Extração e Caracterização de Compostos Ativos de Plantas Medicinais, Notas de estudo de Farmácia

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CAPÍTULO 1

INTRODUÇÃO

1.1 - PLANTAS MEDICINAIS

Desde os tempos mais remotos, as plantas foram usadas pelos homens em rituais festivos, como fonte de medicamentos para o tratamento de doenças, para o efeito da beleza e mesmo como veneno. A extração e caracterização de compostos ativos de plantas medicinais resultaram na descoberta de drogas de alto valor terapêutico. Dos fármacos empregados atualmente nos países industrializados, em torno de 25% advém direta ou indiretamente de produtos naturais, principalmente das plantas.^1 Há uma longa tradição do uso de plantas de uso cosmético, como exemplo, a beladona ( Atropa belladona L.) era colocada dentro dos olhos para produzir a dilatação das pupilas; atualmente a henna ( Lawsonia inermis ) é ainda usada para a coloração dos cabelos.^2 Talvez uma das plantas mais antigas empregadas pelo homem seja a Papaver somniferum , que originou o ópio e contém alcalóides e substâncias naturais, como a morfina. O ópio era conhecido pelas civilizações antigas, havendo relatos que confirmam seu uso desde 400 a.C., Galeno prescrevia o ópio para dores de cabeça, epilepsia, asma, cólica, febre e estados melancólicos. Os estudos químicos sobre o ópio começaram no século XIX, e em 1804 Armand Séquin isolou seu principal componente, a morfina, batizada em homenagem ao deus grego do sono Morpheu. A estrutura química da morfina foi elucidada em 1923 por Robert Robinson e colaboradores, e sua síntese foi descrita em 1952.^3 A quinina, um dos principais componentes da casca da Cinchona officinalis , originou os fármacos anti-maláricos cloroquina e mefloquina.^3 Para caçar ou pescar, os ameríndios empregavam poções capazes de envenenar ou imobilizar sua presa, sem que houvesse manifestação de efeitos tóxicos ao comê-la, como exemplo, temos o curare, conhecido pelos índios da Amazônia pelas propriedades ictiotóxicas.^3 A aspirina é o analgésico mais consumido e vendido no mundo. Muito embora derive do produto salicina, foi o primeiro fármaco sintético empregado na terapêutica, tendo sua síntese concluída em 1897, pelo químico alemão Felix Hoffman, do laboratório Bayer (está relatado na história que seu pai sofria de reumatismo crônico e não suportando mais o desconforto causado pelo tratamento com salicina, incentivou o filho a

O metabolismo das plantas é dividido didaticamente em metabolismo primário e secundário, sendo que não existe uma divisão exata entre eles. Metabolismo primário ou básico refere-se aos processos bioquímicos envolvidos na assimilação e transporte de nutrientes para a produção (anabolismo), degradação (catabolismo) ou simplesmente biotransformação de moléculas que são essenciais para a manutenção da vida e comum a todos os organismos vivos. Metabólitos primários, tais como carboidratos, aminoácidos, ácidos graxos e nucleotídeos são, portanto, encontrados em todas as plantas independentemente das espécies, e são diretamente associados ao crescimento e desenvolvimento das plantas. Substâncias originadas a partir de rotas biossintéticas diversas e que estão restritas a determinados grupos de organismos são produtos do metabolismo secundário. Possuem características químicas variadas e, às vezes, complexas sendo que a função de muitos destes compostos ainda permanece desconhecida. Os metabólitos secundários têm sido associados à adaptação do ambiente e interações ecológicas. Considerando a ausência do movimento e a falta de sistemas sofisticados de imunidade e processos neurológicos, as plantas tiveram que desenvolver seus próprios mecanismos de defesa e estratégias para assegurar sua disseminação. Muitos metabólitos secundários exibem mecanismos de proteção contra patógenos e predadores, como repelentes, liberando mau cheiro e sabor e até mesmo como veneno. Pigmentos de flores podem mostrar cores atrativas para polinizadores e insetos e preventiva contra predadores. O mecanismo do metabolismo secundário e sua ligação com o metabolismo primário são mostrados de maneira simplificada na Figura 1. Todos os metabólitos secundários derivam de duas maiores rotas biossintéticas principais: acetato, na forma de seu tioéster com a coenzima A e ácido chiquímico, ou da combinação de ambos. Acetato também é o precursor dos ácidos graxos, através da reação de condensação do mevalonato, um intermediário chave na síntese de isoprenóides e derivativos. Através do ciclo do ácido cítrico, acetato gera aminoácidos alifáticos, tais como ornitina e lisina, os precursores de várias classes de alcalóides (tropano, pirrolidina, etc). Ácido chiquímico produz diretamente ácido gálico, o progenitor de taninos hidrolisáveis, e aminoácidos aromáticos

