Demonstração da Respiração pelo Método do Indicador, Slides de Energia

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Prática 1.1 - Demonstração da Respiração pelo Método do Indicador

Aula prática fundamentada em Maestri et al. (1995) Fisiologia Vegetal - Exercícios Práticos. Caderno Didático 20, Editora UFV-Viçosa, MG. 91 p.

Fundamentação teórica:

Devido à presença do organismo fermentador e à disponibilidade de substrato respiratório, as maiores atividades respiratórias foram observadas nos tubos de ensaio contendo a suspensão de levedo, especialmente no tubo contendo levedo+sacarose (carboidrato solúvel). A importância do substrato glicolítico (sacarose) foi demonstrada pela reduzida taxa respiratória observada nos tubos que continham levedo+água (sem substrato respiratório) e, também, levedo+adoçante dietético, substância que não atua como um substrato respiratório. Nesses tubos, a respiração foi baixa, pois a disponibilidade de reservas (substrato) se esgotou muito rapidamente nas células do levedo. No tubo de ensaio contendo levedo fervido, a atividade respiratória foi nula, uma vez que a fervura desnaturou as proteínas, impossibilitando qualquer atividade enzimática, inclusive respiratória. Quando comparada ao tubo contendo levedo+sacarose, a respiração observada nos tubos contendo as sementes embebidas e a folha mantida no escuro foi muito menor, o que se explica, em parte, pela adição do substrato respiratório (sacarose), que intensifica a atividade respiratória do levedo. Embora as taxas respiratórias observadas no tubo contendo uma folha destacada e no tubo com as sementes tenham sido menores do que a verificada na presença de levedo+sacarose, análises mais aprofundadas são difíceis de serem feitas, uma vez que foram utilizados materiais biológicos com quantidades de massa e atividades fisiológicas muito distintas. As sementes “secas” apresentaram taxa respiratória menor do que as sementes embebidas, uma vez que elas se encontravam em latência (quiescência), enquanto a embebição, sinal desencadeador da germinação, resulta em reidratação e retomada de atividade metabólica, com aumento na atividade respiratória do embrião e consumo de reservas para o crescimento da plântula. Como a fotossíntese líquida (FSliq), que corresponde à diferença entre a fotossíntese total (FStotal) e o somatório das atividades de respiração (RS) e fotorrespiração (FRS) [FSlíq = FStotal - (RS + FRS)], foi positiva no tubo de ensaio contendo a folha mantida sob iluminação, a coloração do indicador mostrou maior incorporação de carbono via fotossíntese do que sua liberação pelos processos respiratórios, permanecendo com a tonalidade azulada. Em resumo, os resultados desta aula demonstraram a ocorrência de atividade respiratória em diferentes intensidades e materiais biológicos específicos e a importância dos substratos para a respiração. A demonstração foi possível pela observação da mudança na cor do indicador azul de bromotimol (acidificação ou basificação), como consequência da liberação/consumo de CO 2 pela respiração aeróbica e fotossíntese (nos casos das sementes e das folhas). Por sua vez, o levedo é um organismo que realiza respiração por fermentação alcoólica.

Questionário:

1. O que é o azul de bromotimol?

O azul de bromotimol é um indicador de pH que se apresenta verde em meio neutro, azul em meio básico e amarelo em meio ácido e pode, portanto, ser usado para indicar a acidificação de uma fase aquosa pelo CO 2 proveniente da respiração.

2. Comparando-se os resultados dos testes 1 e 2, o que acontece ao CO 2 quando dissolvido em água?

Nos testes 1 (adição de gotas de HCl ou NaOH) e 2 (adição de gotas de água mineral gasosa/não gasosa) ocorreram mudanças na coloração do indicador de pH da cor azul (meio básico), passando pela cor verde (meio neutro) até ficar amarelo (meio ácido), dependendo da quantidade adicionada de cada uma dessas substâncias. O HCl (ácido) e a água mineral gasosa (ácida devido ao CO 2 nela dissolvido) causam alterações na coloração da solução do azul de bromotimol da mesma forma que o CO 2 , proveniente da respiração, causou nos diferentes tratamentos testados na aula prática. Quando o CO 2 é liberado em excesso em um sistema fechado contendo uma fase aquosa, ocorre a acidificação dessa fase, uma vez que o acúmulo de ácido carbônico (H 2 CO 3 ) resulta na liberação de H+^ na solução (devido à dissociação química), conforme representado na equação a seguir.

