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Rev. Fac. Med. vet. Zoatec. TJniv. S. Paulo 12:205-22, 1975
ESTUDO HISTOQUÍMICO DA LIPOFUSCINA CARDÍACA DO
HOMEM E DO CÃO EM RELAÇÃO À IDADE §
Roberto GRECCHI*
RFM V-A/
GRECCHI, R. — Estudo histoquímico da lipofuscina cardíaca do homem e do cão em relação à idade. Rev. Fac. Med. vet. Zootec. Univ. S. Paulo, 12: 205-22, 1975.
R e s u m o : O pigmento lipofuscina aparece no miocárdio humano aos 10 anos de idade e no de cães aos 18 meses. A maior concentração deste pigmento no coração de cães foi encontrada a partir dos 6 anos e independe, qualitativa e quantitativamente, de pro cessos patológicos. Do ponto de vista histoquímico a principal diferença observada está relacionada à reação P A S do pigmento que foi negativa em humanos acima de 60 anos de idade e positiva nas outras idades e em todos os diferentes grupos de cães examinados.
U n i t e r m o s : _Lipofuscina cardíaca; Cães; Lipofuscina, histoquímica._*
I N T R O D U Ç Ã O
As modificações morfo-fisiológicas que os sêres vivos apresentam com o decorrer do tempo, após seu completo desenvolvi mento, têm sido observadas" desde há longa data sem que tenham sido satisfatoria mente compreendidas. Estas progressivas modificações, que em seu conjunto consti tuem o envelhecimento, manifestam-se de maneira tão paulatina e imperceptível que só podem ser avaliadas ao final de longo período de tempo, deixando dúvidas, quanto ao seu caráter, se patológicas ou fisioló gicas. O desenvolvimento gradual e lento destas modificações é fator limitante para seu estudo em condições experimentais e, conseqüentemente, para a melhor com preensão do fenômeno.
Diferenças entre um organismo jovem e outro senil estão estabelecidas. Uma delas é a presença de pigmento em células de animais idosos, sendo esta mais evidente e constante em células do tecido nervoso e do muscular cardíaco. Este pigmento, co nhecido de há longa data e relacionado sempre ao fator idade, recebeu várias de nominações, tendo perdurado as de “pig mento de uso”, “pigmento de desgaste” e “pigmento senil”. Assim, o estudo de sua natureza química, bem como de suas va riações morfológicas e histoquímicas, re- veste-se de importância por refletir parte de fenômeno mais geral e complexo que é o envelhecimento.
5 Tese apresentada à Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da U .S .P. para obtenção do título de Doutor.
- Professor Assistente Doutor. Departamento de Patologia e Clínica Médicas da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootec nia da U .S .P.
GRECCHI, R. — Estudo histoquímico da lipofuscina cardíaca do homem e do cão em relação & idade. Rev. Fac. Med. vet. Zootee. Univ. S. Paulo, 12:205-22, 1975.
Andrew1 (1962) menciona que alguns es tudiosos do assunto aplicam o termo en velhecimento à soma total das alterações que ocorrem na substância viva de um or ganismo no curso de uma geração, isto é, da fecundação até a morte natural. Aceita este conceito mais geral, porém, prefere a idéia um tanto artificial de que o en velhecimento indica as mudanças que ocor rem após ter sido atingido o ápice das ati vidades vitais, principalmente a reprodu tora.
Para Vest55 (1943) a senescência é fisio- lógicamente inevitável, inerente à própria célula e se constitue no tipo mais genérico de involução vital. Mayer?8 (1949) afirma que o envelhecimento é o resultado do des vio da síntese de proteínas para a síntese de gorduras, sem que haja deficiência me tabólica.
Fazendo uma breve análise das teorias, Curtis» 9 (1963) defende a “teoria da mu tação somática” segundo a qual as células de um organismo acumulariam gradual mente genes deletérios, por mutações, que levariam as células à perda paulatina de suas funções mais especializadas. Esta teoria apoia-se na observação de que ani mais irradiados envelhecem mais rapida mente9. Intimamente relacionada a esta teoria está a da “crosslinkage” (interli gação), pela qual as macromoléculas, entre elas as do DNA, se interligariam ocasio nando as mutações gênicas. Nas moléculas de estromas teciduais teríamos, também, alterações como, por exemplo, a perda de elasticidade observada no tecido conjuntivo de indivíduos senis4.