(triptofano, fenilalanina, tirosina) envolvidos na síntese de outros alcalóides (indóis, etc). Via aminoácidos aromáticos, o ácido chiquímico é também ligado à síntese de outros importantes intermediários, como o ácido cinâmico, o precursor de numerosos compostos aromáticos (fenilpropanóides, cumarinas, etc). O esqueleto básico de flavonóides (dois anéis aromáticos conectados a três pontes de carbonos) bem como os taninos condensados, originam de duas rotas separadas: a rota do ácido chiquímico, via fenilalanina e ácido cinâmico, e a rota do acetato, via ácido malônico.

Figura 1 - Esquema geral do metabolismo das plantas.

1.3 - ÍNDICES ECONÔMICOS A Organização Mundial da Saúde (OMS) apresentou dados em 1994, nos quais 90% da população do mundo faziam uso de plantas medicinais pelas propriedades curativas e 81% não tinham acesso a drogas sintéticas. A importância das plantas medicinais é demonstrada, até pelo fato que, 35% das drogas prescritas são de origem natural em países desenvolvidos.8, Em 2000, o mercado mundial de plantas medicinais movimentou um valor estimado de 22 bilhões de dólares, com taxas de crescimento entre 10

fitoterápico é um medicamento com componentes ativos de origem vegetal, devendo apresentar estudos de eficácia e toxicidade dos produtos já existentes no mercado, estabelecendo-se um controle mais efetivo por parte dos fabricantes e revendedores de fitoterápicos. Segundo a portaria, o fabricante deveria elaborar um relatório técnico que contenha informações sobre a matéria-prima vegetal, droga vegetal, preparo fitoterápico intermediário, produto fitoterápico, segurança e eficácia, incluindo também dados sobre a planta fresca, características macroscópicas e microscópicas, testes de pureza, análise qualitativa e quantitativa dos princípios ativos, entre outros.^17 Esta legislação foi reformulada, mantendo suas características essenciais.^18 Em 2004, novos critérios foram avaliados para a produção de fitoterápicos sendo publicado no Diário Oficial da União (DOU) por meio da Resolução RDC no^ 48, de 16 de março de 2004. A base principal da legislação é a garantia de qualidade do medicamento para o consumidor, exigindo a reprodutibilidade dos fitoterápicos fabricados, a partir de um “marcador” (Apêndice 1), assegurando ao paciente o consumo da mesma quantidade da substância ativa na troca da cartela, ou mesmo a opção por outro fabricante. Outro critério é a comprovação da eficácia e segurança dos fitoterápicos.^16

1.3.1.2 – Dados Econômicos Brasileiros No Brasil, em 1998, os produtos naturais foram responsáveis pelo controle de 5,5% do mercado total de medicamentos, representando aproximadamente 566 milhões de dólares.^19 Além do uso fitoterápico, indústrias de perfumes, cosméticos e alimentos utilizam uma grande variedade de essências e óleos essenciais, oriundas de plantas, com taxa de crescimento anual de aproximadamente 6% para perfumes, 8% na área de alimentos e 7,5% em óleos essenciais.^20 O forte crescimento verificado neste setor deve-se à procura da população por produtos naturais, a melhoria da qualidade dos produtos oferecidos ao consumidor, com a regulamentação da ANVISA e a entrada de grandes empresas farmacêuticas no setor de fitoterápicos.^21 Em 2004, a ANVISA aprovou o único medicamento à base de isoflavona da soja

