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Um estudo sobre a caracterização de uma nova fonte de amido a partir da semente de araucária angustifolia, incluindo a metodologia de extração, análises físico-químicas, funcionais e reológicas do grânulo e sua modificação estrutural. O amido de pinhão foi analisado em relação à formação, fusão e termorreversibilidade do gel, tendência à retrogradação, estabilidade ao congelamento e descongelamento, poder de inchamento, índice de solubilização, mev, viscosidade de pasta e propriedades térmicas.
Tipologia: Teses (TCC)
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Roberta Cruz Silveira Thys Muccillo Engenheira de Alimentos (UFRGS) Mestre em Microbiologia Agrícola e do Ambiente (UFRGS)
Porto Alegre Agosto de 2009
Roberta Cruz Silveira Thys Muccillo Tese de Doutorado apresentada como requisito parcial para obtenção de título de Doutora em Engenharia. Área de Concentração: Fenômenos de Transporte e Operações Unitárias Orientador: Profa. Dr. Caciano Zapata Pelayo Noreña Co-orientadora: Profa. Dra^ Lígia Damasceno Ferreira Marczak
Porto Alegre Agosto de 2009
O pinhão é a semente comestível da Araucaria angustifolia , sendo consumido no sul e sudeste do Brasil principalmente na sua forma in natura. A falta de diversidade em relação ao seu consumo acarreta a sobra da safra e a sua utilização como ração animal, o que diminui o valor de comercialização do produto, prejudicando os ganhos econômicos do produto. A semente do pinhão é composta de 34% de amido e um conteúdo muito baixo de proteínas e lipídios, o que a torna favorável para a obtenção de amido, aditivo amplamente utilizado pela indústria de alimentos. O objetivo deste trabalho foi caracterizar uma nova fonte de amido a partir de semente de Araucária angustifolia , através de um estudo detalhado da metodologia de extração do amido de pinhão, das características físico-químicas, funcionais e reológicas do grânulo e de sua modificação estrutural. Primeiramente foi determinado um protocolo para a extração do amido e realizado o estudo do efeito do tratamento alcalino (NaOH 0,05 mol.l-1^ e NaOH 0,1 mol.l-1), em relação ao tratamento com água, na estrutura dos grânulos do amido extraídos. Para tanto foram feitas análises de fluorescência intrínseca, microscopia eletrônica de varredura e de força atômica e difractometria de raios X. A estrutura granular do amido de pinhão foi alterada significativamente quando as soluções alcalinas foram utilizadas durante a extração. O amido de pinhão apresentou estrutura do tipo C. Foram determinadas as características do grânulo de amido nativo, através de análises físico-químicas, MEV, microscopia ótica e sinerese, onde se verificou que o diâmetro médio dos grânulos de amido varia de 7 a 20 μm e as formas geométricas variam entre a oval, a elipsóide truncada e a hemisférica. O amido de pinhão mostrou-se menos propenso à retogradação, comparado ao amido de milho. Foram elaboradas as isotermas de adsorção do amido nativo às temperaturas de 10°, 20°, 30° e 40°C a partir do ajuste dos dados experimentais a diversos modelos de sorção, sendo os modelos de Peleg, seguidos pelos de Chung-Pfost e GAB os que tiveram os maiores coeficientes de correlação. A partir do modelo de GAB foram calculados os valores de umidade de monocamada, entalpia e entropia diferenciais de sorção. Foi realizado também um planejamento experimental a fim de estudar a reação de hidrólise do amido, através da influência das variáveis temperatura (30°a 44°C) e concentração de ácido clorídrico (1,2 a 3, mol.l-1) no valor de dextrose equivalente (DE) e na capacidade de formação do gel e de sua termorreversibilidade. Foi observado que sob os maiores valores de temperatura e concentração de ácido empregados, o valor de DE foi maior. No tratamento que resultou no maior valor de DE (3,2 mol.l-1^ de HCl e 44°C) foi observada a formação de gel termorreversível, o que indicou a potencialidade do amido modificado como substituto de gordura e agente ligante, em alimentos. A funcionalidade do amido de pinhão foi verificada através das análises de formação, fusão e termorreversibilidade do gel, tendência à retrogradação, estabilidade ao congelamento e descongelamento, poder de inchamento, índice de solubilização, MEV, viscosidade de pasta e propriedades térmicas, como temperatura e entalpia de gelatinização. Os resultados indicaram que: somente os amidos modificados apresentam géis termorreversíveis; os amidos de pinhão nativo e modificados possuem menor tendência à retrogradação do que seus similares de milho; a modificação do amido reduziu a tendência à retrogradação das pastas de amido; o amido de pinhão mostrou menor sinerese sob armazenamento à 5°C e após ciclos de congelamento e descongelamento; a temperatura de armazenamento influi significativamente no poder de inchamento (PI) e no índice de solubilização dos amidos de pinhão e milho nativos; os amidos modificados apresentaram menor PI do que os nativos; a viscosidade máxima do amido de pinhão foi maior à encontrada para o amido de milho, sendo ele menos resistente à agitação
