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Um estudo sobre a renaturação de proteínas agregadas em células inclusas (ci) utilizando alta pressão hidrostática. O documento discute os benefícios associados à utilização de ci, fatores envolvidos no processo de agregação, o processo de renaturação em alta pressão hidrostática e resultados obtidos com a proteína egfp e outras proteínas de xanthomonas axonopodis pv citri. O estudo propõe alterações no processo de renaturação para melhorar os rendimentos.
O que você vai aprender
Tipologia: Exercícios
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Não perca as partes importantes!
Autarquia associada à Universidade de São Paulo
Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
São Paulo 2013
Autarquia associada à Universidade de São Paulo
Tese apresentada como parte dos requisitos para obtenção do Grau de Doutor em Ciências na Área de Tecnologia Nuclear – Aplicações.
Orientadora: Dra. Ligia Ely Morganti Ferreira Dias
São Paulo 2013
Agradecimentos
Agradeço principalmente à Deus , por ter me dado a vida e estar sempre do meu lado, permitindo que com o passar do tempo eu possa evoluir principalmente como ser humano.
Aos meus pais, Paulo e Beth , por dedicarem a vida por mim, por fazer de mim quem sou hoje, e pelo amor incondicional que sempre me fez seguir no caminho que escolhi.
Ao meu irmão Diego e a minha tia Eliane , mesmo que de longe, participaram de mais esta conquista e tenho certeza que torceram todos os dias pelo meu sucesso. Muito Obrigada, Amo vocês!!
Ao Bruno , pelo apoio em tudo que faço, pela dedicação, paciência e amor durante todos esses anos.
À minha orientadora Ligia Ely Morganti Ferreira Dias , pela oportunidade de ser sua aluna, pela confiança depositada em mim e por compartilhar comigo seus conhecimentos e experiências profissionais.
Ao Prof. Dr. Patrick Jack Spencer , por toda a ajuda e conselhos na realização deste trabalho e por dividir comigo seus conhecimentos e experiências no laboratório durante todos esses anos.
Ao Dr. Carlos Bonafé , pela colaboração permitindo a utilização do sistema de pressão do Laboratório Termodinâmica de Protreínas da UNICAMP e a Juliana e Joelma pela ajuda na realização dos experimentos.
Ao Dr. Geraldo Santana Magalhães , pela doação do gene da eGFP.
Ao Dr. Shaker Chuck Farah , a Cristiane Guzzo , ao Maicon e ao Raphael pela doação dos genes das proteínas de Xac e pela ajuda na realização dos experimentos de purificação e atividade biológica destas proteínas.
As amigas de trabalho, Laura , Daniella e Rosa , cada uma com o seu jeitinho aprendi que a convivência com as pessoas não é fácil, porém é impossível realizar o trabalho sozinha. Sem vocês o trabalho ficaria muito mais difícil, a cada uma o meu “muito obrigada”!!!
Às amigas que fiz no IPEN, Danielle , Keli , Larissa , Karina e Renata , pelas conversas, conselhos, saidinhas, almoços e tardes de risadas que tivemos durante todos esses anos de amizade. Muito Obrigada!
Aos amigos que fiz no IPEN, Alberto (Troxinha) , Mariana , Tamara , Rodrigo , Vincent , Eliza , Bia , Fernanda , Bruno , Ed Carlos , Allison , Daniele e a tantos outros.
A todos os funcionários do Centro de Biotecnologia do IPEN, que cada um em seu setor fez parte da realização deste trabalho, Rute , Arlete , Zé Maria , Junqueira , João, Sr. Longino, Sandra , Beth , Néia , Marisa , Gislaine , sem vocês não seria possível.
Às amigas, Renata (Fuba) , Flavinha (Florzinha) e Claudinha (Japa) pela amizade, pelo companheirismo, pelo apoio, pela paciência, pelas risadas e choros e por todos esses anos inesquecíveis que passamos juntas. Muito Obrigada pela amizade!!