Desde há muito são descritas nas células nervosas ganglionares do homem, modifi cações morfológicas que acompanham o envelhecimento, representadas por limites celulares borrados, núcleos pobres em cro- matina, desaparecimento do núcleo, além de acúmulo de grânulos citoplasmáticos de natureza lipóide21. Já há longa data, de pósitos lipóides foram também descritos nas células de Purkinge do cerebelo e cé lulas piramidais do cérebro em cães se-
No miocárdio senil, foram também des critas alterações na relação número de nú cleos/número de fibras. Esta relação é maior na criança do que a encontrada no adulto e no indivíduo senil52. Dogliotti1 1 (1930) descreveu tendência à hipertrofia das fibras cardíacas na senilidade. Segun
do este autor, ainda, na senilidade extrema estas fibras apresentam-se atróficas.
A presença de um cromolipóide, comu- mente denominado de lipofuscina, encon trado com maior constância no tecido ner voso e no muscular cardíado é admitida, pela quase totalidade dos autores interes sados no assunto, como intimamente rela cionada ao envelhecimento10’46’
A maior constância com que este pig mento aparece no tecido nervoso e cardíaco seria devido à incapacidade que têm as cé lulas destes tecidos de se renovarem. Esta condição poderia ser considerada como um marcador do envelhecimento, já que estes tecidos podem ser considerados tão velhos quanto o indivíduo40.
Assim, da simples constatação da pre sença do pigmento nos tecidos de animais senis, os autores contemporâneos passaram a se preocupar em determinar as relações entre a taxa de deposição do mesmo e a idade do indivíduo. Entre esses autores podemos citar Jayne24 (1950) que, utili zando-se da propriedade da álcool-ácido resistência do pigmento, observou que a quantidade deste aumenta progressivamen te no miocárdio humano, entre a 2.a e a 6.a décadas de vida. Trabalhando também com miocárdio humano, porém utilizando- -se da autofluorescência do pigmento à luz ultravioleta, Strehler, Mark, Mildvan & G e e 53 (1959) confirmam os achados de Jayne24 e concluem que a concentração média do pigmento aumenta linearmente a uma taxa aproximada de 0,33% do vo lume cardíaco, por década de idade. Munnel & G e t t y 4 0 (1968), usando a mesma metodologia de Strehler e colí3, em mio cárdio de cães, constataram a presença do pigmento somente em animais de idade superior a 6 meses. Demonstraram ainda que a concentração do mesmo, a partir dos 3 anos e meio, aumenta linearmente à taxa de 0,36% do volume de miocárdio por ano. Samorajski, Ordy & Rady-Rei- mer50 (1968) verificaram que a porcenta gem de células pigmentadas do gân glio nervoso dorsal do camundongo au menta de 15 a 92%, dos 4 aos 30 meses de idade e, nas células de Purkinge do cerebelo, aumenta de 25 a 88% naquele mesmo período. Estes dados sugerem cla ramente, portanto, que a quantidade de pigmento aumenta com a idade do tecido.
Segundo Hueck23 (1912), Borst foi quem introduziu o termo lipofuscina na lingua
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borar um esquema evolucionário com con
dições de explicar algumas divergências
de resultados obtidos por vários autores
que estudaram os cromolipóides. Assim,
Pearse é de opinião que lipóides, de início
sem cor, iriam se oxidando, tornando-se
insolúveis e perdendo a capacidade de ab
sorver corantes de gorduras. Estabelecer-
-se-ia ainda, o aumento paulatino de gru
pos redutores e de grupos ácidos, bem como
o desenvolvimento de cor. A reação do PAS
seria positiva somente nos estágios inter
mediários de evolução do pigmento. O pro
duto final desse processo auto-oxidativo
seria o pigmento lipofuscínico, fortemente
basófilo, ativamente autofluorescente e re
dutor de soluções argênticas e de ferricia-
neto. Em um estágio intermediário entre
os lipóides e a lipofuscina, Pearse localiza
o ceróide ou lipofuscina tipo ceróide. En
tretanto os limites entre estas várias eta
pas da evolução de um lipóide para um
cromolipóide não foram ainda exatamente
determinados.
Nas fibras musculares cardíacas a lipo
fuscina foi sempre descrita em espaços
claros, livres de miofibrilas, junto aos poios
dos núcleos 7,24. Em miocárdio humano, a
lipofuscina apresenta-se sob a forma de
grânulos ovóides de coloração amarelo-
-acastanhada.
