dna de penas e sangue. O estudo avaliou a eficácia e o tempo de conservação do dna obtido por cada método. As aves apresentam cromossomos sexuais heteromórficos, sendo que as fêmeas possuem dois cromossomos w e os machos um cromossomo w e um cromossomo z. A determinação do sexo em aves é importante para o sucesso reprodutivo de espécies mantidas em cativeiro, estudos comportamentais e populacionais, e para a comercialização de aves de produção.
O que você vai aprender
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
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Dissertação apresentada à Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial à obtenção do grau de Mestre em Zootecnia. Área: Genética e Melhoramento Animal Orientadora: Denise Aparecida Andrade de Oliveira. Co-orientador: Eduardo Geraldo Alves Coelho
Dedico à minha mãe e em especial ao meu pai por sempre ser meu companheiro e pelos eternos ensinamentos. Afinal, “entre nós dois não cabe mais nenhum segredo além do que já combinamos” (Ana Carolina/Dudu Falcão/Gean Luca Grignani/Massima Luca).
À professora Denise Aparecida Andrade de Oliveira por me aceitar como sua aluna e por acreditar em mim.
Ao Eduardo e Cláudia pelos ensinamentos e por terem sido meus consultores de dúvidas.
Aos colegas de morcegagem do Laboratório de Genética: Ângelo, Arno, Bruna, Cláudia, Daniel, Daniela, Danilo, Henrique, Lílian e Ronaldo pelo companheirismo, ajudas e boas risadas.
Ao Adson, pois se não fosse sua boa vontade e suas “incríveis” máquinas fotográficas estaria até hoje tentando melhorar os géis.
Aos criatórios de aves e ao IBAMA que colaboraram com as amostras para a realização deste trabalho.
À minha mãe por ter vibrado comigo desde o momento da minha classificação no mestrado, quando ganhei a bolsa e quando consegui padronizar a PCR (mesmo sem entender nadinha de nada).
Às minhas irmãs por me aturarem e por fingirem que entendiam meus géis e minhas longas e exaustivas “mesmas” explicações.
Aos meus cachorros sobrinhos, Guma e João, e à minha filhota, Gilda.
À minha dindinha, Mônica, por tanto me aconselhar.
Às minhas amigas, Dani, Érika e Kika pelas discussões de biologia molecular.
À minha querida amiga, Rê, por estar tão presente em minha vida, mesmo estando tão distante, mas ao mesmo tempo tão perto de mim. E também, é claro, pelas traduções para o inglês. Thank you !!!
Ao Roberto Santiago, Samambaia, Pena Branca, Gira Mundo, Treme-terra, Carioca, DaMata e Caveira pelos conselhos e companheirismo espiritual.
A CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - pela bolsa de estudo oferecida.
Evolução dos Cromossomos Sexuais ....................................................................... Cromossomos Sexuais Z e W ................................................................................... Dimorfismo sexual ................................................................................................... Importância da Sexagem .......................................................................................... Biologia Molecular................................................................................................... Reação em Cadeia da Polimerase - PCR .................................................................. Tipos de Criatórios .......................................................................................... Criatório Comercial.......................................................................................... Criatório Conservacionista .............................................................................. Criatório Expositivo .................................................................................................
Coleta e Composição das Amostras ......................................................................... Extração e Armazenamento do DNA ....................................................................... Primers ..................................................................................................................... Amplificação pela PCR, eletroforese e análise do gel ............................................. Análise Estatística ....................................................................................................
Extrações de DNA ................................................................................................... Caracterização ................................................................................................ Estudo de Associação ......................................................................................
Tabela 01 Comparação das técnicas de determinação do sexo das aves. FONTE: Grando (2002) - modificada
Tabela 02 Tempo de extração, número de reagentes e tempo de conservação do DNA das três técnicas de extração de DNA, em ensaio realizado na EV/UFMG, em 2007 e 2008.
