UNIVERSIDADE
FEDERAL
DE
UBERLÂNDIA
FACULDADE
DE
MEDICINA
VETERINÁRIA
RENATO
CÉSAR
CÔRTES
ROSA
A
INTERFERÊNCIA
DA
HIDROCLOROTIAZIDA
NO
REPARO
DE
LESÕES
ÓSSEAS
INDUZIDAS
EM
RATOS
WISTAR
Uberlândia
-
MG
Julho/2017
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Avaliação da maturação óssea em ratos tratados com hidroclorotiazida, Slides de Desenho
Um estudo que avaliou a maturação óssea em ratos tratados com hidroclorotiazida, comparando-os a um grupo controle. O estudo foi realizado em 24 fêmeas divididas em dois grupos de 12 animais cada. O grupo tratado recebeu hidroclorotiazida e o grupo controle recebeu carboximetilcelulose. Após o tratamento, as lesões ósseas foram criadas e a análise histológica qualitativa foi realizada para avaliar os aspectos morfológicos do reparo ósseo. Os resultados mostraram que o grupo tratado com hidroclorotiazida obteve uma maior maturação de tecido ósseo secundário em comparação ao grupo controle.
Tipologia: Slides
2022
Compartilhado em 07/11/2022
usuário desconhecido 🇧🇷
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
RENATO CÉSAR CÔRTES ROSA
A INTERFERÊNCIA DA HIDROCLOROTIAZIDA NO REPARO DE LESÕES
ÓSSEAS INDUZIDAS EM RATOS WISTAR
Uberlândia - MG Julho/
RENATO CÉSAR CÔRTES ROSA
A INTERFERÊNCIA DA HIDROCLOROTIAZIDA NO REPARO DE LESÕES
ÓSSEAS INDUZIDAS EM RATOS WISTAR
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado ao curso Medicina Veterinária, da Universidade Federal de Uberlândia - UFU, como requisito parcial à aprovação na disciplina de Trabalho de Conclusão de Curso.
Orientador: Prof. Dr. Francisco Cláudio Dantas Mota.
Uberlândia - MG Julho/
AGRADECIMENTOS
Ao Pai Maior, pela vida, saúde e inteligência durante toda a graduação, que
me propiciou a oportunidade do estudo e entendimento da importância da minha
profissão. Minha gratidão pela maturidade e discernimento no momento da decisão
pela graduação em Medicina Veterinária. Agradeço aos irmãos espirituais que me
acompanharam durante todos esses anos, trazendo energias de ânimo e coragem
para enfrentar as dificuldades do aprendizado.
Aos meus pais, Sônia Beatriz e João Batista, minha enorme gratidão à
minha vida, meus princípios e o grande apoio nas minhas escolhas. Agradeço as
inúmeras orações pela minha proteção e sucesso em meus estudos. Vocês são
meus espelhos, onde busco sempre a referência de simplicidade, humildade e
caráter exemplar.
A minha esposa, Augusta Ferreira, por acreditar no meu potencial, por me
incentivar, encorajar e proporcionar a conquista do maior sonho da minha vida, a
graduação em Medicina Veterinária. Foram inúmeras vezes em que seu carinho e
seu amor, me encorajou e me impulsionou, em busca do meu propósito, sempre
confiando na minha capacidade, enxergando em mim o Médico Veterinário que me
torno agora. Seus conselhos, apoio e amizade foram de extrema importância para
minha graduação. Obrigado pelo entendimento das ausências nos fins de semanas
quando estudava e pela minha ausência noturna quando virava a noite estudando.
Você foi essencial para realização de tudo isso.
Ao grupo dos “Sobreviventes” agradeço imensamente, Luciana Ribeiro,
Karina Sonálio e Jéssica Soares, pelo companheirismo e cumplicidade durante toda
minha trajetória. A amizade gerada na graduação que levarei para toda vida.
Meus agradecimentos ao Institute of Biomedical Sciences - ICBIM, pela
colaboração na execução deste trabalho no Laboratório. Agradeço de forma
particular ao professor Dr. Luiz Borges Bispo-da-Silva, pelas suas orientações e
ensinamentos.
Pela minha orientação exemplar, agradeço ao meu professor Dr. Francisco
Cláudio Dantas Mota, que com seu imenso conhecimento me conduziu pelos
caminhos da pesquisa, oferecendo a participação neste projeto, que foi de extrema
importância para meu aprendizado.