Desde longa data, sabe-se da natureza
lipídica da lipofuscina e os lípides se
gundo a maioria dos autores, encontram-
-se formando complexo glicolipoprotéico ou
lipoprotéico26. Na lipofuscina cardíaca da
espécie humana, foi encontrada atividade
de peroxidases e de fosfatase ácida16. Em
grânulos pigmentares isolados de miocár
dio humano, Hendley, Mildvan, Reporter &
Strehler20 verificaram que a atividade da
fosfatase ácida, da citocromo-oxidase e da
catepsina eram relativamente baixas. Em
coração de bovino, Bjorkerud & Cummins
também encontraram a citocromo-oxida-se
muito pouco ativa em grânulos isolados.
Em lipofuscinas do tecido nervoso do ho
mem, rato, gato, cobaia e camundongo, foi
detectada atividade da catepsina (tipo C ) ,
esterase ácida e da deoxirribonuclease
ácida26_27j.
A maioria dos autores admite a forma
ção da lipofuscina, bem como a de outros
cromolipóides, a partir de lípides insatu-
rados que se oxidam e se polimerizam 2.30>41.
Para alguns, como Barka & Anderson2,
o início do processo de formação dos grâ
nulos de pigmento teria lugar no interior
de lisossomos. Com o aumento da quanti
dade do material corado, o lisossomo poste-
rirmente desapareceria como tal e, no grâ
nulo de lipofuscina, restariam alguns res
quícios que poderiam justificar certas pro
priedades físico-químicas comuns ao lisos
somo e aos grânulos de pigmento. Esta
relação entre lisossomo e grânulo de lipo
fuscina é aceita pela maioria dos auto
res 15,26,49 com base nas semelhanças his-
toquímicas e ultra-estruturais apresenta
das.
Tanto o mitocôndrio12 como o complexo
de Golgi5 foram relacionados com a gê
nese das lipofuscinas, prevalecendo contu
do, na atualidade, a idéia de que seria o
lissossomo a organela mais diretamente re
lacionada com o processo.
Como se depreende dos dados da litera
tura, são escassas as informações concer
nentes à propriedades histoquímicas bási
cas da lipofuscina cardíaca, bem como de
suas diferenças entre espécies.
MATERIAL E MÉTODOS
O material do presente estudo constou
de fragmentos de músculos cardíaco das
espécies humana e canina. O da espécie
humana foi representado por nove frag
mentos de miocárdio, incluídos em blocos
de parafina segundo a técnica histológica
usual, após fixação pelo formol neutro a
10%. * Os fragmentos foram obtidos em
autópsias realizadas e registradas no Ser
viço de Anatomia Patológica do Hospital
“ Emilio Ribas” sob os números: 5/67;
86/68; e 90/68. Alguns dados deste mate
rial encontram-se na tabela I. Estes nove
casos constituíram amostras de três gru
pos etários.
O material da espécie canina constou de
fragmentos de músculo cardíaco de 100
cães enviados à Disciplina de Anatomia
Patológica pelas Disciplinas de Patologia
e Clínica Médicas, Patologia e Clínicas Ci
rúrgicas e Obstétrica, pelo Ambulatório da
- Este material foi gentilmente cedido pelo Prof. Dr. Thales de Brito.
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Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo e, ainda, por clínicas particulares, com a indicação de eutanásia. Foram selecionados os animais cuja idade correta era informada diretamente pelo proprietário. Durante a necropsia, iniciada logo após a morte por choque elétrico, ao se examinar o coração e não se verificar nenhuma lesão macros cópica aparente, recolhiam-se vários frag mentos de 0,5cm de espessura, retirados por duas incisões paralelas, perpendicula res ao epicárdio, abrangendo também o en- docárdio. Os locais de escolha para a re tirada dos fragmentos foram as paredes dos ventrículos direito e esquerdo. O ma terial assim obtido foi fixado em formol neutro a 10%. Após inclusão em parafina, foram feitos cortes de 5 micros de espes sura, segundo a técnica histológica usual.
Além daqueles 100 casos cuja fixação foi feita em formol neutro a 10%, alguns outros receberam fixação diferente, de acordo com a finalidade de estudo a que se destinavam. Assim, fragmentos de mio- cárdio de um cão de 12 anos foram fixa dos em formol cálcio de Baker a 4°C, por 24 horas, para o estudo de lípides e para a pesquisa de fosfatase ácida. Outros fragmentos foram fixados em líquido de Gendre para a pesquisa de glicogênio e no líquido de Camoy para a pesquisa de ácido ribonucléico.
Na tabela II encontram-se os dados re lativos ao material da fespécie canina (ida de, sexo e raça), bem como o número de registro na Disciplina de Anatomia Pato lógica da Faculdade de Medicina Veteri nária e Zootecnia da Universidade de São Paulo.
