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Este documento aborda os procedimentos e técnicas utilizados no diagnóstico e identificação de micobactérias, com foco especial no complexo mycobacterium tuberculosis, responsável pela tuberculose humana. O texto detalha os requisitos de coleta, transporte e processamento de amostras clínicas, como escarro, urina, tecidos e líquidos orgânicos. Também são descritos os meios de cultura utilizados, os testes bioquímicos e moleculares para identificação das espécies, bem como os métodos para avaliação da resistência aos antimicrobianos. Essa abordagem abrangente fornece informações valiosas para profissionais da área de microbiologia clínica, contribuindo para o aprimoramento dos procedimentos diagnósticos e o manejo adequado das infecções por micobactérias.
Tipologia: Manuais, Projetos, Pesquisas
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São Luís – MA 2024
As micobactérias são um grupo de bacilos aeróbios que resistem à descoloração com álcool-ácido, sendo essa uma propriedade característica desse gênero. São micro-organismos em geral de crescimento lento, devido a uma constituição hidrofóbica da parede celular, o que dificulta a entrada de nutrientes nas células, levando a um crescimento lento. Há atualmente cerca de 100 espécies reconhecidas no gênero Mycobacterium , sendo que grande parte é patogênica para o homem. De modo geral, as micobactérias podem ser divididas em dois grupos principais (Imagem 1): micobactérias do complexo M. tuberculosis e micobactérias não pertencentes ao complexo M. tuberculosis. A espécie M. tuberculosis é responsável pela tuberculose humana, doença muito frequente em todo o mundo, com cerca de 8 milhões de novos casos ao ano e uma alta taxa de mortalidade em alguns países. Devido ao aumento no número de casos de infecções causadas por micobactérias a partir da década de 1980, tornou-se cada vez mais importante a realização de diagnósticos rápidos e precisos que envolvam não somente a detecção do micro-organismo. Com a crescente preocupação mundial com a tuberculose, os laboratórios de Microbiologia têm sido cada vez mais exigidos em relação à rapidez do diagnóstico. Um número maior de amostras é processado no laboratório para realizar este diagnóstico, exigindo que medidas de segurança sejam tomadas e Fonte: OPLUSTIL, 2004.
congelar até encaminhar ao laboratório. É recomendável a coleta de três amostras em dias consecutivos ou alternados. Lavado broncoalveolar e lavado brônquico Coleta: Colher a amostra em tubo ou frasco estéril. Transporte: Encaminhar ao laboratório em até 12 horas após a coleta, à temperatura ambiente (20 a 25°C). Para períodos prolongados, refrigerar a amostra de 2 a 8°C. Urina Coleta: Colher, após antissepsia, todo o volume da primeira urina da manhã desprezando o primeiro jato em frasco estéril. Transporte: Encaminhar ao laboratório em até 24 horas, se mantida refrigerada de 2 a 8°C. Não processar amostras de urina de 24 horas, já que o processo de descontaminação dessas amostras para cultura utiliza um tempo maior de exposição aos agentes químicos e uma concentração maior desses agentes descontaminantes, o que pode eliminar prováveis micobactérias patogênicas presentes na amostra e, portanto, prejudicar o resultado final. É recomendável a coleta de três amostras em dias consecutivos ou alternados. Liquor Coleta: Colher a amostra em tubo estéril. Transporte: Encaminhar ao laboratório em até 2 horas se mantida a temperatura ambiente (20 a 25°C) ou, se refrigerada, de 2 a 8°C até 24 horas após a coleta. Solicitar que sempre seja colhido um volume mínimo de 2ml, destinado especificamente para cultura de micobactérias. Aspirado gástrico Coleta: Colher pela manhã em jejum. Colocar em um frasco ou em tubos estéreis contendo 100mg de carbonato de sódio para neutralizar a amostra.
Transporte: Encaminhar ao laboratório em até 24 horas, se mantida refrigerada de 2 a 8°C. Fragmentos de tecido, biópsias e líquidos orgânicos Coleta: Colher a amostra de tecido e biópsia em frasco ou tubo estéril sem formol ou outro conservante. As amostras de líquidos orgânicos devem ser colhidas em frascos estéreis em um volume mínimo de 10ml. Transporte: Encaminhar ao laboratório em até 2 horas, à temperatura ambiente (20 a 25°C), e em até 24 horas se mantidas refrigeradas de 2 a 8°C. Sangue Coleta: Colher em frascos de hemocultura específicos para cultura de micobactérias. Manter à temperatura ambiente (20 a 25°C). Transporte: Encaminhar ao laboratório em até 12 horas após a coleta. Fezes Coleta: Colher a amostra em frasco estéril sem conservante ou diluente. Transporte: Encaminhar em até 2 horas ao laboratório, à temperatura ambiente (20 a 25°C) e em até 24 horas se mantida refrigerada de 2 a 8°C. Amostras de fezes podem ser utiliza- das para a pesquisa do complexo M. avium em paciente com aids em conjunto com culturas de outros sítios. CONTROLE DE QUALIDADE Para verificar se o método empregado para tratamento dos materiais clínicos está sendo eficaz, monitorar a porcentagem de meios contaminados. O aceitável é um índice de 3 a 5% de contaminação. Se houver um índice menor que 3%, significa que o método está sendo muito rigoroso na descontaminação e um índice maior que 5% significa que o método não está descontaminando adequadamente as amostras, portanto deve ser revisto. Os meios de cultura utilizados devem ser controlados para verificar se as micobactérias apresentam bom crescimento.