mecânica à quente (maior breakdown ); a hidrólise ácida reduziu drasticamente a viscosidade das pastas formadas; a temperatura de gelatinização do amido de pinhão é de 47,64°C e a entalpia de gelatinização de 15,23 J.g-1; a hidrólise ácida aumentou a temperatura de gelatinização das espécies testadas. Palavras Chaves: Pinhão, amido, extração alcalina, isotermas de sorção, propriedades funcionais, propriedades térmicas, hidrólise ácida, substituto de gordura.
4.4.3 Determinação da tendência à retrogradação dos amidos nativos e modificados 119 4.4.4 Estabilidade ao Congelamento e Descongelamento ................................. 4.4.5 Poder de Inchamento (PI) e índice de Solubilização (IS) para os amidos nativos 122 4.4.6 Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) dos amidos nativos e modificados 125 4.4.7 Propriedade de pasta ................................................................................ 4.4.8 Determinação das propriedades térmicas e termodinâmicas .................... 5 CONCLUSÕES ................................................................................................... 136 6 CONSIDERAÇÕES FINAIS ................................................................................ 139 7 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS.................................................................... 140 8 ANEXOS ............................................................................................................. 156 8.1 Anexo 1: Curva padrão para determinação do valor de Dextrose Equivalente (DE) 156
Tabela 1: Resultados obtidos por Cordenusi et al. (2004) para as análises físico-químicas realizadas com o pinhão cru e cozido .............................................................................. 19 Tabela 2: Variação do tamanho e forma dos grânulos de amidos de diferentes fontes botânicas .......................................................................................................................... 24 Tabela 3: Tipos de Cristalinidade de amidos obtidos de espectros de raios- X....................... 31 Tabela 4: Dados obtidos por análise de DSC para diferentes espécies de amidos nativos. ... 36 Tabela 5: Modelos de isotermas de sorção comumente utilizados para materiais biológicos alimentícios....................................................................................................................... 47 Tabela 6: Tipos de modificação da molécula de amido e técnicas de preparação .................. 52 Tabela 7: Aplicações dos amidos modificados na indústria de alimentos ............................... 62 Tabela 8: Soluções salinas saturadas utilizadas na determinação das isotermas de adsorção de amido de pinhão. ......................................................................................................... 72 Tabela 9: Matriz e níveis dos fatores estudados e total de tratamentos realizados................. 75 Tabela 10: Análises físico-químicas do amido de pinhão obtido através da extração com água e álcali (0,05 mol.l-1^ e 0,1 mol.l-1^ ) ................................................................................... 84 Tabela 11: Área dos picos dos espectros de fluorescência dos sobrenadantes para os diferentes solventes de extração e teor de proteína residual do amido extraído, após secagem em estufa. ......................................................................................................... 87 Tabela 12: Dados obtidos para as análises físico-químicas do amido de pinhão nativo ......... 96 Tabela 13: Valores dos parâmetros preditos e erro relativo médio (ERM) obtidos para os diferentes modelos de adsorção aplicados aos dados experimentais para o amido de pinhão.............................................................................................................................. Tabela 14: Resultados do estudo da variável tempo na reação de hidrólise .......................... Tabela 15: Valor de dextrose equivalente e porcentagem de hidrólise dos hidrolisados mediante diferentes condições de hidrólise ácida do amido de pinhão ........................... Tabela 16: Coeficientes estimados da análise de regressão para as variáveis codificadas ... Tabela 17: Análise de variância (ANOVA) para o índice de dextrose equivalente dos hidrolisados .....................................................................................................................
