Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Prepare-se para as provas
Estude fácil! Tem muito documento disponível na Docsity
Prepare-se para as provas com trabalhos de outros alunos como você, aqui na Docsity
Os melhores documentos à venda: Trabalhos de alunos formados
Prepare-se com as videoaulas e exercícios resolvidos criados a partir da grade da sua Universidade
Responda perguntas de provas passadas e avalie sua preparação.
Ganhe pontos para baixar
Ganhe pontos ajudando outros esrudantes ou compre um plano Premium
Comunidade
Peça ajuda à comunidade e tire suas dúvidas relacionadas ao estudo
Descubra as melhores universidades em seu país de acordo com os usuários da Docsity
Guias grátis
Baixe gratuitamente nossos guias de estudo, métodos para diminuir a ansiedade, dicas de TCC preparadas pelos professores da Docsity
Um estudo sobre as funções do cálcio e sinalização purinérgica na modulação de proteases em diferentes espécies de plasmodium de roedor. O trabalho inclui experimentos ex vivo realizados em p. Berghei e p. Yoelii, que indicam importantes diferenças na resposta proteolítica ativada por cálcio entre as espécies. Além disso, o documento discute os efeitos de atp, adenosina, gtp e diferentes inhibidores de proteases em plasmodium.
O que você vai aprender
Tipologia: Notas de estudo
1 / 52
Esta página não é visível na pré-visualização
Não perca as partes importantes!
Tese apresentada ao Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Doutor em Ciências. Área de concentração: Biologia da Relação Patógeno-Hospedeiro Orientação: Profa. Dra. Célia Regina da Silva Garcia
Cruz, L.N. Estudos de fisiologia comparativa de modelos de malária em roedor. 2010 127 f. Tese (Doutorado em Ciências) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2010.
Malária é um dos principais problemas de saúde nos países em desenvolvimento. Causado pelo protozoário do gênero Plasmodium o mesmo induz atividade proteolítica durante o ciclo celular. Já o Ca2+^ é um sinalizador celular ubiquitário que parece regular a atividade proteolítica através de mudanças na concentração intracelular enquanto purinas atuam através de receptores purinérgicos e representam uma das mais antigas estratégias de sinalização de diferentes filos. Proteases são fundamentais para o desenvolvimento do Plasmodium, mas a função do Ca2+^ e da sinalização purinérgica ainda não foi totalmente compreendida. No presente trabalho foi investigada a função do Ca2+^ e da sinalização purinérgica na modulação proteolítica entre diferentes espécies de Plasmodium de roedor. Utilizando peptídeos com apagamento intracelular de fluorescência (FRET) verificamos a atividade proteolítica ativada por Ca2+^ liberado do retículo endoplasmático (ER) através de estímulo com tapsigargina (inibidor de SERA) ou de compartimentos ácidos com nigericina (trocador K+/H+^ ) ou monensina (trocador Na+/H+^ ). As diferentes classes de proteases foram investigadas com os inibidores PMSF, E64 e Pesptatina A e a importância do Ca2+^ verificada através do quelante de Ca2+^ intracelular (BAPTA/AM). Em experimentos ex vivo realizado em P. berghei e P. yoelii o Ca2+^ liberado do ER ativa a hidrólise dos peptídeos FRET, indicando importância do íon na modulação proteolítica observada, enquanto tratamento com BAPTA/AM seguido de tapsigargina eleva a ativação da hidrólise peptídica em P. yoelii, mas não em P. berghei. O efeito dos inibidores de protease também foi diferente entre as espécies estudadas. Pepstatina A e PMSF aumentam a resposta induzida por tapsigargina em P.berghei, mas diminuem em P. yoelii. Já o inibidor E64 diminui a proteólise em P. berghei, mas a estimula em P. yoelii. Os resultados indicam importantes diferenças na resposta proteolítica ativada por Ca2+^ entre as espécies de Plasmodium. Utilizando os peptídeos FRET foram também investigados os efeitos de ATP, adenosina e GTP extracelular na proteólise de malária de roedor. Observamos que ATP e adenosina ativam a proteólise sendo esta resposta inibida pela presença do quelante extracelular de Ca2+^ (EGTA) ou dos antagonistas suramina e PPADS em P. yoelii e P. berghei, respectivamente. Parasitas isolados e marcados com Fluo4-AM apresentam aumento de Ca2+^ citosólico após tratamento com ATP e adenosina, mas a presença do inibidor de P2X (TNP-ATP) não inibiu o aumento de Ca2+^ citosólico
Cruz, L.N. Comparative phisiological studies of rodent malaria models. 2010 127 p. Ph. D. Thesis (Parasitology) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, 2010.