RESUMO
O osso é um tecido multifuncional, metabolicamente muito ativo, constituído por uma população heterogênea de células, em diferentes estágios de diferenciação celular. Está em equilíbrio dinâmico, com regulação da mobilização e deposição mineral, durante a vida do indivíduo. É um tecido metabolicamente que sofre um processo contínuo de renovação e remodelação. Diversos são os tipos de fraturas e suas causas etiológicas podem partir e eventos patológicos a traumáticos. Sendo assim o processo de remodelação óssea desenvolve-se com base em dois processos antagônicos, mas acoplados: a formação e a reabsorção óssea a cargo das células das linhas osteoblástica e osteoclástica. Várias técnicas de avaliação têm sido propostas para o diagnóstico e acompanhamento da regeneração óssea. Por exemplo, as radiografias são usadas para dar informações qualitativas sobre a linha de fratura e observar a união dos fragmentos ósseos, ou mesmo quantificar parâmetros da geometria, porém é incapaz de predizer a rigidez do calo. Existem ainda as opções sobre o efeito de algumas medicações entre outras. Sendo assim, objetivou-se neste trabalho verificar a atuação da hidroclorotiazida no processo de regeneração óssea após lesão por escareação na tíbia de ratas Wistars. Para tal, foram utilizados 24 animais fêmeas, divididos em dois grupos contendo cada 12 animais: grupo I ou controle e grupo II ou hidroclorotiazida. Estes grupos foram subdividos em 02 subgrupos de 06 animais cada, analisados aos 7 e 15 dias da lesão na tíbia realizado com procedimento cirúrgico com animais devidamente sedados. Em suma, este trabalho mostrou que a hidroclorotiazida não favorece maior formação de tecido ósseo primário em comparação ao grupo controle, porém pode observar que o grupo tratado com a Hidroclorotiazida obteve uma maior maturação de tecido ósseo secundário ou permanente em comparação ao grupo controle.
Palavras-chaves: Consolidação de Fratura. Regeneração Óssea. Tecido Ósseo. Tiazidas.
LISTA DE SÍMBOLOS, SIGLAS E ABREVIAÇÕES
% - Percentagem; + - Osso primário; t - Matriz óssea secundária;
® - Marca registrada;
ad libitum - a vontade;
ARFIS - Área de Ciências Fisiológicas;
C - cortical óssea;
Ca2+ - Íon Cálcio;
CEBEA - Comissão de Ética, Bioética e Bem-Estar Animal;
CEUA - Comitê de Ética na Utilização de Animais;
CFMV - Conselho Federal de Medicina Veterinária;
EDTA - Ácido Etilenodiamino Tetra-acético;
et al - E colaboradores;
F - Frequência;
GL - Grau de Liberdade;
HE - Hematoxilina-Eosina;
ICBIM - Instituto de Ciências Biomédicas;
kg - quilogramas;
M - Medula óssea;
mg - Miligramas;
NO - Neoformação óssea;
°C - Grau celsius;
RPM - Rotação por minuto;
SIG - Significância;
UFU - Universidade Federal de Uberlândia;
UI - Unidades Internacionais.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - O tecido ósseo e suas estruturas............................................... 14
Figura 2 - Desenho representativo de fratura fechada e fratura exposta .... 15
Figura 3 - Tipos de fraturas dos ossos ....................................................... 16
Figura 4 - Fluxograma de distribuição dos grupos controle e tratamento ... 20
Figura 5 - Etapas cirúrgicas para realização da lesão óssea, na metáfise
proximal da tíbia de ratas ............................................................................. 21
Figura 6 - Extensão de citologia vaginal de ratas em período de estro ....... 22
Figura 7 - Administração dos fármacos pelo método de gavavem em um
dos animais do experimento ........................................................................ 23
Figura 8 - Fotomicrografia de secção longitudinal da tíbia dos animais do
grupo 2 ......................................................................................................... 25
Figura 9 - Concentração plasmática de Ca2+ entre os grupos controle e
tratamento hidroclorotiazida aos sete e quinze dias de tratamento ............. 27
Figura 10 - Fotomicrografia de seção longitudinal de tíbia, aos sete e
quinze dias de tratamento ............................................................................ 28
Figura 11 - Porcentagem de neoformação óssea entre os grupos controle
e tratamento hidroclorotiazida aos sete e quinze dias de tratamento .......... 31
1. INTRODUÇÃO
A mineralização da matriz confere a este tecido uma extrema dureza, o
que lhe permite desempenhar importantes funções de sustentação e proteção.