Para realização dos testes histoquímicos foram escolhidos, ao acaso, 3 animais de cada grupo etário num total de 24 casos.
Os métodos indicados na tabela III ob servam, em sua maioria, as indicações dadas por Lison32 (1960), Lillie30 (1965), Pearse^i (1961) e McManus & Mowry (1965) e foram utilizados por vários auto res para o estudo histoquímico de pigmen tos em tecidos animais. Entre nós pode mos citar Sasso, Castro & Pacheco (1958), Katchburian, Sasso & Delia Ser
r a 25 (1961), M o r a i s 39 (1964), Villa
(1964), Grecchi, Mariano, Saliba & Zezza (1966), Mariano37 (1968), Grecchi18 (1969) e Tokumaru & Ferri54 (1970).
Além daqueles métodos, em alguns casos da nossa série de cães, foram feitos: o método do azul de alcian (Alcian blue) para mucòsubstâncias ácidas, conforme Lison32o método de Gomori para fosfatase ácida, modificado por Holt2; a impreg nação argêntica, segundo Polak43 e a he- matoxilina fosfotungstica de Mallory para mitocondrios e o método da galocianima 13 para RNA. O método de Elftmann, para lípides 30 foi efetuado em fragmentos de miocárdio de 6 cães: 3 de idade inferior a 1 ano e 3 de idade superior a 10 anos.
Para avaliação e comparação do dife rente teor de pigmento encontrado em nossos casos, valemo-nos, nas lâminas co radas pelo método de Hueck, de um cri tério subjetivo atribuindo ao teor máximo o sinal + + + (foto n.° 1), ao teor médio
- (foto n.° 2) e ao teor mínimo -I- (foto n.° 3). À ausência do pigmento correspon deu o sinal —.
R E S U L T A D O S
Os cortes histológicos do material do presente estudo, após coloração pela he- matoxilina-eosina, não revelaram, além do pigmento em estudo, alterações patológicas no tecido miocárdico, quer no estroma, quer nas fibras musculares que apresentavam estriação evidente. Junto aos poios dos núcleos dessas fibras havia espaço, no in terior dos quais puderam ser vistos grâ nulos de cor castanho-clara, principalmente no material proveniente de cães mais ido sos e de cor castanha no proveniente de miocárdio humano.
Como pode ser visto na tabela II a pre sença do pigmento foi detectada, pelo mé todo de Hueck, no miocárdio de um em 3 cães examinados de idade igual a 18 meses. De 6 animais com 2 anos, 3 não tinham pigmento nas fibras musculares cardíacas e, a partir dessa idade, todos os animais apresentaram pigmento. No material hu mano apenas os 2 casos de menor idade, não apresentaram pigmento por este mé todo (Tabela I).
Quanto à solubilidade, o pigmento de ambas as espécies, revelou-se insolúvel no éter, clorofórmio, acetona, piridina, ácidos e álcalis. Foi considerado insolúvel também em água, álcool e xilol, posto que, foi uti lizada a inclusão em parafina para a fei tura dos cortes histológicos.
GRECCHI, R. — Estudo histoquimico da lipofuscina cardíaca do homem e do cão em relação à idade. Rev. Fac. Med. vet. Zootec. Univ. S. Paulo, 12:206-22, 1975.
D I S C U S S Ã O
Connor7, em 1928, descreveu a lipofus cina cardíaca com um pigmento granular, cuja cor variava do amarelo ao acastanha do, localizado em cada polo do núcleo nas preparações não coradas e, que se apresen tava em verde quando corado pelo azul- -do-Nilo. Citava, ainda, este autor, que o pigmento se escurecia sob a ação do ni trato de prata após tratamento prolonga do, era insolúvel nos solventes das gor duras, alguns grânulos davam reação para o ferro e grande parte destes corava-se em vermelho intenso pela fucsina básica. Estas passaram a ser, em termos, as caracterís ticas clássicas do lipopigmento cardíaco. A. exceção da positividade à reação do ferro, nossos dados concordam com os que men cionou. Infelizmente Connor não porme norizou em que local ocorreu esta reação.
Tendo em vista o que relata a literatura, a cor natural do pigmento por nós encon trado, em miocárdio humanos e de cães, não apresentou diferença a assinalar, sendo ela aceita como amarelo-acastanhada.
Quanto ao descoramento em oxidante e à solubilidade em lipossolventes também não encontramos diferenças significativas entre nossos achados e os mencionados por outros autores.