(elaborado à base de extrato seco de Glycine max padronizado), do Aché Laboratórios.^22

1.4 - EXTRAÇÃO No século 18, a extração do aroma das flores era feita por uma técnica denominada enfleurage , na qual, gordura era colocada em contato com as flores, extraindo os odores da matriz da planta.^23 O conceito básico de preparação de amostra é converter uma matriz em uma amostra no formato que é desejado para análise, os modos de extração têm em comum alguns objetivos:

• remover interferentes da amostra, portanto, aumentando a seletividade do método,
• aumentar a concentração do analito e desta forma a sensibilidade do ensaio,
• se necessário, converter o analito em uma forma mais desejável para detecção ou separação,
• providenciar um procedimento robusto e reprodutível que é independente das variações na matriz da amostra. Os objetivos dos recentes procedimentos para a extração de sólidos tendem a reduzir a quantidade de solvente e de amostra, um diferencial sob o aspecto ambiental, minimizando a geração de resíduo químico. Ainda, reduzir o tempo e melhorar a seletividade da extração,^24 além do uso de métodos validados, melhorando a qualidade e credibilidade do produto. A extração de compostos bioativos de materiais vegetais pode ser realizada de diversas formas, entre as quais: extração por solvente, maceração, percolação, fluido super crítico, Soxhlet, destilação, ultrassom, entre outros. Pela Farmacopéia americana, os métodos mais utilizados para extração de constituintes de plantas são ultrassom, aquecimento sob refluxo e extração por Soxhlet. A extração exaustiva mais freqüentemente utilizada é a extração por Soxhlet.^25 Nos próximos itens são mencionados alguns tipos de extrações. É essencial que o solvente usado para a extração de plantas para uso cosmético seja adequado para as necessidades do produto final, por exemplo, seria inapropriado incorporar um extrato contendo uma mistura de

concentração entre a solução e o resíduo sólido e o processo no qual a droga é extraída exaustivamente (remove completamente as substâncias desejadas da planta).^27 No primeiro método pode-se citar extração por maceração e por ultrassom, e no segundo método, extração por Soxhlet e percolação.

1.4.1.1 – Extração por Maceração Na maceração, de acordo com a USP 26,^28 o material que está sendo extraído é primeiramente reduzido em um tamanho desejável, misturado com o solvente extrator e mantido a temperatura ambiente por um tempo apropriado e com freqüente agitação até que o material solúvel seja dissolvido. A mistura é filtrada, o material insolúvel é lavado com o mesmo solvente usado para a maceração e o filtrado é combinado e concentrado, usualmente a pressão reduzida, até desejável consistência. De acordo com Simões et al.^6 , a extração é realizada em recipiente fechado, mantido a diversas temperaturas, durante um período prolongado (horas ou dias), sob agitação ocasional e sem renovação do líquido extrator. Este procedimento não conduz ao esgotamento da matéria-prima vegetal, devido `a saturação do meio extrator ou ao estabelecimento de um equilíbrio difusional entre o meio extrator e o interior da célula. Os fatores que influenciam a eficiência da maceração incluem: tamanho do material, capacidade de intumescimento, temperatura, agitação, tempo de extração, proporção planta/solvente, etc.