Figura 1: Seção da molécula de amilose (a) e (b) detalhe da ramificação da amilopectina, incluindo a numeração dos carbonos da glicose. ............................................................. 20 Figura 2: Diagrama da estrutura molecular da amilopectina em forma de cachos (clusters).. 22 Figura 3: Diagrama esquemático do sistema de análise por Microscopia de Força Atômica.. 25 Figura 4: Representação esquemática dos modos de operação da análise de Microscopia de Força Atômica ((a) modo contato, (b) modo não contato e (c) modo intermitente). ......... 26 Figura 5: Fotomicrografias de grânulos de amido de diferentes fontes botânicas (aumento 1440 x). ............................................................................................................................ 28 Figura 6: Representação esquemática da estrutura da amilose e amilopectina do grânulo de amido nativo e do interior do grânulo. .............................................................................. 30 Figura 7: Difratogramas de raios-X obtidos para amidos com padrão de cristalinidade dos tipos A, B e Vh. ......................................................................................................................... 32 Figura 8: Ilustração esquemática das temperaturas de transição (To, temperatura inicial- onset , Tp, temperatura de pico e Tf, temperatura final) obtidas pela análise de DSC. ................ 35 Figura 9: Curva de viscosidade típica do RVA mostrando os parâmetros comumente avaliados. ......................................................................................................................... 37 Figura 10: Variabilidade de isotermas de sorção de água em materiais alimentícios.............. 41 Figura 11: Zonas características de uma isoterma de sorção de água de um alimento. ......... 42 Figura 12: Tipos de isotermas descritos por Brunauer, Emmet e Teller em 1983. .................. 45 Figura 13: Fenômeno de histerese .......................................................................................... 49 Figura 14: Cálculo do índice de cristalinidade, onde Aa é a área referente a fração cristalina do polímero e Ac, a área refrente a fração amorfa do polímero. ........................................... 69 Figura 15: Espectro de fluorescência de proteínas presentes nos sobrenadantes obtidos após lavagem e centrifugação do material amiláceo................................................................. 86 Figura 16: Imagens da MEV do amido de pinhão obtido após os diferentes tratamentos ....... 89 Figura 17: Imagens de MEV da farinha de pinhão (esquerda, aumento de 900x, direita, aumento de 2000x)........................................................................................................... 91 Figura 18: Imagens de MFA e dos histogramas de distribuição do tamanho de altura das superfícies dos grânulos do amido de pinhão obtido após os diferentes tratamentos...... 92
Figura 19: Perfis de DRX dos grânulos de amido de pinhão ................................................... 94 Figura 20: Micrografia em luz polarizada (200X) do amido de pinhão nativo, sob diferentes temperaturas (A:40°C; B: 45,3°C; C: 47,1°C; D: 50,3°C) ................................................. 98 Figura 21: Valores experimentais de umidade de equilíbrio (base seca) em função da atividade de água (aw) para amido de pinhão em diferentes temperaturas e modelo de GAB ........ 99 Figura 22: Modelo de GAB ajustado aos dados experimentais de umidade de equilíbrio (base seca) em função da atividade de água (aw) para amido de pinhão em diferentes temperaturas ................................................................................................................... Figura 23: Entalpia diferencial de adsorção do amido de pinhão em função do conteúdo de umidade de equilíbrio ...................................................................................................... Figura 24: Entropia diferencial de adsorção do amido de pinhão em função da umidade de equilíbrio .......................................................................................................................... Figura 