A autofluorescência do pigmento à luz ultravioleta se apresentou, em todos os nossos casos, de cor alaranjada, fato que concorda com os achados de Munnel & Getty40, Reichel46 e de Strehler, Mark, Mildvan & Gee53. Autofluorescência de outras cores para a lipofuscina é mencio nada na literatura. Assim, por exemplo, é citada autofluorescência de coloração vermelha ou amarelo-acastanhada32 ou, ainda, vermelho-acastanhada30 41 Per- cebe-se, entretanto, que estas variações de cor são mínimas e provavelmente, decor rentes de fatores pessoais de observação. A análise exata da cor da autofluorescência do pigmento em estudo dependeria de téc nicas aprimoradas, contudo ficou evidente, em nosso material, a semelhança daquela observada no homem e no cão.
T A B E L A I
Espécie humana, segundo grupo etário, sexo, cor, idade e teor de lipofuscina no miocárdio.
Grupo etário
Reg. Necroscópico *
Sexo Cor Idade Teor do pigmento
I 90/68^ masculino^ branca^ 2 a 5 m (2 a 5 m-10 a) 65/68 feminino parda^ 4 a^ — 66/67 masculino branca 10 a (^) +
II 86/68^ masculino^ parda^ 20 a^ + + (20-28 a) 32/68 masculino parda 22 a + + 70/67 masculino^ preta^ 28 a^ + +
III 6/67 feminino branca^ 60 a^ + + + (60 a-64 a) 80/68^ masculino^ branca^ 63 a^ + + + 29/67 feminino branca 64 a (^) + + +
OBS.: — = nulo a = anos
- Registro necroscópico do Serviço de Anatomia Patológica do Hospital de Isolamento “ Emílio Ribas” da Secretaria de Saúde Pública do Estado de São Paulo.
to H* to
T A B E L A II
E spécie oanina segundo grupo e t á r io , s e x o , ra ça e t e o r de lip o fu s o in a no m io ca rd io. ( M etod o de H ueck )
Gr -"do I (0 )----^ 2a)^ Grupo^ I I^ (2 f—^ lj.a)^ Grupo V^ (8 |-----^ 10a)^ Grupo 71 I I
(1Ua 1------ )
Casos Raça^ Sexo^ Idade^ Tçor■pigmente^ dp Casos^ Raça^ Sexe^ Idade^ Teorpigmento^ do Casos^ Raça^ Sexo^ Idade^
Teor do pigmento Casos^ Raça^ Sexc^
Idade Teor dopijm enic
8728 9092 9097 A 9097 s 9097 c 196 63ÍJÓ 9025 9022 8391
Pastor Rsquin. 3RD. SRD 3RD 3RD SRD SRD 3RD
M. F. M. M. F. F. M. F, F.
Rn 21 a h5 d h h5 à 2 m I 4. m I 4. m
8214 8507 &7ho 8979 9015 9150 8332 8350 8508
SRD Cocker Bast or SRD SRD Pequin SRD Pequin Pastor
M. M. F, M. F. M. F. M. M.
2 a 2 a 2 a 2 a 2 a 2 a 2 a 3 n 3 a 3 a
♦
++
822^ 8310 89( 9067 85 OO 8991 9009 9165
SRÍ) SRD Basset Boxer SRD Pointer SRD Poodle
M. M. F, M. M. F. F. F.
6 a 8 a 8 a 8 a 9 a 9 a 9 a 9 a
+++ +++ ++ +++ +++ ++ +++ +++
8202 8378 3671 8712* 9008 9082+ 9167 820Í+ 8229 8324 .O
SRD SRD SRD Pastor Boxer SRD SRD SRD SRD
F. F. F. H. M. M. M. F. M.
14 a 12+ a 1 2+ a 12+ a 1 2+ a 1 2+ a 1 2+ a 15 a 15 a 15 » 15 a 16 a l6 a
+++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
SRD M. 6 m^ -^8820 Dalmaia F.^3 a^ +^ Grupo VI^ (10|------12a)^ SRD SRD SRD
M.
8983' 8381
SRD SRD
M. F.
6 m 7 m
8978 9lh
Chiuaua SRD
F. M.
3 a 3 a
SRD Pequin.