1.4.1.2 - Extração por Ultrassom O ultrassom tem sido utilizado para a extração de componentes ativos de plantas devido ao seu baixo custo, por reduzir o tempo de extração e aumentar o seu rendimento. Este melhoramento de extração é atribuído ao fenômeno denominado de cavitação, produzido no solvente pela passagem do ultrassom. Isto ocorre devido a formação de bolhas, sendo que a implosão das cavidades cria altas pressões e temperaturas no micro- ambiente.^29 O tamanho das bolhas é muito pequeno, relativo ao volume do líquido total, então o aquecimento produzido é rapidamente dissipado com apreciável mudança nas condições do meio extrativo.^30 O efeito das ondas

ultrassônicas no material vegetal rompe as células e libera o seu conteúdo para o meio de extração. A extração de material seco envolve dois estágios: o passo inicial em que o solvente penetra no vegetal facilitando o processo de inchamento e de hidratação. E o segundo passo, em que ocorre a transferência de massa de constituintes solúveis do material para o solvente por difusão e processo osmótico. É durante este estágio que energia adicional é usada para acelerar o processo, tal como agitação, aumento de temperatura e vibração.^31 Numerosos fatores afetam a extração, entre os quais, as propriedades do material vegetal, quantidade, solvente (seletividade e quantidade). Reduzindo o tamanho do vegetal aumenta-se o número de células diretamente expostas para extração por solvente em ultrassom, este efeito pode ser utilizado moendo-se o material antes da extração.^31 Para a extração por ultrassom, vibrações com freqüências acima de 20 kHz são aplicadas à amostra, porém, a sonicação pode causar decomposição ou oxidação de compostos.^8 O ultrassom pode produzir alguns efeitos químicos devido à produção de radicais livres dentro das bolhas de cavitação, não sendo benéfico para o processo de extração. A sonicação da água resulta na formação de radicais livres, os quais podem combinar-se para formar peróxido de hidrogênio. A extração por ultrassom é efetiva para extrair vários analitos de diferentes tipos de amostras. Altas temperaturas (que aumentam a solubilidade e difusividade) e pressões (que favorecem a penetração e transporte da interface entre a solução aquosa ou orgânica sujeita à energia ultrassônica e uma matriz sólida) resultam em alto poder extrativo.^30 De acordo com Vinatoru e colaboradores poucas plantas requerem mais de duas horas de sonicação.^32 O benefício de usar o ultrassom na extração de plantas já tem sido demonstrado por um grande número de compostos de interesse da indústria de alimentos, farmacêutica e cosmética. A redução do tempo de maceração de 8 h para 15 min, usando ultrassom, tem sido reportada na extração do alcalóide reserpina de Rawolfia serpentina.^33 A extração de compostos farmacologicamente ativos da Salvia officinalis aumentou a eficiência de

coluna de vidro, contendo uma barreira que retém a amostra, por exemplo, vidro sinterizado, e eluída com solvente apropriado. Neste processo a extração, fracionamento e purificação são realizadas em uma única coluna. Cuidados devem ser tomados para que não ocorra a formação de canais e a não compactação do material. O procedimento da extração realizada por MSPD é mostrado na Figura 2. MSPD conduz simultaneamente o rompimento e extração de amostras sólidas, semi-sólidas e viscosas em um suporte sólido, este, dispersa os componentes da amostra, aumentando a área superficial e os componentes distribuem-se entre as fases de acordo com suas polaridades. Os componentes apolares dispersariam na fase apolar e seriam afetados pelas mudanças dinâmicas que ocorrem durante o processo. Moléculas polares pequenas (como a água) associariam-se com silanóis, bem como componentes da matriz capazes de fazer ligações por ligações de hidrogênio.^41

Figura 2 – Procedimento para extração por MSPD.