Às amigas, Bianca , Giovanna , Thaís , Gabi e Thalita , que com o passar do tempo cada uma tomou um caminho diferente e não importa a distância e o tempo que passamos sem nos falar ou nos ver, que a amizade, o carinho e o amor continuam os mesmos, e tenho certeza que torcem pela minha felicidade. Muito Obrigada!!!
Ao CNPq e a FAPESP pelo apoio financeiro.
No presente trabalho estudamos a renaturação sob alta pressão hidrostática de uma forma mutante da proteína verde fluorescente (enhanced GFP, eGFP), a qual somente emite fluorescência característica quando enovelada na sua forma nativa. A abordagem do presente estudo foi focada no controle da bioatividade da proteína recombinante, a fluorescência, como alternativa à determinação de solubilidade da proteína, fator que não é um indicador ideal de enovelamento proteico adequado. A ação da alta pressão na solubilização dos corpos de inclusão (CI) de eGFP produzidos em bactérias E. coli recombinantes e no enovelamento da proteína foi estudada. A compressão dos CI de eGFP em 2, kbar durante 30 minutos promoveu a dissociação dos agregados. No entanto, a incubação nesta condição não favoreceu o enovelamento da eGFP. O processo de renaturação foi avaliado em diversas condições de descompressão após a dissociação em 2,4 kbar. Durante a descompressão gradual, o aumento da fluorescência foi obtido em pressões que variaram entre a pressão atmosférica e 1,38kbar. Os níveis mais elevados de fluorescência de eGFP foram obtidos por incubação durante várias horas a níveis de pressão entre 0,35 e 0,69 kbar. Esta condição de pressão se mostrou favorável à renaturação de eGFP e é possível que também possa ser utilizada para favorecer o enovelamento de outras proteínas monoméricas. Ainda utilizando a eGFP como modelo, verificamos que os CI desta proteína produzidos por bactérias cultivadas em menor temperatura (37ºC) possuem maior quantidade de proteína recombinante apresentando a fluorescência característica em 509 nm, ou seja, na sua forma nativa, do que os CI expressos em temperaturas mais elevadas (42ºC e 47ºC). A análise realizada por espectroscopia de infravermelho (FT-IR) também demonstrou que os CI produzidos em temperaturas mais brandas possuem maior grau de estruturas secundárias semelhantes às da proteína na sua forma nativa. Além disso, os CI
produzidos a 37ºC também são mais facilmente solubilizados pela ação da alta pressão do que aqueles produzidos em maior temperatura. Conforme esperado, a renaturação da eGFP a partir de CI produzidos a 37ºC foi 25 vezes mais eficiente do que a obtida utilizando CI produzidos a 47ºC. No presente estudo demonstramos também que a dissociação dos agregados exercida pela ação da alta pressão (2,4 kbar) pode ser amplificada quando em associação com a incubação em baixa temperatura (-9ºC) e que a combinação destas duas propriedades físicas eleva a solubilização dos agregados em CI, com a consequente elevação dos rendimentos de renaturação de eGFP. Mostramos ainda no presente estudo que a cinética de renaturação de eGFP em 0,69 kbar é proporcional à temperatura de incubação (entre 10ºC e 50ºC). O nível mais elevado de fluorescência foi obtido quando a renaturação de eEGP foi realizada a 20ºC. A taxa de maturação do cromóforo da eGFP é mais fortemente afetada pela temperatura do que a taxa de enovelamento da proteína. Em conclusão, a temperatura de produção dos CI, a temperatura de dissociação dos agregados e a temperatura de enovelamento podem afetar muito o rendimento e a cinética da renaturação de eGFP em alta pressão. Os resultados do presente estudo podem abrir novas perspectivas para melhorias no processo de enovelamento de proteínas a partir de CI utilizando alta pressão. Também neste trabalho descrevemos a renaturação das proteínas de Xac , PilB e os produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 nunca antes obtidas na forma solúvel. Os rendimentos de solubilização destas três proteínas foram muito altos, entre 75% e 89%. A proteína PilB renaturada em alta pressão apresentou atividade ATPasica elevada, o que nunca antes foi demonstrado para a PilB de Xac.