Malaria is still a major health problem in developing countries. It is caused by the protist parasite Plasmodium, in which proteases are activated during the cell cycle. Ca2+^ is a ubiquitous signaling ion that appears to regulate protease activity through changes in its intracellular concentration while purines acts through purinoceptors and represent the most ancient signaling strategy among different phyla. Proteases are crucial to Plasmodium development, but the role of Ca2+^ and purinergic signaling in their activity is not fully understood. Here we investigate the role of Ca2+^ and purines in protease modulation among rodent Plasmodium species. Using fluorescence resonance energy transfer (FRET) peptides, we verified protease activity elicited by Ca2+^ from the endoplasmatic reticulum (ER) after stimulus with thapsigargin (SERCA inhibitor) and from acidic compartments by stimulation with nigericin (K+/H+^ exchanger) or monensin (Na+/H+^ exchanger). Classes of affected proteases were investigated with protease inhibitors PMSF, E64 and Pepstatin A after thapsigargin treatment. Intracellular Ca2+^ chelator (BAPTA/AM) was used to chelate intracellular Ca2+. In ex vivo measurements of protease activity in P. berghei and P. yoelii Ca2+^ released from the ER activated proteolysis of FRET peptides, indicating a fundamental role for calcium in modulating proteolysis. However parasite intracellular Ca2+^ chelator led to greater FRET activation in P. yoelii, but not in P. berghei. The effects of protease inhibitors on thapsgargin-induced proteolysis also differed between both species. Pepstatin A and PMSF increased thapsigargin-induced proteolysis in P.berghei, but decreased it in P. yoelii. Conversely, E64 reduced proteolysis in P. berghei but stimulated it in P.yoelii. The data points out key differences in proteolytic responses to calcium between species of Plasmodium. Using FRET peptides assay we also investigated the effects of extracellular ATP, adenosine and GTP on triggering proteolysis in rodent malária parasites. We analyzed the protease activity induced by ATP or adenosine and observed that activity is blocked when the same experiments were performed in the presence of the calcium chelator EGTA or the antagonists suramine or PPADS in P. yoelli and P. berghei, respectively. Isolated parasites loaded with Fluo4-AM and addition of ATP or adenosine in a calcium medium leads to an increase in cytosolic calcium but the presence of P2X inhibitor (TNP-ATP) did not impairs the cytosolic calcium rise triggered by ATP in P. yoelii. The data presented here lead us to conclude the purinergic receptor is involved in the ability of the parasite to activate intracellular proteolysis by sensing external signaling molecules.
The third part of the thesis established a model to analyze Plasmodium –host interaction thought Ca2+signaling pathways. It has been shown that cells transfected with InsP3R type II siRNA has a decrease in apoptosis level while PfRACK cause a reduction in cytossolic Ca2+. Here we propose that inhibition of apoptosis in infected hepatocytes occur thought interaction of the InsP3r type II receptor and PbRACK. To establish the knockout model we used liver and hepatocytes from wild type (WT) and knockout InsP 3 R2 (KO) mice for western blots, confocal immunofluorescence, and time-lapse confocal imaging of Ca2+. We verified that InsP 3 R2 is concentrated in the canalicular region of WT mice but absent in livers of InsP 3 R2 KO animals, while expression and localization of InsP 3 R1 was preserved, and InsP 3 R3 was absent from both WT and KO livers. Amplitude and rise time of Ca2+^ signals induced by either ATP or vasopressin were impaired in hepatocytes lacking InsP 3 R2. By using confocal microscopy and policlonal antibodies against Plasmodium Rack we have found the presence of PbRACK/PcRACK in the cytossol of early intraeritrocytic stages while at late squizonts the protein was found in close proximity with the erythrocyte membrane in P. berghei. Finally, the murine knockout model could be a useful tool to investigate Plasmodium-host interactions in Ca2+^ signal pathways.