Por sua vez, a matriz colagênica proporciona-lhe uma certa maleabilidade
fornecendo-lhe algumas possibilidades de extensão e flexão. A matriz óssea
representa, também, o maior reservatório de íons minerais do organismo,
particularmente de cálcio e fósforo, participando ativamente na manutenção da
homeostase dos níveis de cálcio no sangue e, consequentemente, em todos os
fluidos tissulares, condição essencial para a preservação da vida (JUNQUEIRA;
CARNEIRO, 2004).
O tecido ósseo é um dos tecidos com maior capacidade de reparação, exibindo um potencial de regeneração surpreendente, capaz de restaurar
perfeitamente sua estrutura original e suas propriedades mecânicas. No entanto,
o conhecimento sobre os múltiplos mecanismos ósseos regulatórios devem tanto
auxiliar o entendimento sobre a remodelação óssea quanto oferecer explicações
para as alterações que ocorrem em várias enfermidades, sendo esse estudo de
extrema importância (KAWAMOTO; NAGAOKA, 2000). A consolidação de uma fratura é um dos mais notáveis processos de reparo do corpo humano, porque dela resulta não somente uma cicatrização,
mas uma reconstituição do tecido lesado em outro semelhante à sua formação
original. Isto acontece porque o osso está continuamente sendo depositado e
absorvido, gerando assim um processo de remodelagem constante do mesmo
(CORMACK, 2003).
O reparo de tecidos musculoesqueléticos ocorre por meio de resposta
tecidual composta de três fases, que não ocorrem separadamente e são
descritas como inflamação, reparação e remodelação (MULLER, 2004). A aplicabilidade do uso de drogas com a função de remodelação do
tecido ósseo pode aumentar a afetividade dos processo básicos que direcionam
e regulam a reparação do tecido. Sendo assim, objetivou-se neste trabalho,
pesquisar a influência da hidroclorotiazida sobre o processo de remodelação
óssea em ratos da raça Winster.
10
2. JUSTIFICATIVA
A não consolidação óssea é um dos principais problemas encontrados na
prática ortopédica, sendo a condição inicial para o desenvolvimento de
pseudoartroses, que são responsáveis por alta morbidade, pois nem sempre se
observa sua reparação. O uso de enxertos ósseos tem auxiliado os cirurgiões na
tentativa de reestabelecer a fisiologia óssea normal dos pacientes. Porém, nem
sempre são efetivos, devido a pouca quantidade obtida, grande morbidade ao
doador, e possíveis reações imunológicas que podem levar ao retardo e
insucesso da técnica. Assim, surge a necessidade de encontrar uma alternativa
que contribua para uma consolidação óssea que cause menos danos ao animal
e uma rápida recuperação após a fratura. Acreditamos que os efeitos da
hidroclorotiazida possa acelerar o processo cicatrização óssea. Se comprovada
sua eficiência, essa droga pode se tornar mais um método a ser empregado no
auxílio da reparação dos tecidos ósseos.
11
4. REFERENCIAL TEÓRICO
4.1 O Tecido Ósseo
O sistema esquelético é dividido em esqueleto axial, que compreende
crânio, coluna vertebral, costelas e esterno, e o esqueleto apendicular, que é
dividido em cíngulos do membro superior, inferior, com braços e pernas. Na
composição do esqueleto ósseo, existem quatro tipos de ossos, que são
caracterizados como: longos, curtos, planos e irregulares. O sistema ósseo
constitui a maioria das estruturas no sistema esquelético, e o esqueleto
representa aproximadamente 20% do peso total corporal (HAMILL; KNUTZEN,
2012).
O tecido osso se compõe basicamente de substância mineral, na forma
de hidroxiapatita de cálcio, e por colágeno do tipo I numa substância fundamental
de glicosaminoglicanos. A matriz colagenosa é conhecida como osteóide (essa
matriz é produzida pelo principal tipo celular do osso, o esteoblasto (uma célula
que reveste as superfícies formadoras de tecido ósseo. Mais tarde, essas células
terminam encarceradas no interior da matriz e passam a chamar-se osteócitos
(JONES et al., 2000).
Na sua formação o osso se desenvolve por substituição de um tecido
conjuntivo preexistente. Os dois processos de formação do osso ou osteogênese
observados no embrião são: 1 (ossificação intramembranosa, na qual o tecido
ósseo e depositado diretamente no tecido conjuntivo primitivo ou mesênquimal)
e 2 (ossificação endocondral, na qual o tecido ósseo substitui uma cartilagem
hialina preexistente, o molde do futuro osso (KIERSZENBAUM, 2004).