expected, the folding of eGFP from IB produced at 37ºC was 25 times more efficient than that obtained using IB produced at 47ºC. In this study we demonstrated that the dissociation of aggregates exerted by the action of high pressure (2.4 kbar) can be amplified by combination with incubation at low temperature (-9ºC) and the association of these two physical properties can be used to increase the solubilization of the aggregates in IB, with a consequent increase in the yield of eGFP refolding. In the present study we also showed that the kinetics of refolding of eGFP is proportional to temperature (10ºC – 50ºC). The higher level of fluorescence was obtained when the refolding of eGFP was performed at 20°C. The rate of maturation of the eGFP chromophore is more strongly affected by temperature than the rate of folding of the protein. In conclusion, the temperature of production of IB, the temperature of dissociation of aggregates and the folding temperature can greatly affect the yield and kinetics of refolding of eGFP at high pressure. The results of this study may open new perspectives for improvements in the process of protein folding from IB using high pressure. In this paper we also describe the refolding of the proteins of Xac , PilB and the gene products XAC and XAC3272, which have never before been achieved in soluble form. The yields of solubilization/refolding of these three proteins were very high, between 75% and 89%. The protein PilB refolded at high pressure presented high ATPase activity, which has never been shown for the PilB of Xac.
Figura 20. Efeito de alta pressão e baixa temperatura na dissociação dos CI de eGFP e na renaturação da proteína...................................................................... Figura 21. Cinética de renaturação da eGFP a 0,69 kbar. ................................... Figura 22. Cinética de fluorescência de suspensões de CI e proteína nativa, submetidos a 2,4 kbar, despressurização para 0,69 kbar e incubação em diferentes temperaturas. ....................................................................................... Figura 23. Efeito de diferentes concentrações de Gnd HCl na dissociação dos CI produzidos em diferentes temperaturas de cultivo. ............................................... Figura 24. Rendimentos de solubilização das suspensões de CI submetidas à renaturação em alta pressão. Seleção de proporção de glutationas reduzida/oxidada. .................................................................................................. Figura 25. Rendimentos de solubilização das suspensões de CI submetidas à renaturação em alta pressão. Seleção de proporção das concentrações de Gnd HCl. ....................................................................................................................... Figura 26. Rendimentos de solubilização das suspensões de CI submetidas à renaturação em alta pressão. Presença de diferentes aditivos. ............................ Figura 27. Rendimentos de solubilização das suspensões de CI submetidas à renaturação em alta pressão. Efeito de diferentes métodos de compressão e descompressão. .................................................................................................... Figura 28. Cromatografia em coluna de exclusão molecular (Superdex 200) das proteínas solúveis de Xac. ....................................................................................
A Absorbância aa Aminoácidos bis-ANS 4,4-dianilino-1,1-binaftil-5,5-sulfonato BSA Albumina bovina sérica CI Corpos de inclusão D.O. Densidade óptica Da Daltons DTT 1,4-ditiotreitol E. coli Escherichia coli EDTA Ácido etilenodiamino tetra-acético eGFP Enhanced green fluorescent protein EL Espalhamento de luz FT-IR Espectroscopia de infravermelho g Aceleração da gravidade Gdn HCl Hidrocloreto de guanidina GFP Green fluoroscence protein GSH Glutationa reduzia GSSG Glutationa oxidada
IPTG Isopropil, β-D-tiogalactopiranosídeo L-Arg L-Arginina MEV Microscopia eletrônica de varredura NaCl Cloreto de Sódio PEG Polietilenoglicol SDS Dodecil sulfato de sódio SDS-PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida Tris Tris(hidroximetil)aminometano Tween 20 Polioxietileno sorbitol monolaureato Xac Xanthomonas axonopodis pv citri
3.2.10. Dissociação dos CI sob alta pressão hidrostática e temperaturas negativas........................................................................................................ 3.2.11. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) ....................................... 3.2.12. Espectroscopia de infravermelho (FT-IR)........................................... 3.2.13. Purificação por cromatografia de afinidade por metais imobilizados.. 3.2.14. Cálculo das taxas de constantes de aquisição de fluorescência........ 3.2.15. Caracterização das proteínas solúveis PilB e produtos dos genes XAC2810 e XAC3272 por cromatografia de exclusão molecular ................... 3.2.16. Análise de atividade biológica das proteínas renaturadas sob alta pressão hidrostática .......................................................................................