Colocar a amostra clínica em um tubo cônico estéril de tampa de rosca (50ml). Se a amostra for escarro, colocar até 5ml da parte mais purulenta ou sanguinolenta da amostra. Em outro material clínico colocar até 10ml da amostra. Adicionar o mesmo volume da solução de NALC-NaOH. Homogeneizar vigorosamente por 30 segundos. Deixar à temperatura ambiente (20 a 25°C) por 15 minutos (não ultrapassar esse tempo). Completar até 50ml com água estéril. Misturar por inversão várias vezes. Centrifugar a 3.000xg/15 minutos (centrífuga refrigerada). Desprezar o sobrenadante em um frasco contendo hipoclorito a 2% (cloro livre). Ressuspender o sedimento em 1ml de solução fisiológica estéril. Inocular nos meios apropriados. Fazer uma lâmina para pesquisa direta.
2. Método de NaOH (Petroff) Colocar a amostra clínica em um tubo cônico estéril de tampa de rosca (50ml). Se a amostra for escarro, colocar até 5ml da parte mais purulenta ou sanguinolenta da amostra. Em outro material clínico que necessite de tratamento prévio, utilizar até 10ml da amostra. Adicionar o mesmo volume de NaOH a 2%. Homogeneizar vigorosamente. Deixar à temperatura ambiente (20 a 25°C) por 15 minutos (não ultrapassar esse tempo). Completar até 50ml com tampão-fosfato (0,067M, pH 6,8). Misturar por inversão várias vezes. Centrifugar a 3.000xg/15 minutos (centrífuga refrigerada). Desprezar o sobrenadante em um frasco contendo hipoclorito a 2%. Adicionar algumas gotas de vermelho de fenol ao sedimento. Neutralizar com HCl homogeneizando continuamente até ficar amarelo. Ressuspender o sedimento em 1ml de tampão-fosfato. Inocular nos meios apropriados.
Fazer uma lâmina para pesquisa direta. PROCESSAMENTO DO MATERIAL Dependendo do tipo de material clínico, a técnica de preparação da amostra para semeadura nos meios de cultura pode variar. A figura 2 descreve a forma de processamento, atmosfera, temperatura e tempo de incubação das amostras. Após o processamento é aconselhável estocar as amostras por até sete dias refrige- radas de 2 a 8°C, para eventual reprocessamento do material. MEIOS DE CULTURA EMPREGADOS MGITIM (Becton Dickinson, Biosciences) - meio constituído de 4ml de 7H modificado acondicionado em um tubo, acrescido de OADC (ácido oléico, albumina bovina, dextrose e catalase) e um composto fluorescente embebido em silicone, sensível ao oxigênio. A detecção é baseada no consumo de oxigênio pelas mico- bactérias que permite a emissão da fluorescência, que é então visualizada utilizando luz ultravioleta (365nm). Amostras fluorescentes devem ser confirmadas após coloração de Ziehl. Bactec 12B (Becton Dickinson, Biosciences) - meio constituído de 4ml de 7H12 contendo ácido palmítico marcado com "C. Se houver crescimento de micobacté rias, estas vão utilizar o ácido palmítico e liberar "CO, marcado como produto do metabolismo. O equipamento Bactec 460TB quantifica o "CO 2 , marcado e traduz em um número, Gl (índice de crescimento). GI maior que 10 indica possível amos- tra positiva, a qual deve ser confirmada após coloração de Ziehl. Nota: amostras obtidas de lesões de pele ou tecido devem ser semeadas em mais um meio sólido para incubação a 30°C para isolamento de M. marinum e M. ulcerans. No caso de suspeita de M. haemophilum, semear também a amostra em CHOC e incubar a 30°C.