Macroscopicamente, o tecido ósseo pode se apresentar como
compacto, na região mais periférica dos ossos, denominada cortical, e esponjoso
ou trabecular, com rede de trabéculas contendo espaços intercomunicantes que
abrigam a medula óssea (figura 1). As superfícies ósseas internas e externas
são revestidas respectivamente pelo endósteo e periósteo. O periósteo constitui
membrana de grande importância para a integridade dos ossos
(KATCHBURIAN; ARANA, 2004).
13
Figura 1 - O tecido ósseo e suas estruturas.
OSSO COMPACTO
MEDULA VERMELHA
VEIAS E ARTÉRIAS
PERIOSTEO
OSSO ESPONJOSO
Osso Saudável
Fonte: (DYCE et al., 2004).
O tecido ósseo é um tecido que exerce variadas funções no organismo
vertebrado, atua na proteção e suporte dos tecidos moles, protegem órgãos,
ancoram e apoiam músculos e participa como moradia para a medula óssea na
produção de células sanguíneas. É um tipo especializado de tecido conjuntivo
formado por células e material extracelular calcificado (STEVENS; LOWE, 2001;
PORTINHO et al., 2008; FEITOSA, 2008).
O osso é um tecido dinâmico, complexo, influenciado por fatores
fisiológicos, nutricionais e físicos, como estresse mecânico e atividades físicas.
Para atender às necessidades de crescimento do organismo os ossos sofrem processo de modelagem, que representa o alongamento longitudinal e do diâmetro. Há uma variação individual e específica do crescimento de cada osso cujo controle se dá sobre a físe, isto é, cada cartilagem de conjugação tem uma
taxa específica de crescimento, em que o controle é geralmente hereditário
(JUNQUEIRA; CARNEIRO, 2004). O osso está estreitamente relacionado com o desenvolvimento do animal, sofrendo adaptações frequentes quanto à sua constituição, podendo estar hipertrofiado quando é mais exigido, ou atrofiado quando em desuso. Serve de reserva metabólica de cálcio e fósforo no organismo, os quais podem ser mobilizados durante alterações da homeostase (MACARI et al., 2002).
14
De acordo com Jones et al. (2000), ainda existem mais 6 tipos de
fraturas: fratura transversa (quando o traço de fratura atravessa o osso numa
linha mais ou menos reta); fratura cominutiva (quando existem muitas partes
fraturadas); fraturas impactada (raramente ocorre, mas neste tipo de fratura um
fragmento ósseo se projeta forçadamente para dentro de outro osso); fratura em
galho verde (quando o periósteo permanece intacto e mantém no lugar as extremidades do osso); fratura por tensão (quando o osso se encontra sob repetida tensão, aumenta a atividade de remodelagem - que possivelmente está direcionada para o reparo das micro lesões. Quando a tensão continua, formam- se os calos periosteais e endosteais, que ajudam a fortalecer o osso, ao mesmo
tempo que ocorre a remodelagem ativa) e por último, fratura patológica (fratura
que ocorre não como resultado de qualquer traumatismo pouco habitual, mas porque o osso sofreu debilitação precedente por alguma outra moléstia, como exemplo cita-se a distrofia fibrosa, ou tumores ósseos) (figura 3).
Figura 3 - Tipos de fraturas dos ossos.
Impactada Obliqua^ Transversa
Cominutiva (^) Galho verde Espiral
Fonte : adaptado (BIOSOM, 2017).
16
Dentre as complicações mais comuns destacam-se, a não união óssea, a união retardada e a pseudoartrose. Ambas levam a desvios e inadequação
óssea, comprometendo a deambulação do animal (PRENTICE, 2012).
4.3 Reparo das Fraturas
Os eventos envolvidos no processo de reparação óssea são de extrema
complexidade, pois incluem uma série de eventos interagindo em prol da cura
do osso; esses eventos são: síntese de gene, atividade de grande quantidade de células e proteínas, atuando na restauração da integridade do tecido ósseo
para a restauração das extremidades envolvidas na fratura (OLIVEIRA et al.,
2011).
Ainda de acordo com Oliveira et al. (2011), a reconstrução de grandes defeitos ósseos continua sendo um dos desafios da engenharia de tecidos. Na
tentativa de reparar defeitos ósseos, novas abordagens propõem a utilização de
medicamentos e ou agentes bioativos que favoreçam a sua remodelação em
períodos de tempo mais curtos.
