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Desenvolvimento embrionário e diferenciação gonadal de Podocnemis unifilis (Testudines: Podocnemididae) em temperatura controlada.
Tipologia: Notas de aula
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Não perca as partes importantes!
Manaus, Amazonas Março/
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Orientador: Dr. Richard C. Vogt Co-orientadora: Dra. Marcela dos Santos Magalhães - UFAM Agência Financiadora: CAPES
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia como parte dos requisitos para obtenção do título de Mestre em Ciências Biológicas, área de concentração em Biologia de Água Doce e Pesca Interior.
Manaus, Amazonas Março/
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Dedico este trabalho aos meus pais Manoel e Zeni, meus maiores incentivadores e exemplos de determinação.
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As minhas amigas e irmãs Tahuana e Yasmin por todo amor a mim dedicado nesses anos, por cuidarem de mim e do Joca sempre com tanto carinho. Obrigada por estarem comigo nos momentos bons e ruins. A amizade que construímos me fortaleceu e me fez acreditar ainda mais no quão sou capaz. Amo vocês!
A Ana Paula (Napaula) e Luigi Dieb que foram meus primeiros amigos quando cheguei em Manaus me dando todo suporte que precisei. Sem vocês tudo teria sido mais difícil.
As minhas amigas Eloyza e Jaqueline pelo carrinho e por sempre comemorarem cada conquista minha.
Ao Henrique pela amizade leve e cheia de boas risadas que construímos, por cada abraço apertado pra me dizer que sempre estaria ali e que se orgulhava de mim e por jamais me deixar esquecer o quão forte sou.
Aos meus amigos Marcela, Jonatas e Thalison por serem os melhores vizinhos do mundo e tornarem meus dias mais felizes mesmo quando as coisas não estavam bem. A boa energia que emanam consegue acolher e aquecer um coração cheio de saudades de casa.
As minhas amigas Érica, Luiza, Janielle, Danielle, Tamires, Mariele e Hellem (Japa) que mesmo não estando presente fisicamente nos meus dias se fazem presente virtualmente, me dando forças e mostrando que a amizade sobrevive em meio a distâncias e rotina corrida.
Ao Cristiano Goes que chegou na minha vida na reta final do mestrado, o momento mais intenso e difícil e mesmo assim escolheu ficar ao meu lado, sempre dizendo que tudo daria certo. Obrigada por todas as vezes que me abraçou fazendo eu me sentir segura e por todos os bons cafés que já tomamos juntos. Tens meu carinho meu bem!
Ao meu filhote Joaquim por ser meu parceirinho e ter me enchido de amor felino todos os dias sem pedir muito em troca (só muita ração).
Ao Grupo de Pesquisa em Morfologia de Animais Silvestres (GPMAS) da Universidade Federal do Amazonas, por todo conhecimento compartilhado e experiências enriquecedoras. E meu agradecimento especial a Vanessa e Thayssa que me ajudaram por tantos dias no laboratório fazendo e refazendo minhas lâminas.
Aos meus amigos do Cetro de Pesquisas dos Quelônios da Amazônia (CEQUA) por todas as boas conversas e por todas as vezes que se disponibilizaram a assistir minhas prévias. E meu agradecimento especial a Sabrina Menezes e Maria Augusta que sempre me trataram com tanto carinho.
Ao Laboratório Temático de Microscopia Eletrônica e Nanotecnologia (LTMN) do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pelo suporte no processamento e análise em Microscopia de luz e Microscopia eletrônica de transmissão.
Ao Dr. Paulo Andrade pelo apoio na realização da pesquisa possibilitando a coleta dos ovos de tracajá junto a sua equipe do programa Pé-de-pincha.
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Ao professor Dr. Edinaldo Nelson e os seus alunos do Laboratório de Plâncton, que disponibilizaram a incubadora para a realização da incubação artificial dos ovos do experimento.
A minha turma de mestrado pelo companheirismo e experiências compartilhadas nesses dois anos de curso.
A Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pelo financiamento da bolsa do mestrado.
Ao Programa de Pós Graduação em Biologia de Água Doce e Pesca Interior (BADPI) e ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela estrutura e suporte necessário para realização dessa etapa tão importante da minha formação profissional.
A todos que não citei aqui, mas que de alguma forma contribuíram para esse trabalho dá certo e pro meu amadurecimento pessoal.