CO 2 + H 2 O  H 2 CO 3  HCO 3 -^ + H+

3. Explique o resultado do teste 3.

Ao assoprarmos a solução do indicador de pH, utilizando-se de uma pipeta, injetamos ar contendo CO 2 no meio, provocando a acidificação da solução de azul de bromotimol, que passa da cor azul (básica) para a verde (neutra) e, finalmente, para a amarela (ácida).

4. O que aconteceu em comum nos tubos de ensaio em que ocorreram mudanças na coloração do indicador de pH?

O que aconteceu em comum nesses tubos de ensaio foi a ocorrência de respiração aeróbica ou anaeróbica (fermentação). As diferenças observadas durante a execução da aula prática foram resultantes das diferentes intensidades do metabolismo respiratório em cada sistema. Quanto maior a liberação de CO 2 , mais ácida (amarela) ficou a solução de azul de bromotimol.

5. Compare e explique os resultados obtidos nos tubos 2 a 9.

As maiores atividades respiratórias foram observadas nos tubos de ensaio contendo levedo, principalmente no tubo contendo levedo+sacarose, devido à disponibilidade de substrato para o metabolismo respiratório. A importância do substrato glicolítico (sacarose) foi demonstrada pela reduzida taxa respiratória observada nos tratamentos que continham levedo+água e, também, levedo+adoçante dietético, que não é um substrato respiratório. Nesses tubos, a respiração foi baixa, pois a disponibilidade de reservas (substratos) se esgotou rapidamente nas células do levedo. Não foi detectada nenhuma atividade respiratória no tubo de ensaio contendo levedo fervido, uma vez que esse procedimento causou a desnaturação de proteínas e impossibilitou a ocorrência de atividades enzimáticas, inclusive as relacionadas à respiração. Em comparação ao tubo de ensaio contendo levedo+sacarose, a respiração observada nos tubos contendo as sementes embebidas e a folha mantida no escuro foi muito menor, o que se explica pelas diferentes atividades metabólicas inerentes a cada material e pela maior eficiência da respiração aeróbica, com maior produção de ATP do que na fermentação. As sementes “secas” respiraram em menor intensidade do que as sementes embebidas, uma vez que elas se encontravam em latência (quiescência), enquanto a embebição é o sinal do ambiente para o início da germinação, promovendo o aumento da atividade respiratória e,

Bibliografia:

McALEXANDER, S. L. Demonstrating cellular respiration and fermentation (In: https://www.carolina.com/teacher-resources/Interactive/cellular-respiration-and- fermentation/tr10705.tr). Acesso em 19/12/2017. MÜLLER, L. E. Manual de laboratorio de fisiología vegetal. Turrialba: Instituto Interamericano de Cooperacion para la Agricultura ( IICA), 1964. 165 p.

Prática 1.2 - Atividade de Catalases em Tubérculos de Batata

Aula prática fundamentada em Maestri et al. (1995) Fisiologia Vegetal - Exercícios Práticos. Caderno Didático 20, Editora UFV-Viçosa, MG. 91 p.