Tabela 03 Método de sexagem utilizando par de primers alelo-específico P 2 /P 8 em 15 diferentes espécies de aves e amostras (sangue e/ou pena), em ensaio realizado na EV/UFMG, em 2007 e 2008.
Tabela 04 Diferentes tamanhos de pb dos cromossomos sexuais (Z e W) das espécies, em ensaio realizado na EV/UFMG, em 2007 e 2008.
Tabela 05 Tabela de contingência de Segregação Genética para os sexos 1:1, em ensaio realizado na EV/UFMG, em 2007 e 2008.
Figura 01 Filogenia dos vertebrados que ilustra os métodos da determinação de sexo. “Fêmea” e “macho” têm a GSD com fêmeas e machos heterogaméticos respectivamente. O TSD representa a determinação de sexo temperatura-dependente. FONTE: Modi & Crews (2005).
Figura 02 Gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata, em ensaio realizado na EV/UFMG em 2008. PM: padrão de Peso Molecular pGEM®. Canaletas: 2/F e 3/M - Estrelinha, 4/F e 5/M - Pintassilgo, 6/F e 7/M - Catatau. No detalhe, melhor visualização dos dois alelos da fêmea de Catatau.
Figura 03 Gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata, em ensaio realizado na EV/UFMG em 2008. PM: padrão de Peso Molecular pGEM®. Canaletas: 2/F e 3/M - Tucano, 4/F e 5/M - Papagaio, 6/F e 7/M - Maritaca. No detalhe, melhor visualização dos dois alelos da fêmea de Papagaio.
Figura 04 Gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata, em ensaio realizado na EV/UFMG em 2008. PM: padrão de Peso Molecular pGEM®. Canaletas: 2/F e 3/M - Canário-belga, 4/F e 5/M - Pássaro-preto, 6/F e 7/M - Sabiá. No detalhe, melhor visualização dos dois alelos das fêmeas de Pássaro-preto e Sabiá.
Figura 05 Gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata, em ensaio realizado na EV/UFMG em 2008. PM: padrão de Peso Molecular pGEM®. Canaletas: 2/F e 3/M - Azulão, 4/F e 5/M - Bicudo, 6/F e 7/M - Trinca-ferro-verdadeiro. No detalhe, melhor visualização dos dois alelos da fêmea de Bicudo.
Figura 06 Gel de poliacrilamida 10%, corado com nitrato de prata, em ensaio realizado na EV/UFMG em 2008. PM: padrão de Peso Molecular pGEM®. Canaletas: 2/F e 3/M - Canário-da-terra, 4/F e 5/M - Galo-da-campina, 6/F e 7/M - Tico-tico.
O Brasil reúne uma das maiores riquezas em avifauna do mundo com mais de 1796 espécies, das quais mais de 10% são endêmicas, o que torna o país um dos mais importantes em relação a investimentos em conservação.
A fauna silvestre vem sendo constantemente ameaçada de extinção, sendo as aves um dos grupos mais atingidos. Várias são as causas desta perda de espécies, mas certamente um dos fatores mais importantes é a destruição dos habitats, que leva ao isolamento de populações cada vez menores, aumentando as chances de desaparecimento. Por outro lado, o país também sofre forte pressão do tráfico de animais silvestres. Por estes motivos, nos últimos anos, vem crescendo consideravelmente a criação de animais silvestres no Brasil, com a finalidade de se evitar o desaparecimento destas espécies ameaçadas.
Para o sucesso reprodutivo e produtivo é fundamental que seja determinado o sexo das aves. Portanto, a sexagem em aves monomórficas é necessária para o sucesso reprodutivo de espécies silvestres mantidas em cativeiro, tanto no sentido conservacionista quanto no criacionista e é uma ferramenta valiosa para os estudos
comportamentais e populacionais em espécies sem dimorfismo sexual aparente.