25: Sinerese das pastas de amido de milho e pinhão nativos durante armazenagem a 5°C durante 28 dias ......................................................................................................... Figura 26: Valores de Dextrose Equivalente observado como uma resposta da interação entre as variáveis temperatura e concentração de ácido clorídrico, após hidrólise ácida. ....... Figura 27: Opacidade da pasta dos amidos nativos e modificados de pinhão e milho (transmitância à 625nm). ................................................................................................. Figura 28: Sinerese das pastas de amido de milho e pinhão seis ciclos de congelamento e descongelamento ............................................................................................................ Figura 29: Micrografias obtidas através de MEV do amido de pinhão nativo e modificado, sendo A, pinhão nativo (2000x); B, pinhão modificado (2000x)....................................... Figura 30: Micrografias obtidas através de MEV do amido de milho nativo e modificado, sendo A, milho nativo (2000x); B, milho modificado (2000x)...................................................... Figura 31: Viscoamilogramas agregados dos amidos nativos e modificados de pinhão e milho. ........................................................................................................................................ Figura 32: Termogramas obtidos através de DSC dos amidos nativos de pinhão, safra 2007 (A) e milho (B) e modificados via hidrólise ácida (44°C e 3,2 mol.l-1^ de HCl) de pinhão (C) e milho (D). ......................................................................................................................
estabilizador de textura e regulador em sistemas alimentícios, possui limitações como a baixa resistência e decomposição térmicas e a alta tendência à retrogradação, o que limita o seu uso para algumas aplicações industriais (Hermansson e Svegmark, 1996). Para contornar os problemas de funcionalidade dos amidos nativos em uso, atualmente é realizada a prática de modificação da molécula do polissacarídeo, com fins de alteração das propriedades funcionais para melhor adequação às necessidades do mercado. Uma das modificações de amido amplamente utilizada é a hidrólise ácida, que consiste em tratar o amido com soluções ácidas, abaixo da temperatura de gelatinização. Deste processo pode-se obter um polímero com grande aplicabilidade como substituto de gordura (Zambrano e Camargo, 2001a). Para o uso como substitutos de gordura, especificamente, são recomendados amidos com um conteúdo médio de amilose de 20%, com baixos teores de lipídios e proteínas aderidos, que formam pastas claras e que possuam sabor neutro (Vanderveen e Glinsmann, 1992), características que, segundo Bello-Pérez et al. (2006), encontram-se no amido de pinhão. Amante (1986) relata que para um vegetal servir como fonte de amido, ele deve conter quantidade representativa desse carboidrato, ser de fácil extração e conter propriedades de interesse econômico. O amido do pinhão, segundo Wosiacki e Cereda (1984), pode ser facilmente obtido através da sedimentação, após trituração das sementes sem casca. Além disso, o polímero possui propriedades como resistência ao aquecimento e desintegração mecânica, baixa temperatura de pasta e relativa estabilidade ao armazenamento sob refrigeração. Na bibliografia, pouco se encontra a respeito desta semente, em relação aos seus aspectos tecnológicos. Dentre os trabalhos que abordam algum aspecto, pode-se citar Stahl et al. (2007), Bochi et al. (2002), Bello-Pérez et al. (2006), Olivarez & Noreña (2006) e Cladera-Olivera et al., (2008). Olivarez & Noreña (2006) estudaram as curvas de secagem do pinhão cru nas temperaturas de 55, 65 e 75o^ C, no entanto, o tempo total de secagem foi de 8 h, insuficiente para obter níveis de umidade menores que 70% em base seca. Cladera- Olivera (2008) estudaram as isotermas de sorção do pinhão cru, entretanto não existem relatos a respeito das isotermas de sorção de amido de pinhão.