Fundamentação teórica:

Quando fatias de tubérculos de batata são fervidas ocorre a desnaturação das proteínas e a inativação de todas as enzimas, incluindo as catalases. A formação de espuma (devido à liberação de O 2 ) nas fatias não fervidas dos tubérculos da batata é resultado da ação das catalases sobre o H 2 O 2. As catalases são enzimas pré-existentes relacionadas à decomposição do H 2 O 2 em O 2 e H 2 O e, por isso, encontram-se ativas em todos os tecidos e estádios do desenvolvimento das plantas. Como o processo de respiração aeróbica resulta na formação de EROs, incluindo o peróxido de hidrogênio (H 2 O 2 ), as catalases são de fundamental importância para a proteção celular contra os efeitos danosos dessa substância. A maior evolução de bolhas na periferia das fatias do tubérculo de batata é explicada pela maior atividade metabólica nessa região, uma vez que por esse órgão ser um caule tuberoso, as atividades meristemáticas e respiratórias são mais intensas na periferia (próximo às gemas, córtex e anel vascular) do que nas porções internas da batata (medula), onde predomina o acúmulo de reservas nos amiloplastos na forma de amido. Em resumo, a aula prática demonstrou que a respiração aeróbica, embora fundamental para a sobrevivência dos diferentes organismos e estruturas, também promove a formação de espécies reativas de oxigênio, como o H 2 O 2. Nos tubérculos da batata, o H 2 O 2 formado foi rapidamente eliminado pela ação das catalases, enzimas pré-existentes em praticamente todos os tecidos vivos.

Questionário:

1. Apresente a reação das catalases, indicando o substrato e os produtos.

2 H 2 O 2  Catalase  2 H 2 O + O 2 ↑

O substrato da reação é o H 2 O 2 e os produtos são a H 2 O e o O 2 , que forma as bolhas.

2. Cobrindo-se as fatias de batata com água oxigenada, observou-se maior evolução de bolhas de oxigênio nos tecidos da periferia do que nos tecidos internos. Por quê?

A maior evolução de bolhas na periferia do tubérculo se justifica pela maior atividade metabólica nessa região, uma vez que, por ser um caule tuberoso, as atividades meristemáticas e respiratórias são mais intensas na periferia (próximo às gemas, córtex e anel vascular) do que nas porções internas (medula), onde predomina o acúmulo de amido nos amiloplastos.

3. Que diferenças existem entre as catalases, as peroxidases e as desidrogenases quanto às reações que elas catalisam?

Essas três enzimas estão relacionadas às atividades oxidativas e antioxidativas celulares. Todavia, as catalases apresentam o H 2 O 2 como substrato, liberando H 2 O e O 2 como produtos. Já as peroxidases utilizam o H 2 O 2 como agente oxidante de determinados compostos orgânicos, especialmente dos compostos fenólicos. As desidrogenases, por sua

Prática 2.1 - Atividade Desidrogenativa em Sementes

Aula prática fundamentada em Maestri et al. (1995) Fisiologia Vegetal - Exercícios Práticos. Caderno Didático 20, Editora UFV-Viçosa, MG. 91 p.

Fundamentação teórica:

A fervura das sementes causou a desnaturação das enzimas e, portanto, inativou as desidrogenases. Essas enzimas ocorrem nas regiões vivas dos tecidos e, por isso, o teste do tetrazólio é empregado em laboratórios de análise de sementes visando avaliar-se a capacidade de germinação das sementes. Esse teste pode ser empregado para a detecção de viabilidade (respiração) em qualquer tecido vivo. Todavia, a sua aplicação na avaliação da viabilidade e vigor de sementes exige o estabelecimento prévio de padrões, obtidos a partir de estudos morfológicos (anatômicos) das estruturas das sementes, visando identificar as porções em que manutenção da viabilidade é fundamental. O teste realizado em aula prática também pode ser usado para se observar diferenças morfofisiológicas entre as sementes de mono- e de eudicotiledôneas. Nas monocotiledôneas (milho), as partes vivas das sementes são o embrião e o escutelo, sendo o endosperma 3n (albúmen) um tecido sem atividade de desidrogenases. Nas eudicotiledôneas (feijão), o embrião e os cotilédones são tecidos vivos e, portanto, ambos apresentam resposta positiva ao tetrazólio (aparecimento de coloração vermelha). Em resumo, a aula prática demonstrou a ocorrência in situ da atividade das desidrogenases, importantes enzimas respiratórias cuja ação está diretamente relacionada à síntese de poder redutor (NAD(P)H), utilizado na cadeia de transporte de elétrons. A aula prática permitiu a verificação in situ da ocorrência de atividade metabólica e a viabilidade dos tecidos, sendo de utilidade prática em laboratórios de análise de sementes. O teste do tetrazólio é uma técnica que tem, como base, diferentes conceitos relacionados à respiração.