Estima-se que pelo menos metade das aves existentes no mundo não possuam dimorfismo sexual que, quando existe, é geralmente sutil, e pode ocorrer somente no período de maturidade sexual. O dimorfismo sexual é um caso especial no qual machos e fêmeas de uma mesma espécie diferem em caracteres sexuais secundários, como tamanho ou coloração.
Este trabalho teve como objetivo avaliar o método de análise molecular para a identificação do sexo das aves, com três diferentes técnicas de extração de DNA, utilizando como amostras penas e sangue, empregando-se primers específicos para o gene CHD ( chromo-helicase-DNA-binding, helicase dependente de cromo) , localizado nos cromossomos sexuais ( Z e W ) das aves, pela técnica da reação em cadeia da polimerase, PCR. Outro aspecto importante foi o tempo de conservação do DNA após extraído.
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 2.1. Evolução dos Cromossomos Sexuais Os vertebrados têm os indivíduos separados sexualmente, sendo o sexo determinado por diferentes maneiras (Ezaz et al. , 2006).
As espécies com cromossomos sexuais heteromórficos têm níveis iguais da expressão do gene entre os sexos quando um sexo tem somente uma cópia, ZW ou XY, e o outro sexo tem duas cópias de um cromossomo em particular, ZZ ou XX (Modi & Crews, 2005). Os cromossomos sexuais W e Y são alelos dominantes ao sexo masculino em relação aos Z e X, respectivamente (Schartl, 2004).
Aves e mamíferos apresentam cromossomos sexuais na base de sua filogenia, onde as espécies apresentam cromossomos sexuais bem diferenciados (Artoni et al. , 2000). A hipótese da evolução do cromossomo sexual de vertebrado é que o sistema XY de mamífero pode ter sido originado diretamente do sistema ZW do ancestral réptil, melhor que um estado intermediário ou transitório da determinação de sexo pelo ambiente. Portanto, um importante e relevante estudo de cromossomos sexuais de vertebrados é o sistema XY de mamíferos e os sistemas ZW de aves e serpentes (Modi & Crews, 2005; Ezaz et al. , 2006). Estes sistemas mostram a similaridade superficial dos cromossomos X e Z, afinal, eles são grandes e carregam muitos genes entretanto, parecem não influenciar na determinação de sexo, visto que os cromossomos Y e W são menores, altamente heterocromáticos e têm poucos genes ativos (Ezaz et al. , 2006;
Charlesworth & Charlesworth, 2005; Duan & Fuerst, 2001; Ellegren, 2000).
2.2. Cromossomos Sexuais Z e W A maioria dos animais e muitas plantas apresentam dimorfismo sexual. Na maioria destes casos, o sexo é determinado por cromossomos sexuais. Nestes organismos, existem duas categorias de cromossomos, os sexuais e os autossomos.
A maioria dos cromossomos em um genoma é de autossomos. Os cromossomos sexuais estão em menor número, apenas um par (Suzuki et al. , 2002). Os pares de cromossomos autossômicos constam de cópias materna e paterna, sendo morfologicamente semelhantes.. Porém, os cromossomos sexuais são bem distintos entre si (Ohno, 1967 citado por Griffiths, 2000).
Em aves o sexo é determinado por cromossomos sexuais Z e W (Suzuki et al. , 2002). Os genes, CHD-Z e CHD-W ( chromo-helicase-DNA-binding, helicase dependente de cromo), estão localizados nos cromossomos sexuais de todas as aves. O gene CHD-W localiza-se no cromossomo W, somente nas fêmeas e o gene CHD-Z é encontrado no cromossomo Z, ocorrendo em ambos os sexos (Griffiths et al. , 1998). Ambos os cromossomos apresentam seus
tamanhos variados na maioria das espécies (Ezaz et al., 2006; Fridolfsson & Ellegren, 2000). Somente em ratitas (avestruz, ema, emu) os cromossomos sexuais Z e W são morfologicamente similares aos autossomais, mostrando pequena diferença no tamanho ou na cópia paterna. A sexagem molecular nestas aves é feita utilizando outro par de primers (Ansari et al., 1988 & Tagaki et al., 1972 citados por Griffiths et al., 1998).
