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Um estudo que investigou o efeito combinado da terapia celular usando células mononucleares derivadas da medula óssea e treinamento físico em animais com lesão medular espinal. O documento aborda a coleta e análise de células, a administração de células no espaço subaracnóideo intra-tecal e os resultados obtidos em diferentes grupos de animais. O estudo mostrou que o grupo de animais que recebeu terapia celular e treinamento físico apresentou melhores resultados em comparação aos grupos que não receberam nenhuma dessas intervenções.
O que você vai aprender
Tipologia: Resumos
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Não perca as partes importantes!
Aos meus pais, Ana Lúcia e Luiz António, pela minha Vida, pela amizade, exemplo e dedicação durante minha vida pessoal e profissional. Aos meus irmãos, Rafael e Roberta, meus melhores amigos, sempre prontos e dispostos a me ajudar. Ao mais novo membro da família, Pedro (Pedrinho), pelos momentos de descontração. À Simone, pelo carinho e paciência durante este processo que resultou nesta Dissertação.
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Aos Orientadores Prof. Dr. Raul Osiecki e Profª. Drª. Katherine Athayde Teixeira de Carvalho, pela confiança, oportunidade, estímulo, apoio e por não medirem esforços para que as dificuldades fossem superadas.
Ao Dr. Emiliano Neves Vialle, pelas várias manhãs de sábado e segunda-feira fazendo a pesquisa, junto com seus “fellows”, o meu obrigado pela orientação do modelo experimental de lesão medular, pelos ensinamentos em cirurgia experimental e pelo aquário para o treinamento dos animais.
Ao parceiro e grande amigo Doutorando Júlio César Francisco, pelas inúmeras participações durante todo o processo da pesquisa, das mais complexas como: punção e isolamento das células; as mais simples como: carona para transportar os animais.
À Doutoranda Rossana Baggio Simeoni, pela impecável participação no isolamento das células, prestando inestimável contribuição para esta pesquisa.
Ao Graduando de Medicina da PUCPR, Guilherme Henrique Gonçalves Moreira, pela participação no estudo e pela paciência e capacidade de ensinar a manipulação dos animais no inicio de todo o processo.
Ao Prof. Dr. Luiz César Guarita Souza, pela oportunidade de desenvolver a pesquisa e auxílio durante todo o processo inicial do mestrado.
Ao Prof. Dr. André Rodacki, pela contribuição científica para o estudo.
À Larissa Zocche, pelo auxílio no isolamento das células.
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LISTA DE ABREVIATURAS ................................................................ viii LISTA DE FIGURAS ............................................................................. ix LISTA DE GRÁFICOS .......................................................................... x LISTA DE TABELAS ............................................................................ x RESUMO ............................................................................................... xi ABSTRACT ........................................................................................... xii 1 INTRODUÇÃO ...................................................................................... 01 1.1. Célula .................................................................................................... 02 1.2. Célula Nervosa ..................................................................................... 02
1.2.1. Corpo Celular ......................................................................................... 02
1.2.2. Dentritos ................................................................................................ 03
1.2.3. Axônio .................................................................................................... 03
1.2.4. Sinapses ................................................................................................ 05
1.3. Célula Muscular ................................................................................... 05
1.3.1. Estrutura muscular ................................................................................. 06
1.3.2. Placa motora .......................................................................................... 06
1.4. Sistema nervoso .................................................................................. 07 1.5. Medula Espinal ..................................................................................... 08
1.5.1. Estrutura ................................................................................................ 08
1.5.2. Embriologia ............................................................................................ 10
1.6. Coluna Vertebral .................................................................................. 11
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SN Sistema Nervoso SNC Sistema Nervoso Central SNP Sistema Nervoso Periférico TRM Trauma Raquimedular LMET Lesão Medular Espinal Traumática L1 Primeira vértebra Lombar T10 Décima vértebra Torácica NT-3 Neurotrofina- 3 BNDF Fator Neutrófico Cerebral INYU Impactor da Universidade de Nova Iorque CT-mono Células Tronco mononucleares d Densidade CD- 34 Cluster differentiation 34 CD- 45 Cluster differentiation 45 MDMI Meio Dulbecco Modificado por Iscove MA Membro Anterior MP Membro Posterior μL Micro-litro NAD+^ Nicotinamida adenina dinucleotídio (oxidado) NADH Nicotinamida adenina dinucleotídio (reduzido) HE Hematoxilina-eosina CV Cresil-violeta VO2 máx. Volume de oxigênio máximo B.B.B. Escala funcional Basso, Beatie and Bresnahan