Bello-Pérez et al. (2006) estudaram o amido nativo de pinhão, sugerindo uma metodologia para a sua extração e incluindo a caracterização do polissacarídeo. No entanto, a metodologia de extração descrita não previu a presença de proteínas, que mesmo em pequenas quantidades gera um menor grau de pureza do amido obtido. Também estes autores reportaram às propriedades reológicas G´, G´´ e tan δ em dispersões de amido (10% p/v) quando aquecidas (25 à 90°C) embora não tenham abordado o comportamento reológico da pasta/gel de amido, parâmetro muito importante quando se pretende avaliar o comportamento do amido em um processo alimentício. Em relação à modificação ácida da molécula do amido de pinhão, objetivando a obtenção de propriedades funcionais com maiores possibilidades de aplicação na indústria, principalmente alimentícia, nada consta em literatura. Através da ausência de informações completas a respeito do amido de pinhão, tanto na forma nativa quanto após algum processo de modificação de sua molécula, o objetivo deste trabalho foi caracterizar o amido de pinhão a fim de determinar as suas propriedades funcionais, térmicas e reológicas e todas as suas possíveis aplicações na indústria de alimentos.
Tabela 1: Resultados obtidos por Cordenusi et al. (2004) para as análises físico-químicas realizadas com o pinhão cru e cozido
Análise (%bu) Pinhão cru Pinhão cozido* Umidade (^) 49,50 ± 0,02 50,35 ± 0, Proteína (^) 3,57 ± 0,05 2,31 ± 0, Lipídeos (^) 1,26 ± 0,07 1,26 ± 0, Resíduo mineral fixo (^) 1,60 ± 0,01 1,41 ± 0, Amido (^) 36,28 ± 0,11 34,48 ± 0, Fibra dietética solúvel (^) 0,63 ± 0,13 0,55 ± 0, Fibra dietética insolúvel (^) 4,26 ± 0,20 5,17 ± 0, Açúcares solúveis totais 2,43 0,
*bu, base úmida
1.2 O GRÂNULO DE AMIDO
O amido esta disponível em abundância na natureza, sendo encontrado em todas as plantas e extraído de folhas, raízes, caules, sementes e frutos. A planta serve, assim como aos seres humanos e animais, como alimento, funcionando como componente de reserva energética. Entretanto, o homem encontrou aplicações diversificadas para o amido, que vai além de sua função original como fonte de energia, sendo utilizado, assim como seus derivados, em quase todas as indústrias. Na indústria de alimentos e farmacêutica o amido é utilizado para alterar diversas características, tais como, textura, aparência, umidade, consistência e estabilidade durante o processamento e posterior armazenagem. Pode ser utilizado para ligar ou desintegrar; expandir ou tornar denso, clarear ou tornar opaco, atrair ou inibir umidade, produzir textura curta ou longa, lisa ou de polpa, coberturas leves ou crocantes. Pode ser usado para estabilizar emulsões ou formar filmes resistentes a óleo. Ainda pode ser utilizado para auxiliar o processo de obtenção de algum produto, assim como a embalagem final do mesmo (National Starch and Chemical Industrial Ltda, 1995).
1.2.1 Estrutura e composição do grânulo de amido O amido é um homopolissacarídeo formado por dois polímeros: amilose e amilopectina, ambos formados por unidades de D-glucose. Estas unidades ligam-se através da condensação enzimática que ocorre predominantemente entre átomos de carbono 1 e 4 (Figura 1) e ocasionalmente entre átomos de carbono 1 e 6 (Manners, 1989).
Figura 1: Seção da molécula de amilose (a) e (b) detalhe da ramificação da amilopectina, incluindo a numeração dos carbonos da glicose. Fonte: Franco et .al (2002)
Quando somente ligações α,1-4 são formadas, o homopolímero resultante possui cadeia linear, sendo denominada amilose. A distribuição da massa molar da amilose é variável com as fontes botânicas e também com a forma de extração (Buléon et al., 1998), podendo conter de 200 a 2000 unidades de glicose (Wurzburg, 1986). De acordo com