Keywords: Malaria. Plasmodium berghei. Plasmodium yoelii. Protease activity. Calcium modulation.
Purinergic signaling. FRET.
1.1 Epidemiologia da malária
A malária é a mais importante infecção por protozoários no mundo causando entre 300 a 600 milhões de casos com mais de 1 milhão de mortes anualmente (SNOW et al. , 2005). A Organização Mundial de Saúde (2009) descreve a existência de 108 países endêmicos, 43 na região africana que comportou 89% dos casos de morte em 2008. Dos países africanos mais da metade dos casos se concentram na Nigéria, República Democrática do Congo, Etiópia, República da Tanzânia e Quênia. Entre os casos ocorridos fora da região africana os países mais afetados são Índia, Sudão, Myanmar, Bangladesh, Indonésia, Papua Nova Guiné e Paquistão (Figura 1).
Figura 1 - Mapa de distribuição e controle global de malária (OMS, 2009). Fonte: http://www.who.int/malária/publications/atoz/9789241563901/en/index.html No Brasil, a OMS descreve que no período de 2001-2007 mais de 350.000 casos foram reportados anualmente, sendo o número máximo em 2005, com mais de 600.000 casos. Em 2008 os casos foram reduzidos para
315.642 sendo 15% devido a infecção por P. falciparum (OMS, 2009) (Figura 2A). A transmissão ocorre principalmente na Região da Amazônia Legal (Acre, Amapá, Amazonas, Pará, Rondônia, Roraima, Tocantins, Mato Grosso e Maranhão) onde 10-15% da população está em risco (Figura 2B).
Figura 2 - Mapa de distribuição de malária (A); número de casos estimados de malária no Brasil (B) (OMS, 2009). Fonte:http://www.who.int/malária/publications/atoz/9789241563901/en/index.htm
O investimento financeiro do Governo do Brasil para o combate da doença foi crescente nos últimos anos e embora o apoio financeiro internacional seja crescente ainda é bastante baixo. A combinação atual de métodos indicados para combater a malária inclui redes tratadas com inseticida de ação prolongada, tratamento utilizando multi medicamentos para diminuir a seleção de parasitas resistentes a determinada droga, pulverização intradomiciliária com inseticida e tratamento preventivo intermitente na gravidez (OMS, 2009).
1.2 Combate à malária
Nos últimos cinquenta anos muitas pesquisas foram realizadas fomentando o desenvolvimento de drogas sintéticas antimaláricas, mas a incidência da doença ainda aumenta em determinadas áreas endêmicas. Tal fato ocorre devido a diversos fatores como mudanças climáticas globais que
parasitas podem então se movimentar na derme até encontrarem um vaso sanguíneo (AMINO et al. , 2006). Uma vez na corrente sanguínea, os esporozoítos invadem os hepatócitos e se desenvolvem para o estágio assexuado de merozoíto. Durante este período a infecção é assintomática e cada esporozoito sofre multiplicação assexuada formando 30.000 merozoítos (MOTA et al. , 2001; BANNISTER et al. , 2003). Estes entram novamente na corrente sanguínea, invadem os eritrócitos e amadurecem passando pelos estágios de anel, trofozoíto e esquizonte. Por um processo ainda desconhecido, alguns merozoítos não invadem os eritrócitos e se diferenciam em gametócitos, a forma infectante do mosquito (BANNISTER et al. , 2000; GARCIA et al. , 2001). Os gametócitos masculinos (microgametócito) e femininos (macrogametócito) são ingeridos pelo mosquito Anopheles durante a picada e se unem no trato digestivo do inseto para formar o zigoto. Ao se desenvolver, este se torna móvel (oocineto) e invade a parede do intestino médio formando o oocisto. O oocisto cresce e se rompe liberando esporozoítos que migram até a glândula salivar e serão transmitidos ao hospedeiro vertebrado (ENSERINK, 2000). Uma ilustração do ciclo do Plasmodium em humanos pode ser observada na figura 3.