MSPD tem sido usada na extração de compostos fenólicos do chá verde, como ácido gálico, ácido siríngico, catequinas, rutina e epigalocatequina.^42 MSPD também foi usada para a determinação de isoflavonóides em Radix astragali^43 e na extração de ácidos fenólicos de Melissa officinalis.^44 Um sorvente, conhecido como Florisil, consiste de grânulos brancos e porosos, composto de 15,5% de óxido de magnésio, 84% de dióxido de silício e 0,5% de sulfato de sódio^45 e possui como centro aceptor de elétrons, os íons Mg2+, que retêm compostos com pares de elétrons livres de átomos de nitrogênio (ou enxofre), tais como quinolina, purina e derivativos de pirimidina e aminoácidos, removendo-os dos extratos.^46 Compostos básicos

incluindo pentano, hexano, éter dietílico, acetato de etila, clorofórmio e cloreto de metila. Para um analito i , o processo de extração pode ser ilustrado como: i (^) amostra i (^) fase orgânica onde a amostra representa a solução da amostra e a fase orgânica representa o solvente utilizado na extração. No equilíbrio, o coeficiente de partição ( Ki ) de um analito em um sistema de duas fases é: Ki = C i, fase orgânica / C i, amostra onde, C i, fase orgânica é a concentração de i no solvente de extração e C i, amostra é o equilíbrio da concentração de i na fase da amostra, sendo que o analito deveria ser extraído quantitativamente da amostra na fase orgânica. Para compostos com características ácidas ou básicas, o ajuste do pH é de grande importância para assegurar alto coeficiente de partição. Na extração de compostos básicos, o pH é ajustado na faixa alcalina, enquanto que para os compostos ácidos, na faixa ácida. Na extração ácido-base utilizam-se processos de partição entre solventes aquosos ácidos ou básicos e solventes orgânicos imiscíveis com água (éter, clorofórmio, acetato de etila). Para uma única extração (a frio ou a quente) usa-se geralmente um solvente polar (etanol ou metanol), para mais de uma extração utilizam-se 3 tipos de solventes: apolar (hexano, éter de petróleo), de polaridade moderada (diclorometano, clorofórmio) e polar (metanol, etanol), no entanto, devido a protocolos internacionais, que condenaram o uso de solventes clorados, estes solventes já não devem ser utilizados para a preparação de extratos, sendo, portanto, indicadas duas extrações.^54 Um dos princípios que os químicos usam para predizer a solubilidade de uma substância é que ela tende a dissolver em um solvente que é quimicamente similar, por exemplo, a solubilidade em água requer que as espécies tenham algumas características neste meio. O grupo hidroxila é polar, por causa da diferença na eletronegatividade entre os átomos de hidrogênio e oxigênio, em outras palavras, a ligação tem também caráter iônico parcial.^49

Etanol possui um grupo hidroxila similar ao da água, portanto, quando etanol é adicionado na água, ambos são miscíveis em todas as proporções. A atração entre as moléculas é enfraquecida pela presença de unidades apolares de hidrocarbonetos, por exemplo, a solubilidade de octanol em água é de 2%, isto ocorre devido a sua característica estrutural dominante, por possuir unidades de hidrocarbonetos. A atração do grupo polar OH para a água não é suficientemente forte, portanto a solubilidade de octanol seria maior em um solvente apolar. Em geral, se um composto tem um grupo polar e apolar em sua estrutura, aquele tendo cinco ou mais átomos de carbono na porção de hidrocarboneto da molécula seria mais solúvel em solventes apolares como éter dietílico, pentano ou cloreto de metila.

1.4.3 - Extração em Fase Sólida^55 Uma das técnicas usadas para limpeza de amostra é a extração em fase sólida, conhecida como SPE (do inglês, Solid Phase Extraction), a qual envolve o uso de cartuchos, onde a amostra passa através do sorvente ativado, e os analitos concentram-se em sua superfície, enquanto outros componentes passam através deste. O equilíbrio entre o analito e o sorvente é alcançado rapidamente por causa da grande superfície do sorvente. Usualmente, o tamanho das partículas varia de 10 - 60 μm. Como os materiais são similares aos usados em cromatografia líquida (exceto, pelo tamanho da partícula), a grande variedade de fases estacionárias da cromatografia líquida são também aplicadas à SPE. A escolha do sorvente depende da matriz da amostra, do analito interesse e seus interferentes. A extração é conduzida em quatro etapas: 1 - condicionamento - o grupo funcional do sorvente é solvatado para fazê-lo interagir com a amostra, 2 - retenção - os analitos são ligados à superfície, 3 - lavagem - espécies indesejáveis são removidas e, 4 - eluição - os analitos são dessorvidos e coletados para análise.