2.3. Dimorfismo sexual As diferenças existentes entre machos e fêmeas se classificam como características primárias e secundárias. As secundárias referem-se a diferenças provocadas pela ação dos hormônios sexuais e, portanto, estão sujeitas a uma considerável variação, dependendo da natureza do meio endócrino que interfere nos caracteres citados. Já as primárias se consideram habitualmente integradas pelas diferenças anatômicas sobre todos os órgãos reprodutivos. Porém, em ambos os sexos das aves a genitália externa consiste da cloaca que é a porção final do intestino e do trato geniturinário, não sendo possível a determinação do sexo (Griffiths, 2000; Pough, 1999). As aves podem vir a ter dimorfismo sexual somente quando atingem a maturidade sexual (Pough, 1999; Ellegren & Sheldon, 1997; Hutt, 1958). O dimorfismo sexual representa diferenças
morfológicas, as quais são utilizadas durante a corte no período reprodutivo entre machos e fêmeas (Pough, 1999).
2.4. Importância da Sexagem A regulamentação de criadouros pelo IBAMA trouxe nova visão do conceito de reprodução e manutenção de aves silvestres (Allgayer & Cziulik, 2007), sendo de extrema importância a sexagem de aves. A determinação do sexo em aves monomórficas é fundamental para o sucesso reprodutivo de espécies silvestres mantidas em cativeiro (Raso & Werther, 2004), é uma ferramenta valiosa para os estudos comportamentais e populacionais em espécies sem dimorfismo sexual aparente, assim como em criatórios de comercialização de produção (Faria et al., 2007).
Existem vários métodos de sexagem, cada qual com suas vantagens e limitações; em alguns casos, a identificação sexual não é efetiva utilizando-se determinada técnica, tendo-se que repetir várias vezes a análise ou recorrer a outro tipo de exame até o êxito total (Grando, 2002). Os métodos cirúrgicos, laparoscopia e a TRMN (tomografia por ressonância magnética nuclear), podem causar sérios problemas como no caso da administração do anestésico: relação da dose e peso das aves, uma vez que podem pesar
condições de amplificação é imprescindível para se obter resultados satisfatórios da técnica, uma vez que há variação entre diferentes ambientes (de laboratório para laboratório), da temperatura ambiente, do tipo de armazenamento e variações de perfis térmicos que se diferem entre os aparelhos termocicladores (Ferreira & Grattrapaglia, 1998). Os resultados obtidos são iguais, porém é necessário padronizar a técnica de acordo com cada laboratório.
Ensaios de sexagem molecular em aves são geralmente baseados no gene CHD, localizado no cromossomo W, único para fêmeas. Seu homólogo, CHD-Z, é encontrado no cromossomo Z e ocorre em ambos os sexos (ZW em fêmeas e ZZ em machos). A identificação do gênero baseada na PCR emprega um único set de primers P 2 /P 8 (CHD-universal) que amplifica fragmentos homólogos de ambos os genes e incorpora introns que geralmente variam de tamanho entre as espécies (Ramos et al. , 2009; Chang ET AL. , 2008; Anciães & Nassif Del Lama, 2002; Griffiths, 2000; Fridolfsson & Ellegren, 2000; Griffiths et al., 1998; 1996). O método para identificar o sexo em aves baseado neste para de primers foi descrito por Griffiths et al. (1996; 1998).
2.6. Tipos de Criatórios A crescente degradação do meio ambiente vem causando redução e fragmentação de inúmeros ecossistemas. Como consequência direta destes fatos, muitas espécies animais e vegetais caminham para a extinção (Almeida, 2003).
O Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis (IBAMA, 2007), através das portarias 117 e 118 de 15 de outubro de 1997, que normatizam a criação de espécies nativas e comercialização de animais vivos, abatidos, partes e produtos da fauna nativa, propiciou que, nos últimos anos, houvesse um incremento na criação legal desses animais. Estas portarias visam colaborar com a conservação da fauna brasileira e combater o comércio clandestino de animais silvestres, pois acredita-se que o comércio ilegal deverá reduzir-se progressivamente à medida que exista a possibilidade de aquisição de animais de maneira lícita e confiável, com documentação correta, saúde, origem controlada e adaptado ao cativeiro (Allgayer & Cziulik, 2007). Esta medida foi um grande passo rumo à regulamentação do mercado ilegal de animais silvestres. Marcando uma mudança radical na política do IBAMA que agora apóia e estimula a criação comercial de animais silvestres, sendo considerada, por muitos, a medida
mais eficiente para a redução do tráfico ilegal de animais. Há também a Resolução Conama nº 394, 06 de novembro de 2007, onde o IBAMA disponibiliza para consulta pública a lista das espécies da fauna silvestre nativa que serão permitidas para a criação e comercialização (IBAMA, 2007). Uma vez que, observou-se que estimular a produção legal em cativeiro visando suprir a demanda no mercado, reduz o impacto nas populações silvestres na natureza, muitas vezes ameaçadas de extinção (http://www.animalworld.com.br/aves/ver.p hp?id=198).
Ao pensar em criação assistida de aves, a primeira pergunta para a qual se deve encontrar uma resposta é: qual o objetivo do manejo em cativeiro? Criacionista (criação da avifauna), exposição (visitação pública – parques e zoológicos), educação ambiental, conservacionista ou pesquisa? (Allgayer & Cziulik, 2007). Todos os tipos de criatórios devem ser credenciados ao IBAMA (IBAMA, 2007).
2.6.1. Criatório Comercial O espaço físico para a criação deve ter ventilação, tamanho de gaiolas e luminosidade adequados a cada espécie. O conhecimento nutricional também é essencial, pois é um fator que determina o sucesso do manejo em cativeiro,
possibilitando a sanidade e a reprodução das aves (Allgayer & Cziulik, 2007).
A formação de casais compatíveis não é uma tarefa fácil, podendo-se tentar com o isolamento de casais em gaiolas e com a observação do comportamento dos possíveis casais. As aves só se reproduzirão se o manejo atender às suas necessidades etológicas básicas (Allgayer & Cziulik, 2007).
Em criatórios que possuem poucos casais denominados matrizes há necessidade de se tomar o cuidado com a formação de futuros pares, pois a endogamia pode provocar a diminuição da heterozigose e consequentemente, aumento da homozigose que pode ocorrer tanto para genes dominantes quanto para os recessivos, sendo necessário que haja a seleção se estes são preferidos em relação aos heterozigotos. Ao reduzir a heterozigose favorece-se a ocorrência de genes recessivos indesejáveis ou de efeitos deletérios. A perda da variabilidade genética em populações pequenas tende a ocorrer aleatoriamente, causando mudanças nas freqüências alélicas e genotípicas, fixando alguns alelos e eliminando outros, processo este denominado deriva genética. A maioria desses genes está relacionada com a baixa fertilidade e os níveis de reprodução,
recinto, para a não ocorrência de formação de casais ao acaso que não apresentam dimorfismo sexual ou baseados nas características comportamentais, podendo causar, no caso de fêmeas, postura de ovos inférteis e, consequentemente, o não crescimento da população (Grando, 2002).
3. MATERIAL E MÉTODOS 3.1. Coleta e Composição das Amostras Para o presente estudo, foram colhidas amostras, de maneira aleatória, de sangue e de penas de criatórios comerciais - Criatório JC e Criatório Lua de Mel, do criatório conservacionista - ZooAmbiental e do CETAS (Centro de Triagem de Animais Silvestres) do IBAMA todos localizados no estado de Minas Gerais.