Figura 3 - Ciclo de vida da malária em humanos Fonte: http://www.cdc.gov/malária/biology/life_cycle.htm. Durante o desenvolvimento intraeritrocítico, o parasita adquire formato mais globular e com alta taxa metabólica. Ocorre, então a síntese de novas proteínas exportadas para a membrana eritrocitária, dentre elas PfEMP ( Plasmodium falciparum erythrocyte membrane protein 1) em P. falciparum (MARTI et al. , 2004).
A função da PfEMP1 é promover o aumento da aderência dos eritrócitos infectados aos vasos sanguíneos retardando a passagem e eliminação dessas células pelo baço. Sabe-se que os parasitas da malária exportam proteínas além de sua membrana plasmática e modificam extensivamente o citosol e membrana plasmática do eritrócito. A natureza do mecanismo, em que o Plasmodium gradativamente altera a membrana plasmática eritrocitária e viabiliza tanto a passagem de nutrientes quanto a eliminação de metabólitos, ainda é uma área de conclusões controversas. O nome NPP ( New Permeation Pathways ) dado atualmente à tal mudança induzida pelo parasitismo reflete a incerteza de se tratar de uma via
Tabela 1 – Período do ciclo intraeritrocítico de diversas espécies de Plasmodium.
Parasita Hospedeiro vertebrado Período do ciclo intraeritrocítico P. knowlesi Primata 24 h P. cathemerium Pássaro 24 h P. vinckei Roedor 24 h P. chabaudi Roedor 24 h P. berghei Roedor 24 h P. yoelii Roedor 18 h P. gallinaceum Galinha 36 h P. falciparm Homem 48 h P. vivax Homem 48 h P. cynomolgi Primata 48 h P. coatneyi Primata 48 h P. maláriae Homem 72 h P. inui Pássaro 72 h P. brasilianum Primata 72 h Fonte: Garcia et al. (2001), adaptado com autorização.
Em 2000, foi proposto que o parasita da malária subverte o sistema endócrino do hospedeiro e utiliza o hormônio melatonina para sincronizar o ciclo celular (HOTTA et al. , 2000). Em infecções in vitro , P. chabaudi teve o número de células invadidas aumentado com o aumento da concentração de melatonina no meio. É conhecido que a ruptura dos eritrócitos infectados (e portanto sincronização na invasão de novas células) ocorre entre meia noite e 3 h da manhã (CAMBIE et al. , 1990) coincidindo com a secreção de melatonina nos vertebrados (KLEIN et al. , 1983). Bagnaresi et al. (2009) observaram que parasitas de roedores diferem em características relacionadas uma vez que os parasitas P. berghei e P. yoelii são menos sincrônicos do que P. chabaudi e não respondem ao hormônio melatonina (BAGNARESI et al ., 2009). A melatonina tem grande espectro de atuação (vertebrados, plantas e protozoários) podendo ser sintetizada em vários tecidos, porém sua síntese rítmica é confinada primariamente à retina e à glândula pineal. Este hormônio é
sintetizado a partir de serotonina, que está presente em grande quantidade na glândula pineal (SKENE et al. , 1991; DUBBELS et al. , 1995; HARDELAND et al. , 1995).
A conversão da serotonina para melatonina envolve duas enzimas (N- acetil transferase e hidroxindole-O-metiltransferase) (KLEIN et al. , 1983) sendo a melatonina e seu precursor N-acetilserotonina (NAS) liberados na corrente sanguínea (PANG et al. , 1980). O esquema de produção de melatonina em humanos pode ser observado na figura 4.
Figura 4 – Modelo da síntese de melatonina. Fonte: http://2001annualreport.nichd.nih.gov/ldn/sne.html.