amostra (1 - 10 nL), baixo consumo de reagentes e a completa automação da análise, com possibilidade de injeção e detecção em fluxo. A configuração instrumental básica de um equipamento de eletroforese capilar está esquematizada na Figura 3.^61 O sistema consiste de uma fonte de alta tensão, capilares (o mais comumente usado é o de sílica fundida), eletrodos (usualmente platina) e um detector apropriado. As extremidades do capilar são imersas nos reservatórios contendo um eletrólito adequado, sendo preenchido com o mesmo. Uma fonte de alta tensão é usada para estabelecer um campo elétrico, sendo conectada através de eletrodos aos dois reservatórios.

Figura 3 – Instrumentação para eletroforese capilar.

Capilares de sílica fundida são tipicamente usados como uma célula de detector, pois são transparentes à luz ultravioleta (UV) e visível (Vis). A janela da célula pode ser simplesmente queimada em uma pequena seção do capilar, retirando-se a cobertura externa de poliimida. Esta seção é então colocada no caminho de luz do detector. Capilares são freqüentemente inseridos em cartuchos dotados de sistema de circulação de líquido que permite o controle termostático do capilar. Um outro sistema utiliza ventiladores para dissipação do calor.

CONTROLE

FONTE DE

ALTA TENSÃO

DETECÇÃO

CAPILAR

SAÍDA AMOSTRA ENTRADA

CONTROLE

FONTE DE

ALTA TENSÃO

DETECÇÃO

CAPILAR

SAÍDA AMOSTRA ENTRADA

Na eletroforese capilar as amostras podem ser introduzidas no capilar pelos modos eletrocinético ou hidrodinâmico. Na injeção eletrocinética, um gradiente de potencial é estabelecido ao longo do comprimento do capilar por um período de tempo conhecido, enquanto que na injeção hidrodinâmica utiliza-se um gradiente de pressão. O gradiente de pressão pode ser estabelecido por diferentes mecanismos: pressurização ou vácuo em um dos reservatórios de solução, ou por gravidade, onde um dos reservatórios é elevado em relação ao outro e a amostra é introduzida por sifonagem. O desenvolvimento de novos sistemas de detecção em eletroforese capilar tem sido uma área de intensa pesquisa desde a implementação da técnica.^62 O rápido avanço técnico nessa área tem sido atribuído a relativa facilidade com que alguns detectores, de uso geral em cromatografia líquida, são adaptados para eletroforese capilar. Pequenas modificações nestes detectores são suficientes para acomodar capilares de sílica fundida, como células de detecção em fluxo. Uma variedade de detectores tem sido usada na eletroforese capilar, incluindo detecção por ultravioleta-visível (UV/Vis), por fluorescência, por condutividade, amperométrica, espectrometria de massas, etc. O detector mais amplamente utilizado é o de UV/Vis, sendo um tipo deste utilizado o arranjo de diodos, que tem a vantagem de detecção em múltiplos comprimentos de onda e a habilidade de fornecer dados espectrais.

1.5.2 - Mobilidade Eletroforética Solutos carregados são separados devido às diferenças em suas mobilidades eletroforéticas (μef). Sob ação de um campo elétrico (E) e na ausência de fluxo, um soluto carregado migrará através do tampão com uma velocidade eletroforética (vef) expressa pela Equação [1]. . vef = E. μef

Sendo a velocidade eletroforética e o campo elétrico expressos pelas Equações [2] e [3]. vef = Ld / tmig E = V / Ltot

[2]

[3]

[1]