M. F.
10 a 10 a
++ +++ (^8203) 828^
F. F.
+++ +++ 8773 9039 89Ó3, 8970 8977 3351
Pequin, 7 m (^) m (^) Gruno m 2 + __ — ôa) 8955 SRD M. 10 a +++ 83U9 SRD^ F.^16 a^ -M-+ Pecji in. SRD 3RD SRD
E. M. F. F.
f m 8 m 8 m 8 m 9 m
8578 9030 8506 8 W 1
SRD SRD SRD SRD
E. F. F. F.
4 a 4 a lj.a6m 5 a
+-f ++ +++
8953 907 ** 9088 9116
3RD Poodle SRD Pequin
M. M. M. F.
10 a 10 a 10 a 10 a
++ +++ +++ +++
9071 9072 9158A 83U 9052 9019
Fox Basset SRD SRD SRD
F. F* F. F. M.
16 a l6 a 16 a 17 a 17 a
+++ +++
+++ ++♦ 8326 8377
SRD SRD
M. M.
12 m 12 ra 12 m 12 m 18 m 18 m 18 m
“ (^) Grupo 1 7 (c 1 — 8a) (^) Grupo V II (12|----- lj+a) SRD F. 1 8 a +++ 8287 Pastor^ E.^6 a^ ++^ Pas1 12 a 12 a 12 a 12 a 12 a
9158 SRD^ F.^22 aj^ +++ 89U; 8U 8Q6b Q9k
SRD SBC SRD SRD
F. F. F. F. +
81* 81* 8796 9159 8329
SRD SRD SRD Pastor SRD
E. E. E. F. F.
6 a 6 a 6 a 6 a 7 a
+++ +++ ++ +++ ++
8602 8771 8839 8987 9157 8337 8393 8552 8ÿi 905U
SRD SRD SRD SRD SRD
F. F. M. F. E.
++ ++ +++ +++ +++
Obs. î SRD ■^ sem ,raça^ d e fin id a Rn ■ recem -nasoido 11 ■ m asculino F * fem inin o
- Numero de r e g is t r o na D is o ip li na de Anatomia Ifcto lo g io a da Fao«Med.Vet• e Z ooteon ia da U .S .P.
9923 8986 9029 9032 901* 9031
SRD Pastor Poodle Pequin SRD SRD
F. M. M. F. F. F.
7 a 7 a 7 a 7 a 7 a 7a6m
++ ++ ++ +++ ♦++ +++
SRD 3RD SRD SRD SRD
M. F. M. F. E.
13 a 13 a 13 a 13 a 13a5m
+++ +++ +-M- +++ -M-+
m • meses a - anos
- • minimo +♦ * medio +++ - maximo
P'
GRECCHI,
R. — Estudo
histoquímico
da lipofuscina
cardíaca
do hom em
e do cã o em
relação
idade.
Rev.
Fac.
Med.
vet.
Zootee.
Univ.
S. Paulo,
12:205-22,
GRECCHI, R. — Estudo histoquím ico,da lipofuscina cardíaca do homem e do cão em relação à idade. Rev. Fac. Med. vet. Zootec. Univ. S. Paulo , 12:205-22, 1975.
T A B E L A I V
Grupo etário (cão) segundo a porcentagem de casos de acordo com o teor do pigmento.
\ Teor do \ pigmento
GrupoV etário
Grupo I 96,0 4,0 0,0 0,
Grupo II 25,0 66,6 8,3 0,
Grupo III 0,0^ 26,0^ 50,0^ 25,
Grupo IV 0,0 16,6^333 50,
Grupo V 0,0 12,5 12,5^ 75,
Grupo VI 0,0 0,0 28,5 71,
Grupo VII 0,0 0,0 36,3 63,
Grupo VIII 0 fi 0,0 0,0 100,
T A B E L A V
Grupo etário (homem) segundo a porcentagem de casos de acordo com o teor do pigmento.
\ Teor do \ pigmento
Grupo
etário N.
Grupo I 66,6 33,3 0,0 0,
Grupo II 0,0 0,0 100,0 0,
Grupo III 0,0 0,0 0,0 100,
OBS.: — = nulo
A extinção da autofluorescência pelo tra tamento prévio dos cortes pelo perman- ganato, teste proposto por BTenner6e que, segundo Lison32, caracteriza o ceróide, foi por nós obtida, tanto para o homem como para o cão. Infelizmente não encontramos referência a este fato em miocárdio na li teratura compulsada. Mariano3 7 a mencio na em células nervosas de cães senis.