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Esse trabalho objetivou descrever os caracteres morfológicos externos e diferenciação gonadal durante o desenvolvimento embrionário de Podocnemis unifilis em temperatura controlada. Foram coletados 100 ovos e incubados em incubadora artificial. O período de incubação foi de 60 dias, com temperatura média de incubação de 31,8ºC. Foram realizadas análises macroscópicas, microscopia de luz e microscopia eletrônica por transmissão. As principais características utilizadas para descrição e comparação do desenvolvimento embrionário foram: cabeça, processo mandibular, olhos, membros, carapaça e plastrão. No desenvolvimento gonadal as células germinativas primordiais (CGPs) só foram visualizadas a partir do 7º dia de incubação, e se localizavam na região posterior do corpo do embrião e entre os dias 9 e 11 de incubação foi possível observar a migração das CGPs a partir do saco vitelínico em direção a região ventromedial da parede do mesonefro primitivo. Aos 20 dias de desenvolvimento a gônada indiferenciada está estabelecida sendo identificadas duas regiões distintas, a região cortical externa caracterizada pela presença de CGPs, e a região medular interna onde os cordões sexuais primitivos foram presentes. A diferenciação gonadal teve início a partir de 35 dias de incubação observando o início da organização dos cordões sexuais para a formação dos túbulos seminíferos. Todas as gônadas analisadas nesse estudo se diferenciaram formando testículos. Os estudos morfológicos do desenvolvimento embrionário e a caracterização gonadal geram informações acerca da biologia reprodutiva das espécies, e essas informações auxiliam em pesquisas para elaboração de estratégias de manejo e/ou tornando os métodos já existentes mais eficientes.
Palavras-chave: Embriologia, determinação sexual, quelônios.
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This work aimed to describe the external morphological characters and gonadal differentiation during the embryonic development of Podocnemis unifilis at controlled temperature. 100 eggs were collected and incubated in an artificial incubator. The incubation period was 60 days, with an average incubation temperature of 31.8ºC. Macroscopic analyzes, light microscopy and transmission electron microscopy were performed. The main characteristics used to describe and compare embryonic development were: head, mandibular process, eyes, limbs, carapace and plastron. In gonadal development, primordial germ cells (CGPs) were only visualized from the 7th day of incubation, and were located in the posterior region of the embryo's body and between the 9th and 11th incubation it was possible to observe the migration of the CGPs from the yolk sac towards the ventromedial region of the primitive mesonephral wall. At 20 days of development, the undifferentiated gonad is established and two distinct regions are identified, the external cortical region characterized by the presence of CGPs, and the internal medullary region where the primitive sexual cords were present. The gonadal differentiation started after 35 days of incubation observing the beginning of the organization of the sexual cords for the formation of the seminiferous tubules. All the gonads analyzed in this study differed, forming testicles. Morphological studies of embryonic development and gonadal characterization generate information about the reproductive biology of species, and this information helps in research to develop management strategies and / or making existing methods more efficient.
Key-words: Embryology, sex determination, turtles
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Figura 1.................................................................................................................................... Figura 2 ...................................................................................................................................
CAPÍTULO I
Figura 1.................................................................................................................................... Figura 2.................................................................................................................................... Figura 3....................................................................................................................................
CAPÍTULO II
Figura 1.................................................................................................................................... Figura 2.................................................................................................................................... Figura 3.................................................................................................................................... Figura 4.................................................................................................................................... Figura 5....................................................................................................................................
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Os quelônios constituem atualmente um dos grupos de vertebrados mais ameaçados do planeta, contendo cerca de 50% das espécies listadas em alguma categoria de ameaça de extinção ou que já foram extintas. O declínio das populações de quelônios está ligado principalmente à perda de habitats aquáticos e a sobre-exploração desses animais para fins diversos, destacando-se o uso como recurso medicinal, animais de estimação e recurso alimentar (Ferrara, et al ., 2017). Durante décadas na Amazônia, os quelônios têm sido caçados e seus ovos coletados, sendo a carne destes animais considerada uma iguaria na região (Ferrarini, 1980; Rebêlo & Pezzuti, 2000).