Questionário:

1. O teste do tetrazólio é específico para se determinar a atividade de que tipo de enzima?

O teste do tetrazólio, utilizando-se o cloreto de trifeniltetrazólio (TTC), é específico para se determinar a atividade das desidrogenases, enzimas importantes da respiração.

2. Por que o teste do tetrazólio pode ser usado para indicar a vitalidade de sementes?

As desidrogenases podem transferir elétrons para compostos orgânicos não encontrados em organismos vivos como, por exemplo, para sais de tetrazólio. Com o uso do tetrazólio é possível demonstrar a ocorrência “ in situ ” da atividade das desidrogenases, uma vez que o tetrazólio, na forma reduzida, é insolúvel e se precipita como trifenil-formazana (coloração vermelha) nos tecidos onde essas enzimas ocorrem. A atividade das desidrogenases é considerada sinal de vitalidade dos tecidos vegetais e, no caso de sementes, pode ser utilizada para indicar sua germinabilidade.

3. Quais regiões das sementes se colorem de vermelho?

Nas monocotiledôneas (milho) as partes vivas das sementes são o embrião (2n) e o escutelo (2n), sendo o endosperma 3n (albúmen) um tecido sem atividades de desidrogenases.

Nas eudicotiledôneas (feijão), o embrião e os cotilédones são tecidos vivos e, portanto, ambos se colorem pela ação das desidrogenases sobre o tetrazólio. Quando os grãos são fervidos a coloração vermelha fica fraca (tempo de fervura reduzido) ou não aparece (tempo de fervura longo), pois a fervura desnatura as proteínas e enzimas, dentre elas as desidrogenases, causando a morte do embrião e das outras partes vivas das sementes.

4. Descreva a reação que leva ao aparecimento da coloração vermelha nos tecidos das sementes.

Quando os sais de tetrazólio encontram-se oxidados eles são incolores. Todavia, a coloração vermelha aparece quando os sais de tetrazólio tornam-se reduzidos pela ação das desidrogenases presentes nos tecidos das sementes.

Tetrazólio oxidado (solúvel e incolor) + AH 2  desidrogenases  Tetrazólio reduzido (insolúvel e vermelho)

5. As zonas meristemáticas de raízes vivas apresentam reação positiva ao teste do TTC e partes suberosas de raízes velhas dão resultado negativo a esse tipo de teste. Explique essas diferenças nas respostas.

As desidrogenases encontram-se ativas e em grandes quantidades nas zonas meristemáticas de raízes vivas devido à intensa respiração e atividade metabólica nesses tecidos. Por esse motivo, o teste de TTC apresenta resultado positivo nessa região. Em contraste, em raízes suberosas e velhas, esses tecidos estão mortos e, portanto, as desidrogenases não estão mais ativas.

6. Apresente exemplos de quatro desidrogenases.

Malato desidrogenase, succinato desidrogenase, isocitrato desidrogenase e piruvato desidrogenase.