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A terapia celular e o exercício físico podem ser uma opção para regeneração da lesão medular espinal traumática. Este estudo tem por objetivo avaliar os efeitos funcionais da terapia autóloga de células-tronco derivadas da medula óssea: fração mononuclear no trauma raquimedular agudo em ratos sedentários e treinados. Foram utilizados 70 ratos Wistar, machos, submetidos à lesão medular contusa por impacção (Impactor NYU). Após este procedimento, os animais foram acompanhados e avaliados quanto à função motora com o auxílio da escala de BBB a cada 48 horas por 48 dias. Os animais com o escore≤ 08 foram divididos aleatoriamente em quatro grupos (N=48): Grupo 01, Sedentário e sem injeção intraparequimatosa de células (N=12); grupo 02, Sedentário e com injeção de células (N=12); grupo 03, Exercício e sem injeção de células (N=12) e o grupo 04, Exercício e injeção de célula (N=12). As células-tronco mononucleares adultas (CD45 +^ e CD34 - ) obtidas e isoladas por punção-aspiração da medula óssea. O treinamento físico realizado em um tanque. Após adaptação ao meio líquido, iniciou-se o treinamento: natação 6 vezes por semana durante 60 min. diários e por 6 semanas. O estudo foi duplo-cego. Avaliação estatística: Para as comparações entre os grupos em relação às diferenças entre a avaliação inicial e a avaliação final foi usado o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis e post-hoc U Mann-Whitney seguido da correção do nível do p pelo teste de Bonferroni (p<.008) para valores significativos. Foi demonstrada diferença estatística significante: p< .008 para o grupo Treinado com células-tronco em relação aos demais grupos, principalmente no terceiro momento (diferença). A conclusão foi que a combinação da terapia celular por células-tronco da medula óssea (CD45 +/ CD34 - ) e exercício físico resultaram em um aumento funcional significante na lesão medular espinal traumática aguda.
PALAVRAS-CHAVE: Lesão medular espinal traumática, terapia celular, células- tronco derivadas da medula óssea, exercício físico, ratos.
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Cell therapy and exercise training could be an option to spinal cord regeneration. This study aims to evaluate the functional effects of the autologous bone marrow stem cells (CD45 +/ CD34 - ) transplantation in the acute spinal cord injury: in exercise training and sedentary rats. Seventy adults, male Wistar rats were submitted to spinal cord contusion by Impactor (NYU). Locomotor rating scale was done each 48 hours by 48 days. The animals with score≤ 08 were divided randomly in four groups (N=48): Group 01, sedentary without cells parenchyma infusion (N=12); group 02, sedentary with cells parenchyma infusion (N=12); group 03, swimming training without cells parenchyma infusion (N=12) and group 04, swimming training with cells parenchyma infusion (N=12). Bone marrow stem cells were obtained and isolated by puncture-aspiration of the bone-marrow. After adaptation in the water, the animals were submitted six times a week to swimming session of 60 min, for six consecutive weeks. The study was double-blind. Statistics Analysis: The comparisons between the groups in relation to difference between the beginning and the end of score were done non-parametric Kruskal- Wallis and post-hoc U Mann-Whitney test and Bonferroni correction ( p ≤.008), for the identification the significance between groups. It was demonstrated significance: p≤.008 for swimming training with cells parenchyma infusion group in compared with the others groups, principaly in the third moment (difference). The conclusion was that the combination of the bone marrow stem cell therapy (CD45 +/ CD34 - ) and exercise training resulted in a significant functional improvement in the acute spinal cord injury.
KEY-WORDS: spinal cord injury, cell therapy, bone marrow stem cells, exercise training, rat.
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A seguir serão descritas detalhadamente as estruturas celulares e teciduais envolvidas na relação célula nervosa/músculo, os comprometimentos da transmissão neuromuscular com a lesão medular espinal traumática (LMET) e fatores como: terapia celular e exercício físico, que poderão contribuir para minimizar estes comprometimentos.
1.1. Célula
A célula é a unidade básica do organismo, o corpo humano inteiro contém aproximadamente 75 trilhões de células, a maioria das células tem a capacidade de diferenciação e de reprodução. Sempre que um determinado tipo de célula é destruído, por qualquer motivo, as restantes do mesmo tipo, em geral, dividem-se sucessivamente até que o número seja restaurado (JUNQUEIRA, 1990; GUYTON, 2006).
1.2. Célula Nervosa
A unidade estrutural e funcional do sistema nervoso é composta de células nervosas ou neurônios. Segundo ALBERTS (2006) a tarefa fundamental de uma célula nervosa ou neurônio é receber, conduzir e transmitir sinais. Esses elementos são formados por um corpo celular ou pericário de onde partem os prolongamento e seu núcleo (GUYTON, 2006; RASCH, BURKE, 1977).
1.2.1. Corpo celular
O corpo celular ou pericário representa o centro trófico da célula e sendo capaz de receber estímulos (JUNQUEIRA, 1990). Considerando as proposições de DUUS (1989) este tipo de célula apresenta numerosos prolongamentos, cujo
comprimento variável. Um desses prolongamentos é bem mais comprido que os demais e transmite as descargas das células à periferia, define-se como axônio ou neurito. Os outros prolongamentos, mais curtos e amplamente ramificados, são definidos como dentritos.