A predação de ovos e fêmeas de quelônios, mais suscetíveis no momento da desova, impossibilita incremento de novos indivíduos, o que contribui para um rápido declínio populacional, considerando que os quelônios apresentam grande longevidade e reprodução tardia como características de sua história de vida (Congdon et al., 1993). A liberação do comércio de carne de quelônios provenientes de criadouros, não abrandou a pressão sobre os estoques naturais e foi ainda incapaz de substituir o comércio ilegal nos mercados locais (Rebêlo & Pezzuti, 2000). As espécies pertencentes à família Podocnemididae, Podocnemis expansa (tartaruga-da-amazônia), P. unifilis (tracajá), P. sextuberculata (iaçá), P. erythrocephala (irapuca) e Peltocephalus dumerilianus (cabeçudo), são os quelônios mais consumidos da Amazônia (Pezzuti & Vogt, 1999).
A conservação das espécies de quelônios amazônicos é importante não apenas por manter a diversidade biológica neste bioma, mas também pelo papel histórico e atual destes animais como recurso alimentar e fonte de proteína para as populações ribeirinhas (Vogt, 1994). Diante disso, muitos métodos têm sido utilizados como medidas de manejo para a conservação de quelônios com intuito de manter, aumentar e/ou recuperar populações em declínio. Sendo elas divididas em in situ : consistem em proteger o habitat e os animais ou restabelecer o habitat, por meio de leis de proteção, controle de predadores e proteção de áreas de desova; e ex situ: ações como a remoção dos ovos do local que foram desovados e a transferência para local protegido, criação de animais em cativeiros e headstarting (manter filhotes recém-nascidos em viveiros, com o objetivo de permitir o crescimento dos mesmos até um tamanho em que estejam menos vulneráveis a predadores) (Vismara, 2010).
Projetos de proteção e manejo de quelônios são desenvolvidos em diversas áreas no Brasil, e quando consideramos os de água doce, incluem-se especialmente as espécies do
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Greenbaum & Carr, 2001), no entanto trabalhos com gonadogênese para espécies amazônicas se restringe a pesquisas com P. expansa (Hildebrand et al., 1997 e Magalhães, 2017).
Os estudos morfológicos do desenvolvimento embrionário e caracterização gonadal são ferramentas que auxiliam em pesquisas para elaboração de estratégias de manejo, incluindo transplantes de ninho e programas de incubação seminatural (Hildebrand, et al ., 1997).
Descrição da espécie
Estando entre as espécies mais comuns na Amazônia, Podocnemis unifilis (Troschel, 1848), conhecida popularmente como tracajá, ocorre em todos os estados do Brasil que fazem parte da bacia Amazônica (Amazonas, Roraima, Rondônia, Mato Grosso, Pará e Amapá) e vivem em uma variedade de habitats, tais como lagos, grandes rios, lagos de meandro, pântanos, brejos e lagoas (Ferrara et al. , 2017). Quando os rios transbordam (durante a estação chuvosa) essa espécie procura refúgio das águas turbulentas e migram para ambientes aquáticos calmos, como lagos e florestas inundadas (Pritchard & Trebbau, 1984). O tracajá é uma das espécies mais consumidas da Amazônia, sendo atualmente a mais procurada e consumida no médio e baixo rio Jaú, cidades de Novo Airão e Manaus (localizadas na bacia do rio Negro), levando a sobre-exploração de adultos, juvenis e ovos para consumo e venda nos mercados (Rebêlo & Pezzuti, 2000). Assim como a maioria das espécies de quelônios, o tracajá é um animal que apresenta maturação sexual tardia e, por isso, uma baixa taxa de renovação de indivíduos (Alfinito, 1973; Pritchard, 1979). Apesar de apresentarem baixa mortalidade de indivíduos adultos, possuem altas taxas de perda de ovos e filhotes (Ernst & Barbour, 1989; IBAMA, 1989). Como características específicas a espécie possui apenas um barbelo sob o maxilar (o que dá o nome da espécie “ unifilis” ), mas esse caracter pode variar e são encontrados indivíduos com o padrão do gênero com dois barbelos (Rueda-Almonacid et al. , 2007); e manchas amarelas na cabeça nos filhotes e machos adultos (Figura 1), enquanto que as fêmeas adultas perdem a coloração, apresentando a cabeça marrom-escura (Ferrara et al. , 2017). As fêmeas adultas da espécie medem entre 350 a 500 mm e os machos entre 250 a 390 mm. São animais de grande importância para os ecossistemas aquáticos e com sua importância nas teias tróficas por atuarem como consumidores herbívoros, de plantas aquáticas, algas, sementes, folhas, frutos, flores, raízes, insetos e moluscos, e são utilizados como recurso alimentares para jacarés, aves e outros animais (Portal et al. , 2002; Vogt, 2008).