7. Escreva a equação geral para a ação das desidrogenases e os substratos e produtos da malato desidrogenase****.

[BH 2 (substrato reduzido) + A (aceptor oxidado)  Desidrogenases  B (produto oxidado) +AH 2 (aceptor reduzido)] Malato desidrogenase [Malato + NAD+^ Oxaloacetato + NADH]

8. Qual é a importância das desidrogenases no processo respiratório?

A respiração aeróbica é um processo de oxidação que envolve a retirada de elétrons e de hidrogênios de determinados intermediários metabólicos, culminando com a transferência desses elétrons ao oxigênio, com a formação de água. Esse processo oxidativo libera gradativamente grandes quantidades de energia, que é utilizada para a produção de ATP, coenzima fundamental para a manutenção e crescimento dos organismos. A remoção dos elétrons é catalisada por diferentes desidrogenases, que ocorrem nas etapas da glicólise/rota das pentoses monofosfato, no ciclo de Krebs e na CTE. Os elétrons não são transferidos diretamente das desidrogenases para o oxigênio, mas para as coenzimas NAD+^ (formando NADH) ou FAD (formando FADH 2 ), utilizadas como poder redutor (fonte de elétrons) na CTE da respiração.

Prática 2.2 - Efeitos da Qualidade da Luz na Germinação de Sementes

Fotoblásticas

Aula prática fundamentada em Maestri et al. (1995) Fisiologia Vegetal - Exercícios Práticos. Caderno Didático 20, Editora UFV-Viçosa, MG. 91 p.

Fundamentação teórica:

As sementes de fumo, quando recém-colhidas, apresentam fotoblastismo positivo e somente germinam se forem mantidas sob as luzes branca ou vermelha, uma vez que, nessas condições, o fitocromo vermelho (FV) se transforma em fitocromo vermelho-longo (FVE), que corresponde à forma biologicamente ativa. Nas sementes fotoblásticas positivas, uma elevada relação FVE/FV é o sinal para que ocorra no embrião e no escutelo a síntese de giberelinas naturais (GA 1 ), fitormônios responsáveis pelo estímulo à síntese das enzimas hidrolíticas e fosforolíticas envolvidas na quebra das reservas, possibilitando o aumento da respiração e, consequentemente, a germinação das sementes. No escuro e sob iluminação na faixa do vermelho-longo, predomina a forma FV do fitocromo (relação FVE/FV baixa), que é inativa para a germinação. Nas sementes fotoblásticas positivas, além da embebição, a predominância da forma FVL do fitocromo é condição fundamental para que a germinação aconteça, proporcionando um ajuste fino no processo germinativo, o que pode aumentar as chances de sucesso no estabelecimento das plântulas. A ocorrência de germinação das sementes de fumo no escuro se deu apenas na presença de GA 3 , mostrando a importância da síntese de giberelinas naturais no início da cascata de eventos que também conta com a participação da luz, do fitocromo e de enzimas hidrolíticas e fosforolíticas. Esses eventos parecem ser comuns à germinação de sementes fotoblásticas positivas. Em resumo, a aula prática demonstrou a importância da qualidade da radiação luminosa na germinação de sementes fotoblásticas positivas, além da contribuição do fitocromo, como molécula sinalizadora, e das giberelinas, como substância reguladora do processo germinativo.

Questionário:

1. Qual é o pigmento envolvido na germinação das sementes fotoblásticas e quais são os comprimentos de onda mais efetivos para ativação desse processo?

O pigmento envolvido é o fitocromo, uma cromoproteína que se apresenta sob duas formas fotoconversíveis, o Fv e o FVL. Os comprimentos de onda mais efetivos para as fotorreversões são o vermelho (660 nm; para o Fv) e o vermelho-longo (730 nm; para o FVL). A radiação na faixa do vermelho estimula a germinação, enquanto no vermelho-longo inibe o processo, conforme esquema a seguir:

( Forma inativa ) FV (660 nm) Luz.vermelho longo

Luz.vermelha  

 FVL(730 nm) ( Forma biologicamente ativa )

2. Por que as sementes de fumo, utilizadas na aula, praticamente não germinaram no escuro?

Porque as sementes de fumo utilizadas no ensaio eram recém-colhidas e apresentavam fotoblastismo positivo. Nessa condição, para germinar, além da embebição, elas exigem a

predominância da forma fisiologicamente ativa do fitocromo (FVL). Todavia, no escuro, predomina a forma inativa (FV) do fitocromo, que inibe a germinação. Geralmente, sementes pequenas e com reduzida quantidade de reservas, quando recém-colhidas, são fotoblásticas positivas e exigem luz para germinação, condição essencial para a síntese de giberelinas naturais que, por sua vez, estimulam a produção das enzimas hidrolíticas/fosforolíticas envolvidas na quebra das reservas armazenadas no endosperma. Adicionalmente, a luz, com a participação do fitocromo, também pode estimular a conversão de giberelinas inativas em suas formas ativas.