Foram coletadas 10 amostras de cada espécie estudada ( Calliphlox amethystina – Estrelinha; Passerina brissonii – Azulão; Saltator similis – Trinca-ferro-verdadeiro; Oryzoborus maximiliani – Bicudo; Sicalis flaveola – Canário-da-terra; Zonotrichia capensis – Tico-tico; Carduelis magellanicus – Pintassilgo; Leninus canária – Canário-belga; Gnorimopsar chopi – Pássaro-preto; Campylorhynchus turdinus – Catatau; Tusrdus sp. – Sabiá; Ramphastos toco – Tucano; Amazona aestiva – Papagaio-verdadeiro e Aratinga sp.
- Periquito-Maritaca). Com exceção de uma
espécie ( Poroaria dominicana – Galo da campina) da qual amostras foram colhidas de apenas quatro indivíduos.
As amostras foram obtidas por meio do corte da unha obtendo-se o sangue que foi coletado em papel filtro (Marca Whatman, 55mm) e armazenado individualmente em envelope a temperatura ambiente. Também foram coletadas penas que ainda continham ou não sangue no bulbo, novas ou velhas que foram armazenadas em envelope ou em um tubo contendo álcool absoluto ou 70% sendo conservado em refrigerador a 4 ºC.
Todas as amostras foram armazenadas individualmente e devidamente identificadas.
As coletas foram realizadas em aves de todas as idades (entre um mês de vida à idade senil), por todo o ano, no período da manhã até, no máximo, às 15 horas. Desta forma não houve mudança nas condições de temperatura do ambiente dos criatórios, não influenciando no bem estar dos animais.
3.2. Extração e armazenamento do DNA Foram feitas extrações de DNA utilizando- se três diferentes técnicas, uma através do sangue pelo método fenol/clorofórmio com digestão pela enzima proteinase K (Sambrook et al. , 1989), outra utilizando o
bulbo de pena pelo método de extração alcalina simples rápida (Rudbek & Dissing,
Cada amostra extraída pelos dois primeiros métodos foi armazenada em microtubo e aliquotada em geladeira, 4 ºC, enquanto que pelo terceiro, as amostras foram armazenadas em microtubos em temperatura ambiente.
Todos os testes foram realizados no Laboratório de Genética do Departamento de Zootecnia da Escola de Veterinária da UFMG.
3.3. Primers Foi utilizado um par de primers alelo- específicos, P 2 e P8, por amplificarem especificamente os alelos relacionados com os cromossomos sexuais e por serem universais. O primer P 2 amplifica o gene CHD-W enquanto o P 8 o CHD-Z (Griffiths et al., 1996; 1998).
3.4. Amplificação pela PCR, eletroforese e análise do gel Houve a necessidade de adaptar a amplificação descrita por Griffiths et al. (1998) às condições do Laboratório de Genética da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais. As modificações feitas em relação ao protocolo original foram em relação à concentração de cada dNTP (de 200 μM para 100 μM de cada um dos dNTPs), da U/amostra da enzima GoTaq® DNApolimerase / Promega (de 0,15 U para 1,0 U/amostra) e a temperatura padrão de anelamento (de 48 ºC para 49 ºC).
Para realizar a sexagem foi preciso conhecer estes marcadores na espécie a ser sexada, ou seja, definir o padrão de macho e fêmea para cada espécie (Miyaki et al. , 1998). A PCR foi realizada com o estudo do material genético de um casal que já possuía filhotes ou cujos sexos já tinham sido determinados.
O mix para PCR foi preparado em câmara de fluxo laminar a fim de se evitar qualquer tipo de contaminação com DNA exógeno.
O sistema e o programa de amplificação da PCR foram realizados conforme protocolos modificados de Griffiths et al. (1998). A reação de PCR para amplificação foi realizada no termociclador do Modelo MJ
