DNA RECOMBINANTE estrutura, Notas de aula de Biotecnologia

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CONCEITOS BÁSICOS

• Essa tecnologia foi desenvolvida a partir da década de 70 quando foram descobertas as endonucleases de restrição ou enzimas de restrição.
• Conjunto de técnicas que permitem a manipulação de moléculas de DNA, considerando sequências específicas, com a perpetuação de tal seqüência in vivo.

Duas classes de enzimas colocam-se para gerar e propagar o DNA recombinante:

• Endonucleases de restrição.
• DNA ligases

Há 2 tipos distintos de clivagens:

• Extremidades abruptas: os dois cortes ocorrem no eixo de simetria da sequência específica.
• Extremidades coesivas: os cortes são feitos simetricamente, porém, fora do eixo de simetria.

• Eco RI é purificada de uma Escherichia coli que carrega um fator de transferência de resistência RI.
• Hind III é isolada da Haemophilus influenzae , linhagem d III.

ENZIMAS DE RESTRIÇÃO INTERESSE IMPORTÂNCIA FAMÍLIA ÚNICA DE FRAGMENTOS

Junção de duas fitas de DNA A DNA ligase requer um grupo OH livre na extremidade 3' de uma das cadeias de DNA e um grupo fosfato na extremidade 5' da outra cadeia

CONSTRUÇÃO DO DNA

RECOMBINANTE

Ela atua na clonagem molecular unindo o fragmento de interesse ao vetor utilizado, formando um híbrido vetor/fragmento. A função das ligases na célula é reparar quebras em fitas individuais, que surgem em moléculas de DNA de fita dupla durante a replicação do DNA

A. Adição de polidesoxiadenina na extremidade 3’ de um fragmento de DNA, e polidesoxitimina na extremidade 3’ de um outro fragmento de DNA; B. Adição de adaptadores às extremidades não coesivas.

CLONAGEM Fragmentos de DNA com extremidades não coesivas podem ser transformadas em coesivas pela adição de poli (A) e poli (T).