3. Explique de que maneira a luz pode desencadear a germinação de sementes fotoblásticas positivas.

Nas sementes fotoblásticas positivas, além da embebição, a luz também é necessária para que a germinação ocorra, pelo menos enquanto as sementes estão novas (recém- colhidas). Após a embebição das sementes, ao receberem estímulo luminoso, o fitocromo vermelho (FV) transforma-se em fitocromo vermelho longo (FVL). Este é o sinal para que ocorra a síntese de giberelinas naturais ou a sua conversão em formas ativas. As giberelinas são responsáveis pelo estímulo à síntese das enzimas hidrolíticas/fosforolíticas envolvidas na quebra de reservas e, consequentemente, na germinação das sementes, especialmente em espécies que possuem sementes pequenas e com reduzida quantidade de reservas.

4. Algum grupo de fitormônio pode substituir a luz na germinação de sementes fotoblásticas positivas?

Sim. Em sementes de certas espécies, o ácido giberélico (GA 3 ) ou outras giberelinas (GA 4 , GA 7 , etc.), podem estimular, mesmo no escuro, a síntese das enzimas hidrolíticas/fosforolíticas envolvidas na quebra das reservas, promovendo a germinação.

5. Se as sementes forem colocadas para germinar em total obscuridade e se essa condição for interrompida com a ligação de uma luz vermelha, o que acontecerá? E se a iluminação for com luz vermelho-distante?

Na presença de luz vermelha haverá aumento na quantidade de fitocromo FVL, forma biologicamente ativa, favorecendo a síntese de giberelinas e de enzimas hidrolíticas/fosforolíticas, resultando na quebra das reservas e, consequentemente, na germinação. Com iluminação de vermelho longo, não haverá germinação, pois predominará a forma FV do fitocromo, que é biologicamente inativa, não havendo síntese de giberelinas e das enzimas necessárias ao processo germinativo.

6. Apresente exemplos de espécies de interesse comercial que possuem sementes fotoblásticas positivas.

Alface, fumo, alfavaca, alpiste, espécies forrageiras (braquiárias, capim colonião, etc.), dentre outras. Geralmente, espécies que possuem sementes muito pequenas e com pouca quantidade de reservas, quando recém-colhidas, são fotoblásticas positivas. A exigência por luz evita que elas germinem no escuro ou quando se encontram completamente soterradas, o que pode comprometer o estabelecimento das suas plântulas. Todavia, a exigência por luz é perdida à medida que elas envelhecem.

ser alteradas e favoreçam o estabelecimento das plântulas. Em muitos casos, as espécies que possuem sementes fotoblásticas positivas são espécies pioneiras. Por sua vez, espécies que possuem sementes fotoblásticas negativas e que somente germinam no escuro, têm esse fenômeno provocado pela morfologia de seu tegumento. Essa resposta, aparentemente, não é relacionada a qualquer adaptação ecológica nessas espécies. Em sementes de maxixe ( Cucumis anguria ), por exemplo, o tegumento atua como filtro de radiação, aumentando a quantidade de radiação VL que alcança o interior da semente, estimulando o acúmulo de fitocromo em sua forma inativa (FV). A escarificação das sementes de maxixe elimina os efeitos da filtração causados pelo tegumento, possibilitando a germinação mesmo em presença de luz.