Hotta et al. (2000) reportaram que, em Plasmodium , a melatonina é capaz de ativar a cascata da fosfolipase C que, por sua vez, ativa a via de Inositol 1,4,5-trifosfato (IP3) e libera Ca2+^ do retículo endoplasmático (ER), demonstrado na figura 5 (HOTTA et al. , 2000). Quando o ER é previamente
cascatas de reações através de segundos mensageiros e moléculas efetoras (KOYAMA et al. , 2009). A mais ampla família conhecida de receptores é a GPCR ( G-protein coupled receptors ) sendo o Ca2+^ e cAMP (adenosina monofosfato cíclico) importantes segundos mensageiros, promovendo diversas respostas intracelulares (KOYAMA et al. , 2009).
1.5 Homeostasia e sinalização por cálcio
Variações na concentração de cálcio intracelular exercem papel fundamental em muitos processos biológicos de células eucarióticas, como organização do citoesqueleto, divisão e diferenciação celular (BERRIDGE e IRVINE, 1984; CARAFOLI, 1987; PUTNEY e BIRD, 1993). Respostas rápidas são reguladas por aumento rápido e localizado de Ca2+, enquanto respostas lentas são controladas por transientes gerais repetitivos ou ondas intracelulares de cálcio como a exocitose, que ocorre em microsegundos, a transcrição de genes e a proliferação celular, que podem demorar de minutos a horas (BERRIDGE et al. , 2000; BERRIDGE et al. , 2003). O cálcio utilizado nestes processos pode ser derivado de compartimentos internos ou do meio externo. As células eucarióticas possuem mecanismos para manter a homeostasia de Ca2+. Estes mecanismos incluem uma bomba de cálcio na membrana plasmática, no retículo endoplasmático, além de trocadores em organelas intracelulares (PASSOS e GARCIA, 1997; GARCIA et al. , 1998).
Especificamente, para o parasita da malária foi demonstrada a existência de três compartimentos de Ca2+: o clássico retículo endoplasmático (GARCIA et al. , 1996; PASSOS e GARCIA, 1997; VAROTTI et al. , 2003), o compartimento ácido (GARCIA et al. , 1998; VAROTTI et al. , 2003) e a mitocôndria (GAZARINI e GARCIA, 2004). Sabe-se que, em Plasmodium falciparum , o Ca2+^ extracelular é indispensável no processo de invasão do eritrócito pelo parasita (MCCALLUM- DEIGHTON e HOLDER, 1992) e estudos fisiológicos mostram envolvimento da
sinalização de Ca2+^ no processo de maturação do parasita (HOTTA et al. , 2000; GAZARINI et al. , 2003). Como qualquer célula eucariótica, o citoplasma do eritrócito possui baixa concentração de cálcio (100 nM), sendo que o ambiente extracelular encontrado pela maior parte das células eucarióticas situa-se ao redor de 1 mM. A ausência de Ca2+^ extracelular é normalmente incompatível com as funções normais da célula e sua sobrevivência. Em 2003, foi proposto que a solução para este problema seria a invaginação que ocorre na membrana citoplasmática do eritrócito no momento da infecção. Neste momento ocorre a formação do vacúolo parasitóforo (VP) que inverte a polaridade da Ca2+^ ATP ase da membrana, bombeando ativamente Ca2+^ para o interior do VP e mantendo, deste modo, o ambiente de alta concentração de Ca2+^ necessário ao desenvolvimento do parasita. (GAZARINI et al. , 2003). Como pode ser observado em modelo esquemático da figura 6.
Figura 6 – Modelo esquemático da compartimentalização do cálcio em eritrócito de mamífero infectado com Plasmodium. Fonte: Gazarini et al. (2003), modificado com autorização_._
aminoácidos que seria o sinal codificador para exportar a proteína do parasita para o citosol do eritrócito (HILLER et al. , 2004; MARTI et al. , 2004). Várias proteases estão localizadas no vacúolo digestório que pode ser considerado um lisossomo especializado responsável pela degradação da hemoglobina. As moléculas de hemoglobina são retiradas do citosol do eritrócito e levadas para o vacúolo digestório (VD). Este vacúolo tem características de pH ácido e contém proteases (LANZER, 2007). Um dos aspectos fisiológicos importantes do Plasmodium é, portanto, a utilização de hemoglobina como fonte de aminoácido livre. Sua capacidade de síntese é limitada e a quantidade de aminoácido livre no eritrócito não é suficiente para as necessidades metabólicas do parasita (SCHEIBEL, 1988). O grupo heme, resultante da degradação da hemoglobina, é polimerizado formando os cristais de hemozoína.