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Figura 1: exemplares da espécie Podocnemis unifilis. a) filhote de P. unifilis ; b) macho adulto de P. unifilis. Fonte: Otávio Lino (acervo pessoal).
P. unifilis é uma espécie menos seletiva que a Podocnemis expansa, e pode desovar em praias de areia, em lama semi-seca e barrancos às margens dos rios, lagos e paranás (Fachín- Terán & Von Mülhen, 2006). A nidificação de P. unifilis está relacionada ao ciclo anual de vazante e enchente, sendo que a desova e a incubação são realizadas na época da seca, e o nascimento dos filhotes coincide com o início da enchente (Thorbjarnarson et al. , 1993; Fachín-Terán & Von Mülhen, 2006). A espécie deposita de 11 a 35 ovos em cada desova e o período de incubação dos ovos dura cerca de 45 a 70 dias, estando essa variação relacionada ao local/substrato de desova (Vogt, 2008).
Estudos voltados para a ecologia reprodutiva evidenciaram que filhotes de P.unifilis apresentam determinação sexual dependente da temperatura durante a incubação dos ovos (TSD), estando o predomínio de fêmeas ligado a temperaturas mais altas, e a maior quantidade de machos quando os ovos são incubados em temperaturas mais baixas (Souza & Vogt, 1994). A temperatura de 32°C foi considerada a pivotal para a incubação da espécie em ninhos com temperaturas constantes (Souza & Vogt, 1994), ou seja, temperatura que possibilita o desenvolvimento de 50% de chance dos embriões serem machos e 50% fêmeas. No entanto, pequenas variações em torno dessa temperatura podem afetar a determinação sexual dos embriões (Bull, 1980; Ferreira Júnior, 2009).
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principais espécies protegidas pelos comunitários em ação com o projeto Pé-de-Pincha (Andrade, et al., 2012; Andrade, et al., 2015).
COLETA DOS OVOS
Os ovos foram coletados em outubro de 2018 em parceria com a equipe do Projeto Pé- de-Pincha, na comunidade Granja Ceres (2° 53' 08"S e 57° 03' 34"W), onde o monitoramento das populações de quelônios pelo projeto Pé-de-Pinha foi iniciado em 2004 (Andrade, et al., 2012). Após a identificação do ninho de desova recente de P. unifilis , os ovos foram retirados do ninho, identificados de acordo com o ninho coletado e armazenados em caixas de isopor de 17 litros contendo areia da praia de desova, para evitar que ocorresse movimentação em excesso dos ovos dentro da caixa durante o transporte. Foram coletados e transportados até a cidade de Manaus um total de 100 ovos de P. unifilis para a realização do estudo (SISBIO no 39472-9).
INCUBAÇÃO
O processo de incubação foi realizado em uma incubadora artificial (B.O.D - 342L®) (Figura 2A) na Sala de Cultivo de Plâncton do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia – INPA. Em recipientes plásticos foi adicionado substrato para incubação (vermiculita) umedecido na concentração de 1:1 (1 litro d’água pra 1 kg de vermiculita), posteriormente era retirado o excesso de água (Figura 2B) e os ovos foram distribuídos de forma aleatória nos recipientes que comportavam entre seis e sete ovos (Figura 2C). A vermiculita foi utilizada como substrato de incubação por apresentar elevado poder de retenção hídrica e mantém por muito mais tempo a umidade local (Guimarães, et al., 2017) e por sua eficiência da técnica de incubação artificial de ovos de outros repteis (Durval, et al. , 2016; Souza et al., 2016).
Os ovos foram dispostos na mesma posição em que se encontravam no ninho, sendo está posição também mantida durante o transporte até Manaus. A temperatura usada para a incubação dos ovos foi de 32°C. Porém, durante todo o período de incubação, foram registrados de hora em hora, os dados da temperatura interna da incubadora por meio de sensor remoto de temperatura, Hobo data loggers (Onset™ Computer Corporation), para avaliar as possíveis variações de temperatura durante o experimento. Para manter a umidade no interior da incubadora, foram utilizadas quatro placas de Petri abastecidas com água. O controle de umidade foi feito por um higrômetro interno, e quando necessário era realizava-se
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a pulverização de água sobre o substrato em que os ovos estavam incubados, além do reabastecimento constante das quatro placas de Petri com água.
Figura 2: Incubação dos ovos de Podocnemis unifilis. a) incubadora artificial, b) retirada do excesso de água da vermiculita, c) ovos no recipiente contendo vermiculita.
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