Bibliografia:

BORTHWICK, H. A; HENDRICKS, S. B.; TOOLE, E. H.; TOOLE, V. K. Action of light on lettuce-seed germination. Botanical Gazette , v. 115, n. 3, p. 205-225, 1954. FELIPPE, G. M.; VÁLIO, I.F.M.; PEREIRA, M.F.A.; SHARIF, R.R.; SANTOS, S.R.V. Fisiologia do desenvolvimento vegetal. 2nd. Ed. Campinas: Unicamp, 1985. 66 p. FERRI, M. G.; ANDRADE, M. A. B.; LAMBERTI, A. Botânica: Fisiologia - curso experimental , 2ª. Ed. São Paulo: Editora Nobel, 1987. 116 p. HENDRICKS, S. B.; BORTHWICK, H. A. The function of phytochrome in regulation of plant growth. PNAS , v. 58, n. 5, p. 2125-2130, 1967. IKUMA, H.; THIMANN, K. V. Action of gibberellic acid on lettuce seed germination. Plant Physiology , v. 35, n. 5, p. 557-566, 1960. ROSS, C.W. Plant physiology laboratory manual. Belmont: Wadsworth Publishing Company, 1974. 200 p. SCHEIBE, J.; LANG, A. Lettuce seed germination: evidence for a reversible light-induced increase in growth potential and for phytochrome mediation of the low temperature effect. Plant Physiology , v. 40, n. 3, p. 485-492, 1965.

Prática 2.3 - Escarificação de Sementes e Quebra da Dormência

Fundamentação teórica:

A dormência se caracteriza pela incapacidade de germinação das sementes, mesmo sob condições ambientais favoráveis. O conceito de dormência difere da quiescência, que se caracteriza pela não germinação das sementes devido à falta de algum fator ambiental necessário à ativação do processo. A dormência é comum em espécies não domesticadas. Entretanto, é indesejável em sementes de espécies agrícolas (domesticadas e/ou melhoradas), que são selecionadas para germinar rapidamente logo após a embebição. A dormência pode ter origem na casca (tegumento), no embrião ou no endosperma (dormência interna), ou ser causada por ambos. As sementes podem apresentar casca dura ou impermeável, rica em esclereídeos, tricomas e/ou ceras (materiais hidrofóbicos), que endurecem a estrutura e/ou impedem a embebição. A escarificação é o procedimento utilizado para eliminar essa causa de dormência, podendo ser realizada, principalmente, pelo tratamento das sementes com ácidos (química), com água quente (térmica), com impactos e lixas (mecânica). Dos materiais utilizados na aula prática, a mamona e o milho são espécies cultivadas, cujas sementes germinam mesmo sem escarificação, uma vez que elas não apresentam dormência. Por sua vez, as sementes de sabão-de-soldado, espécie não domesticada, apresentam casca dura e, por isso, a sua germinação foi estimulada pela escarificação mecânica. Em resumo, esta aula prática mostrou a ocorrência de dormência em sementes de uma espécie não domesticada. A dormência apresenta implicações ecológicas que contribuem para proteção das plantas contra a germinação das sementes sob condições ambientais adversas, além de aumentar a possibilidade de dispersão, reduzindo a competição intraespecífica.

Questionário:

1. O que difere uma semente dormente de uma semente quiescente?

Uma semente verdadeiramente dormente não germina mesmo que as condições ambientais favoráveis ao processo estejam disponíveis. O conceito de dormência difere do conceito de quiescência, que, por sua vez, se caracteriza pela não germinação das sementes em decorrência da falta de algum fator abiótico necessário à ativação do processo. Por exemplo, uma semente quiescente germina assim que sofrer embebição, o que não acontece com uma semente dormente.

2. Qual é a importância ecológica da dormência nas sementes?

As sementes representam a melhor forma de preservação e perpetuação das espécies em diferentes condições ambientais, especialmente em situações em que a planta, após a germinação, não conseguiria sobreviver. As sementes toleram condições de seca, de fogo, de temperaturas elevadas e de congelamento, entre outras condições abióticas desfavoráveis. Portanto, a dormência impede a germinação sob condições adversas, além de possibilitar a dispersão e, dessa forma, reduzir a competição intraespecífica.