A basofilia dos lipopigmentos foi sempre posta em evidência pela maioria dos au tores tratadistas, não sendo contudo deter minada a natureza do fenômeno. N a opi nião de Lison3? esta basofilia é devida à presença de grupamentos oxiácidos na com posição química do pigmento. Para os cro- molipóides e lípides oxidados, este autor aponta basofilia até pH ao redor de 2,5 a 3,0 e, especificamente para lipofuscinas, sem mencionar a origem, afirm a que a ba sofilia, às vezes, é muito intensa. Mariano estudando um cromolipóide de células ner vosas de cães encontrou basofilia até pH 3,4 enquanto que Cordes & Mosher8, na mesma espécie, na musculatura lisa do in testino, não encontraram basofilia em pH 3,5. Pearse41 assinala que a basofilia é fra ca para “ lipocromo” cardíaco. Em nosso material, quer da espécie humana quer da canina, a basofilia foi evidenciada em pH 5,6 extinguindo-se em pH mais baixo.
Enquanto que para a identificação do ceróide, na opinião de L ison 3 2 , a álcool- -ácido-resistência é o método de escolha, já para o pigmento do miocárdio não tem a mesma utilidade pois, é um teste que se apresenta com resultados variáveis. Pear s e 41 assinala que o “ lipocromo” cardíaco é usualmente positivo para este teste e que, em um mesmo corte histológico, en contramos grânulos positivos e outros ne gativos. Cordes & M osher8 mencionam que o pigmento em miocárdio de cães apresenta fraca afinidade tintorial frente a este teste de álcool-ácido-resistência. E m todos os casos do nosso material de estudo, que tinham pigmento, este sempre apresentou álcool-ácido-resistência.
O teste da redução do ferricianeto fér- rico, que Schmorl utilizou para a eviden- ciação da lipofuscina e que muitos auto res 32,41 mencionam como negativo para o ceróide, em nosso estudo, se apresentou positivo nos grânulos menores e negativo nos maiores na espécie humana e, nos cães, sempre foi negativo. Resultados va riáveis foram encontrados, no miocárdio e em outros órgãos, por diversos autores. A ssim , Lillie30 menciona que, para a lipo-
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fuscina cardíaca, a redução do ferricianeto é observada em alguns mas não em todos os casos; Pearse41 assinala que a reação de Schmorl no “lipocromo” cardíaco vai de fracamente positiva à negativa. Em cães, Cordes & M o sh e r8 a citam como positiva para o pigmento cardíaco e também para o ceróide de um tumor de mama, e, Ma- riano37 como negativa para o cromolipóide que estudou em neurônios de cão. Sem mencionar a localização, Barka & Anderson citam para as lipofuscinas positividade na reação de Schmorl e, ainda, redução de sais de prata.
A capacidade redutora do lipopigmento cardíaco manifesta-se, também, quando se utilizam métodos que têm por princípio a redução da prata amoniacal. Entretanto esta redução é somente vista, segundo Lillie30, em pequena porção dos grânulos. Para Pearse41, o “lipocromo” cardíaco não reduz a prata alcalina. Cordes & MosherS, que utilizaram a reação argentafim de Fon- tana-Masson em corações de cães, encon traram resultados positivos. Para nós, em todos os casos, tanto a reação argentafim de Masson como a de Lillie, foram positi vas.
Quanto às reações do PAS, PFAS e PAAS, os achados que os diversos auto res mencionam variam muito. Assim, para Lison32, referindo-se aos cromolipóides em geral, o PAS e o PAAS podem ser ora positivos, ora negativo. Para Barka & An derson2, as lipofuscinas, em geral, dão um PFAS francamente positivo e Pearse41 cita o PAS como usualmente* positivo. No caso específico do pigmento cardíaco, Pearse menciona como negativo o PAS e como positivo o PFAS; Cordes & MasherS citam para o miocárdio do cão um PAS positivo. Picard, Chambost & Vitry42, ainda em miocárdio de cão, assinalam a reação do PAS como de inconstante a positiva. Em nosso material, encontramos para o homem o PAS negativo para as idades igual e superiores a 60 anos, bem como negativos foram também os métodos do PFAS e PAAS em todas as idades. Para os cães o PAS sempre foi positivo e o PFAS e PAAS negativos.
Afora os testes mencionados e discuti dos acima, o pigmento considerado em nosso estudo, em ambas as espécies, evi- denciou-se com resultados positivos naque les métodos que caracterizam os lipopig- mentos. Assim, foi positivo para os co rantes de gorduras como o Negro-Sudão B, Negro Sudão B após ação de solventes
e após ação de oxidantes; e ao sulfato de azul-do-Nilo pelo método de Hueck. Foi positivo também ao método de Mallory, originalmente descrito para hemofuscina mas que é positivo para os cromolipóides e ao método alternativo de Lillie para li pofuscinas.