1.2.2. Dentritos
Prolongamentos numerosos, especializados na função de receber os estímulos do meio ambiente, de células epiteliais sensoriais ou de outros neurônios (JUNQUEIRA, 1990).
1.2.3. Axônio
Prolongamento único, especializado na condução de impulsos que transmitem informações do neurônio a outras células (nervosas, musculares, glandulares); sendo a sua porção em geral é muito ramificada (JUNQUEIRA, 1990). O axônio é o centro da fibra de um tronco nervoso, um tronco nervoso contém em média, cerca de duas vezes mais fibras amielínicas do que mielínicas. O axônio tem no seu conteúdo de axoplasma , que é um líquido viscoso intracelular, em torno do qual existe a bainha de mielina , que tem a espessura semelhante à do próprio axônio e aproximadamente, a cada milímetro, ao longo da extensão do axônio, a bainha de mielina é interrompida por um nodo de Ranvier (GUYTON, 2006). Segundo MELLONI e cols (1994) a bainha de mielina é depositada em torno do axônio pelas células de Schwann. A membrana da célula de Schwann gira em torno do axônio várias vezes, formando múltiplas camadas de membrana celular que contém uma substância lipídica: esfingomielina. Essa substância é um excelente isolante que impede quase todo fluxo de íons. Entretanto na junção de duas células de Schwann sucessivas, permanece uma área pequena não isolada, onde os íons podem fluir com facilidade, essa área é o
1.2.4. Sinapses
Na maioria das sinapses, as membranas plasmáticas das células transmissoras e receptoras, são denominadas estruturas pré-sinápticas e pós- sinápticas, respectivamente, separadas por uma fenda sináptica. Para a transmissão elétrica acontecer de um neurônio ao outro, o sinal elétrico do terminal nervoso da célula pré-sináptica é convertido em sinal químico e o sinal químico da célula pós-sináptica converte-se novamente em sinal elétrico, na forma de uma pequena molécula sinalizadora conhecida como neurotransmissor (DUSS, 1989). Os sinais neurais são transmitidos por meio de potenciais de ação. Cada potencial de ação começa com uma variação rápida (abrupta) do potencial de membrana em repouso, que passa de um potencial positivo para um negativo com a mesma velocidade. Para a condução de um sinal neural, tal potencial desloca-se ao longo de uma fibra nervosa até chegar a sua extremidade (GUYTON, 2006; MARTIN, 1998).
1.3. Célula muscular
Célula muscular esquelética é um tipo celular altamente característico. Em geral, a célula muscular é extremamente grande, sendo formada pela fusão de muitas células musculares precursoras chamadas de mioblastos ; tornando a célula multinucleada. As células musculares maduras diferenciam-se das outras células pela produção de proteínas especializadas, como actina e miosina que fazem parte do potencial contrátil, assim como proteínas receptoras e proteínas de canais iônicos das membranas celulares que tornam as células musculares sensíveis à estimulação nervosa (ALBERTS; et. al., 2006).
1.3.1. Estrutura muscular
Estruturas macroscópicas de músculo esquelético contêm milhares de células cilíndricas denominadas fibras. Uma fina camada de tecido conjuntivo o endomísio , envolve cada fibra muscular e separando-as das demais fibras. O perimíso , outra camada de tecido conjuntivo, circunda um feixe de até 150 fibras denominadas fascículo. Uma fáscia circunda o músculo inteiro, também formada de tecido conjuntivo, denomina-se epimísio (RASCH, BURKE, 1977). Considerando as afirmações de MCARDLE e cols.(2003), a baixo do endomísio e envolvendo cada fibra muscular existe o sarcolema. O sarcolema é uma membrana fina e elástica que envolve o conteúdo celular de cada fibra. No sarcolema, existe uma membrana plasmática (plasmalema) e uma membrana basal, entre as duas membranas existem as células-tronco miogênicas conhecidas como células satélites , que são os mioblastos quiescentes, que atuam no crescimento celular regenerativo e em possíveis adaptações com treinamento com o exercício e na recuperação após lesões.
1.3.2. Placa motora
A placa motora ou unidade motora é constituída por uma fibra nervosa e as fibras musculares por ela inervadas. As contrações normais das fibras musculares esqueléticas são comandadas por nervos motores. Tais nervos ramificam-se dentro do tecido conjuntivo do perimísio, onde cada nervo origina numerosas terminações. No término das ramificações, o nervo perde sua bainha de mielina e forma uma dilatação que se coloca dentro de uma depressão da superfície da fibra muscular, caracterizando assim uma placa motora ou junção mioneural (ALBERTS; et. al., 2006; DUPONT-VERSTEEGDEN, E.E.; et. al., 2000; GUYTON, 2006). (FIGURA 2)