4.2.6. Caracterização das proteínas de Xac por cromatografia de exclusão molecular........................................................................................................ 4.2.7. Análise de atividade biológica das proteínas de Xac renaturadas sob alta pressão hidrostática ................................................................................
acúmulo de proteínas com a conformação completa ou parcialmente incorreta; processo de renaturação proteica incorreto; ausência de modificações pós- traducionais necessárias para obter a solubilidade de algumas proteínas eucarióticas e inibição da formação de pontes dissulfeto nativas no ambiente redutor da bactéria (Fahnert, Lilie et al. 2004; Upadhyay, Murmu et al. 2012). Os CI citoplasmáticos (figura 1) são estruturas ovóides ou cilíndricas com diâmetros que variam de 0,5 a 1,3 μm e maior densidade (~1,3 mg/ml) do que muitos componentes celulares. O fato de os CI serem insolúveis facilita a sua separação dos outros componentes celulares por centrifugação e lavagens após o rompimento celular. Estas estruturas são altamente hidratadas, possuem uma arquitetura porosa e em geral são relativamente puras (Carrio, Cubarsi et al. 2000; Singh and Panda 2005). O tamanho dos agregados bem como as suas outras propriedades físicas e estruturais depende das condições de cultura e de indução da expressão nas bactérias hospedeiras (Margreiter, Messner et al. 2008; Margreiter, Schwanninger et al. 2008).
Figura 1. Microscopia eletrônica de varredura (MEV) dos CI do fator estimulador de colônias granulocitárias humano (G-CSF). Retirado de(Peternel, Grdadolnik et al. 2008.)
Até recentemente as proteínas dos CI eram consideradas como totalmente inativas. No entanto, o conhecimento atual sobre CI evoluiu e hoje em dia se reconhece que proteínas agregadas em CI não são necessariamente inativas (de Groot and Ventura 2006). Por meio de espectroscopia de infravermelho (FT-IR) se demonstrou que as proteínas nos CI possuem estruturas secundárias semelhantes àquelas das proteínas em seu estado nativo (Ami, Natalello et al.
2006). Além disso, dados recentes indicam a presença de certa porcentagem de proteínas apresentando estruturas terciárias com conformação nativa em CI, fato de grande importância para a produção de proteínas recombinantes, pois sugere que as proteínas podem ser liberadas dos CI em um estado funcional, desde que se utilizem condições que desarranjem a rede de contatos intermoleculares sem desnaturarem as estruturas nativas que estão embebidas nestes agregados (de Groot and Ventura 2006). O fato de a atividade biológica das proteínas nos CI poder chegar a quase 100% possibilitou inclusive a utilização dessas proteínas estruturadas e biologicamente ativas como uma fonte adequada de enzimas para o uso direto em biocatálise (Tokatlidis, Dhurjati et al. 1991; Nahalka and Patoprsty 2009). A estratégia geral para recuperar proteínas nativas a partir de CI envolve três etapas: isolamento e lavagem dos CI, solubilização dos agregados proteicos e enovelamento das proteínas solubilizadas (figura 2). As células contendo os CI são geralmente rompidas através de uma combinação de métodos químicos, mecânicos e enzimáticos. A suspensão restante é então centrifugada para o isolamento das proteínas solúveis da fração insolúvel e alguns passos de lavagens são realizados para a remoção de proteínas de membrana e outros contaminantes dos CI. Uma variedade de métodos pode ser utilizada para a solubilização e renaturação dos CI, contudo não há um método universal para a renaturação de todas as proteínas. A renaturação de proteínas a partir de CI frequentemente requer um extensivo processo de tentativa e erro (Clark 2001).