ESP Myco Reagent media (Trek Diagnostic Systems, Ohio) - meio constituído de 7H9, casitone, glicerol e esponjas de celulose. As esponjas de celulose fornecem um suporte para crescimento, simulando os alvéolos pulmonares. Em cada frasco é acoplado um sensor que se liga ao aparelho ESP Culture System II para monitorar a mudança de pressão dentro do frasco, provocada pela produção de gases ou consumo de oxigênio pela micobactéria. O sistema ESP Culture System II monitora constantemente as culturas. Amostras positivas devem ser confirmadas após coloração de Ziehl. BacT/Alert MP (bioMérieux, Inc., Durham, NC) - meio contendo 10ml de 7H modificado. Cada frasco possui um sensor na base, que muda de coloração quando em contato com CO, produzido pelo metabolismo da micobactéria. Cada fras- co é monitorado constantemente pelo equipamento BacT/Alert 3D ou MB/BacT e amostras positivas são indicadas com sinais luminosos e devem ser confirmadas após coloração de Ziehl. LJ (Lowenstein-Jensen) - meio de cultura sólido à base de ovo, sais, glicerol e fécula de batata com ou sem adição de antimicrobianos que permite o desenvolvimento de pigmento pela micobactéria. Esse meio é menos sensível que os outros, mas continua sendo amplamente utilizado nos laboratórios. O meio permite a visualização da morfologia das colônias, o que é de extrema importância para a identificação das espécies. É recomendado que seja utilizado em conjunto com um meio líquido. 7H10 - meio de cultura sólido constituído de sais, vitaminas, co-fatores, ácido oléico, albumina, catalase, glicerol e dextrose. Esse meio é utilizado para a realização de testes de avaliação da resistência aos tuberculostáticos e como meio para isolamento primário. Esse meio permite verificar a presença de culturas mistas de micobactérias e visualizar a morfologia das colônias, que são típicas nesses meios. 7H11- meio sólido constituído de sais, vitaminas, co-fatores, ácido oléico, albumina, catalase, glicerol, caseína hidrolisada e dextrose. Esse meio permite verificar a presença de culturas mistas de micobactérias e visualizar a
morfologia das colônias que são típicas. A caseína hidrolisada do meio favorece a recuperação de cepas de micobactérias resistentes à isoniazida. Para amostras de sangue, os frascos mais freqüentemente utilizados são: Bactec 13A (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, Md), Myco/F Lytic (Becton Dickinson Diagnostic Systems, Sparks, Md), BacT/Alert MB (bioMérieux, Inc., Durham, NC), ESP Myco reagent media (Trek Diagnostic Systems, Ohio) e HEMOLISOBAC (Probac do Brasil, São Paulo, SP). Testes de identificação Os testes tradicionais para a identificação de micobactérias resumem-se na utilização de algum substrato pela micobactéria, no crescimento em diferentes temperaturas, na produção de pigmento e na morfologia da colônia das diferentes espécies. Tempo e temperatura de crescimento A velocidade de crescimento refere-se ao tempo necessário para haver desenvolvimento de colônias visíveis no meio de cultura. São consideradas micobactérias de crescimento rápido aquelas que formam colônias visíveis em até sete dias e as de crescimento lento as que se desenvolvem após sete dias em meio sólido. Para realizar esse teste o meio sólido deve ser inoculado com uma suspensão-padrão de micobactérias. A maioria das micobactérias desenvolve-se na temperatura de 35 a 37°C e outras temperaturas (28°C, 30°C, 42°C, 45°C) devem ser testadas se houver suspeita de determinadas micobactérias (M. xenopi tem seu crescimento ótimo a 42°C e M. marinum a 30°C). Produção de pigmento As micobactérias são classificadas em três grupos quanto à habilidade de produzir pigmento em meio de cultura Lowenstein-Jensen. As fotocromogênicas produzem colônias pigmentadas somente após exposição à luz, no escuro elas não produzem pigmento (M. kansasii , M. marinum). As micobactérias scotocromogênicas pro- duzem forte pigmento amarelo alaranjado tanto no escuro quanto após exposição à luz (M. gordonae ) e as
padronizados para o teste de M. tuberculosis, embora sejam também empregados para outras micobactérias não pertencentes ao complexo. COMO REPORTAR O RESULTADO Pesquisa direta em amostra de escarro Resultado positivo - 2 + (presença de 10 bacilos/10 campos microscópicos). Resultado negativo - pesquisa de bacilos álcool-ácido resistentes: negativa em 300 campos microscópicos analisados. Cultura Exemplo 1: para laboratório nível II no caso de isolamento de micobactéria não pertencente ao complexo M. tuberculosis. Resultado positivo - cultura positiva para micobactérias. Cepa será enviada para laboratório de referência para identificação final. Exemplo 2: para laboratório níveis II e III. Resultado negativo - cultura negativa para micobactérias, Exemplo 3: para laboratório nível III. Resultado positivo - cultura positiva para complexo Mycobacterium avium.
OPLUSTIL, Carmen Paz. Procedimento Básico em Microbiologia Clínica. 2° Edição. São Paulo. Savier, 2004.