Estudos de genes nocauteados para diversas proteases envolvidas na degradação da hemoglobina sugerem também que o parasita possa compensar parcialmente a clivagem da hemoglobina através de influxo de aminoácidos externos (LIU et al. , 2006). O Plasmodium falciparum digere até 80% da hemoglobina da célula hospedeira durante a fase intraeritrocítica do ciclo celular (LEW et al. , 2004). Proteases de diversas classes parecem estar envolvidas na digestão de hemoglobina no vacúolo digestório incluindo quatro proteases aspárticas (plasmepsina PfPM1, PfPM2, PfHAP e PfPM4), três cisteíno proteases (falcipaína PfFP2, PfFP2' e PfP3) e a metaloprotease falcilisina (BONILLA et al. , 2007). De todas as cisteíno proteases descritas no genoma, apenas as falcipaínas 1, 2, 3 foram isoladas e estão comprovadamente presentes na forma ativa no Plasmodium (ROSENTHAL, 2004). O gene das falcipaína 1 encontra-se no cromossomo 14, um pouco distante das demais falcipaínas (que se encontram no cromossomo 11), possui a sequência nucleotídica bem conservada nos genes de Plasmodium (ROSENTHAL, 2002) fazendo deste um alvo interessante para o
desenvolvimento de drogas nas quatro espécies de Plasmodium que infectam humanos (GLENN et al. , 2006). A falcipaína 1 presente nos estágios de anel e merozoíto (GREENBAUM et al. , 2002), relaciona-se à invasão eritrocitária, e o seu bloqueio, através de inibidores específicos, impede a invasão de novos eritrócitos do hospedeiro. Estudo realizado em parasitas que não expressam a falcipaína 1 demostrou que não há diferença em relação aos parasitas normais no que se refere à ruptura dos esquizontes, tempo de invasão dos eritrócitos pelos merozoítos, ou a multiplicação do parasita (EKSI et al. , 2004; SIJWALI et al. , 2004). As falcipaínas 2 e 2’ têm sequências quase idênticas (97,5% aminoácidos com identidade entre as proteases maduras) (SHENAI et al. ,
As funções da falcipaína 2 e 2’ podem ser parecidas mas são expressas de maneira diferente durante o ciclo eritrocítico, sendo que a disrupção do gene da falcipaína 2 não foi complementado pelo aumento da expressão da falcipaína 2’ (SIJWALI e ROSENTHAL, 2004). Parasitas nocautes para a falcipaína 2 apresentam alterações nos estágios inicias de desenvolvimento e lenta hidrólise de hemoglobina, enquanto parasitas nocautes para falcipaína 2’ não apresentam alterações. A falcipaína 3 possui sequência bastante similar a falcipaína 2 (domínio catalítico 68% idêntico) (SIJWALI et al. , 2001) e parece ter papel fundamental na hidrólise da hemoglobina pois as tentativas de nocautear a falcipaína 3 não funcionaram sugerindo função essencial desta protease no ciclo do parasita (SIJWALI et al. , 2006). Sugere-se que a falcipaína 2 e 3 sejam sintetizadas como proteínas integrais de membrana, levadas ao vacúolo digestório através da clássica via retículo endoplasmático/Golgi, e processada por auto-hidrólise (DAHL e ROSENTHAL, 2005; DASARADHI et al. , 2007). Em relação às proteases aspárticas, existem dez plasmepsinas no genoma de P. falciparum (plasmepsina 1-4, 5, 9 e 10) que são expressas nos estágios intraeritrocíticos. Destas, quatro são as proteases aspárticas mais