As fases de recuperação necessitam das chamadas “moléculas
sinalizadoras”, que regulam a atividade e diferenciação das diversas células
envolvidas. Essas moléculas, basicamente são o fator de crescimento de
transformação beta (TGF-P), proteínas morfogenéticas ósseas (BMPs), fator de
crescimento de fibroblasto (FGF), fator de crescimento semelhante a insulina
(IGF), fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF), citocinas (interleucina- 1, ou IL-1, IL-6, fator de necrose tumoral - TNFa), metaloproteinases, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), e angiopoietina (DIMITRIOU et al.,
2005).
Alguns fatores podem atrasar ou mesmo impedir a união dos fragmentos
ósseos, como a severidade e a localização da fratura, a natureza do suprimento
sanguíneo para o osso, a extensão da lesão em tecidos moles, perda óssea, contato com o ar e contaminação, ou mesmo presença de tumor. Outros fatores sistêmicos podem estar envolvidos, como alcoolismo, fumo, idade e diabetes (HADJIARGYROU et al., 1998).
17
5. MATERIAL E MÉTODOS
5.1 Animais
Inicialmente este trabalho foi submetido ao Comitê de Ética na Utilização de Animais (CEUA) da Universidade Federal de Uberlândia (UFU) e aprovado sob número de protocolo N° 014/16 (anexo I). Foram utilizadas 24 ratas, ( Rattusnorvegicus , variação albinus, Wistar), com peso médio de 230g e idade aproximada de 10 semanas, adquiridos junto
à Comissão de Ética, Bioética e Bem-Estar Animal (CEBEA) da UFU.
Os animais foram mantidos na Área de Ciências Fisiológicas (ARFIS) do Instituto de Ciências Biomédicas (ICBIM) também da UFU em gaiolas apropriadas, condicionadas em estantes climatizadas a temperatura de 22°C,
forradas com maravalha recebendo água e ração ad libitum. Cada gaiola alojou
seis animais. Os animais passaram por um período de ambientação desde o seu nascimento, até serem submetidos ao procedimento de experimentação.
5.2 Grupos Experimentais
Após a cirurgia, os animais foram divididos em dois grupos com 12 animais cada (figura 4), sendo o grupo I o controle e o grupo II submetido ao
tratamento com hidroclorotiazida, como mostrado a seguir:
S O grupo I - GRUPO CONTROLE: submetidos a osteotomia, receberam carboximetilcelulose (veículo usado para diluição das drogas) por via oral, duas horas após a lesão, até o dia da eutanásia. Este grupo foi subdividido em dois subgrupos de seis animas cada, analisados aos 7 e 15 dias de pós-operatório.
S O grupo II - GRUPO HIDROCLOROTIAZIDA : submetido a osteotomia,
receberam 15 mg/kg dia de hidroclorotiazida por via oral, 24 horas após a lesão, até o dia da eutanásia. Este grupo também foi subdividido em 02 subgrupos de 06 animas cada, analisados aos 7 e 15 dias de pós- operatório.
19
Figura 4 - Fluxograma de distribuição dos grupos controle e tratamento.
5. 3 Preparações do Veículo e Medicamento
Ambos a carboximetilcelulose e a hidroclorotiazida foram adquiridas de uma farmácia de manipulação de medicamentos veterinários da cidade de Uberlândia, MG, Brasil. Suspensões de hidroclorotiazida na dose de (15mg/mL)
foram preparadas imediatamente antes das administrações utilizando-se como
veículo carboximetilcelulose na concentração de (5%).
5.4 Procedimento Cirúrgico
Por se utilizar fêmeas no modelo experimental, tomou-se o cuidado para padronizar as lesões ósseas, realizando o procedimento cirúrgico sempre na mesma fase estral (estro/cio). Para identificação do ciclo estral, os animais foram submetidos a um lavado vaginal, com o auxílio de uma pipeta de Pasteur de 3 mL, foi injetado aproximadamente 0,5 mL de solução salina 0,9% no canal
vaginal, e aspirado em seguida, posteriormente realizou-se com essa solução
extensão em lâmina (figura 5) para visualização ao microscópio nas objetivas de
10 e 40x. Ainda de acordo com o mesmo autor (figura 5) ilustra um lavado vaginal
de rata para determinação do ciclo estral (VILELA et al., 2007)
20