Revelou-se negativo nosso material para os outros testes da sistemática proposta por Sasso, Castro e Pacheco51 que eviden ciaram pigmentos de outros grupos que não os do cromolipóides. Assim, foi ne gativo ao teste do ácido sulfúrico concen trado que caracteriza os carotenóides, ao método de Lillie para melaninas, aos méto dos de Perls, de Stein e de Kutlik que caracterizam os pigmentos derivados da hemoglobina e ao teste de Verocay.
Quanto à natureza e constituição dos grânulos, os testes efetuados em nosso ma terial nos permitem concluir que o pig mento em estudo, tanto no homem como no cão, apresenta componentes lipídicos mo dificados, pelo fato de se corarem por co rantes para gorduras, apresentarem cor a serem insolúveis em grande número de sol ventes. Há, possivelmente, a presença de grupamentos vic-glicóis ou afins como atesta a reação de PAS após ação da amilase. Possuem, ainda, o pigmento, grupos redu tores revelados pela reação de Schmorl em alguns casos e, na totalidade dos casos pelas reações argentafins.
Dado as contradições ressaltadas na li teratura somos levados a não aceitar como absoluto nenhum teste para a distinção entre ceróide e lipofuscina. Talvez novos estu dos sistemáticos possam estabelecer outros critérios para distingui-los. É nossa opi nião que deva prevalecer no miocárdio a denominação de lipofuscina por ser a mais antiga e, praticamente, consagrada pelos autores.
Na tentativa de se conseguir novos dados para detectar outros componentes no pig mento, empregamos, em miocárdio de cães, vários métodos além daqueles da sistemá tica acima mencionada. Assim, foi reali zado o método do azul-de-alcian para mu- cosubstâncias ácidas e o teste da galocia- nina para ácido ribonucléico. Os resulta dos foram entretanto negativos.
Preocupou-nos, também, determinar o conteúdo do espaço claro junto aos poios dos núcleos além dos grânulos de pigmen to. Assim, pelo método do PAS, em ma terial fixado pelo líquido de Gendre, veri ficamos que não há hidratos de carbono
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existem os peróxidos e os radicais livres de curta duração14, que se formam nos pro cessos metabólicos celulares. Os peróxidos foram evidenciados por diferentes autores nos grânulos pigmentares16. Necessaria mente não há injúria ou lesão celular e esta modificação de estrutura físico-química aparece única e exclusivamente pelo maior tempo de exposição à ação de agentes “crosslinkers” e de radicais livres. Este fato explica, também, porque este pig mento é característico de células que não se renovam, como exemplo, as musculares e as nervosas, ensejando assim, seu acúmu lo com o tempo.
C O N C L U S Õ E S
l.a — O pigmento encontrado junto aos núcleos das fibras musculares cardíacas do homem e do cão, enquadra-se na categoria de cromolipóide, segundo a classificação de Lison.
2.a — À luz dos resultados de nossos testes histoquímicos, não é possível estabe lecer-se a distinção entre ceróide e lipo fuscina em miocárdio do homem e do cão.
3.a — Os resultados dos métodos histo químicos efetuados em pigmento miocárdi- co da espécie canina, mantêm-se constantes em todas as idades do animal, ao passo que, no do miocárdio de humanos de idade superior a sessenta anos a reação do PAS apresenta-se negativa.
4.a — No cão, a quantidade máxima de cromolipóide cardíaco pode ser atingida dos seis aos oito anos de idade.
5.a — O cromolipóide cardíaco, no ma terial de nosso estudo, no cão pôde ser evidenciado aos 18 meses e no homem aos 10 anos de idade e aumentou progressiva mente com a mesma.
6.a — No cão, o cromolipóide cardíaco independente, qualitativa e quantitativa mente, do estado de saúde clínica do ani mal.
Fotomicrografia n.J 1 — Lipofuscina em miocárdio de cão com Z'£ anos de idade. Os grânulos de pigmento, junto aos núcleos, apresentam-se corados intensamente em azul. Quantidade avaliada em ***. Método de Hueck. Aumento de aproximadamente 470 X.
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Fotomicrografia n.° 2 — Lipofuscina em miocárdio de cão com 5 anos de idade. Os grânulos de pigmento, junto aos núcleos, apresentam-se corados intensamente em azul. Quantidade avaliada em * *. Método de Hueck. Aumento de aproximadamente 470 X.
Fotomicrografia n.° 3 — Lipofuscina em miocárdio de cão com 2 anos de idade. Os grânulos de pigmento, junto aos núcleos, apresentam-se corados intensamente em azul. Quantidade avaliada em *. Método de Hueck. Aumento de aproximadamente 470 X.
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