Prática 3.1 - Pigmentos Hidrossolúveis e Lipossolúveis em Tecidos Vegetais

Aula prática fundamentada em Maestri et al. (1995) Fisiologia Vegetal - Exercícios Práticos. Caderno Didático 20, Editora UFV-Viçosa, MG. 91 p.

Fundamentação teórica:

A adição de água e o posterior acréscimo de éter etílico ao funil de separação resultaram no estabelecimento de duas fases de baixa miscibilidade, demonstrando que, mesmo em folhas coloridas (vermelhas, azuis, etc.), os pigmentos fotossintéticos também se encontram presentes. Embora mascarados pelos pigmentos hidrossolúveis (antocianinas ou betalaínas) acumulados no vacúolo, as clorofilas e os carotenoides encontram-se integrados às membranas dos tilacoides, exercendo as suas funções na fotossíntese. As mudanças de coloração nas soluções provenientes da fase inferior do funil de separação confirmaram a presença de pigmentos flavonoides (antocianinas e betalaínas), cuja coloração é dependente do pH. Por sua vez, o aparecimento de coloração verde na fase inferior do tubo de ensaio contendo água e pigmentos totais, onde foram adicionadas gotas de KOH, é explicado pela quebra das ligações éster das moléculas das clorofilas, entre o tetrapirrol (cromóforo) e a cauda do álcool fitol. Como a coloração das clorofilas é devida ao tetrapirrol e essa porção é polar (hidrofílica), ela tem maior afinidade pela água (fase inferior) do que pelo éter (fase superior). Após a adição do KOH ao tubo de ensaio contendo água e solução de pigmentos totais, ficaram na fase superior as moléculas de clorofilas que não foram quebradas, os carotenoides e as caudas do álcool fitol liberadas após a quebra da ligação éster pelo tratamento das moléculas de clorofila com o KOH. Em resumo, a aula prática demonstrou que os pigmentos fotossintéticos são lipossolúveis, mas que a coloração verde característica de algumas folhas pode ser mascarada pela presença de outros pigmentos não fotossintéticos e hidrossolúveis (flavonoides), armazenados nos vacúolos.

Questionário:

1. Considerando-se as propriedades gerais de solubilidade dos pigmentos dos cloroplastos das fanerógamas, seria provável a sua presença nos vacúolos de folhas fotossintetizantes? Em algum outro grupo fotossintetizante isso é conhecido?

Não, pois nas fanerógamas esses pigmentos são lipossolúveis. Eles apresentam baixíssima afinidade por solventes polares, condição predominante no vacúolo devido à água e à grande quantidade de íons armazenados nessa organela. Todavia, embora sejam pigmentos hidrossolúveis, as ficocianinas e as ficoeritrinas encontram-se presentes nos cloroplastos de algas vermelhas e associados aos tilacoides das algas azuis.

2. Quais são os pigmentos lipossolúveis das plantas verdes? Onde eles se localizam nas células?

Os pigmentos lipossolúveis das plantas verdes são as clorofilas a e b e os carotenoides (carotenos e xantofilas). Esses pigmentos se localizam nos cloroplastos, mais especificamente nas membranas lipoproteicas dos tilacoides, fazendo parte das antenas dos fotossistemas.

3. Quais são os pigmentos hidrossolúveis das plantas verdes e em que parte das células eles se encontram?

Esses pigmentos correspondem aos flavonoides, com destaque para as antocianinas e betalaínas. Esses pigmentos encontram-se dissolvidos em água na solução vacuolar.

4. O que é possível concluir com o resultado da quebra da ligação entre o tetrapirrol e a cauda fitol das moléculas de clorofilas pelo KOH 3N?

Que as moléculas de clorofilas somente se ligam às membranas dos tilacoides devido a sua porção apolar (cauda do álcool fitol) e que a sua coloração é devida ao tetrapirrol (porção cromofórica).

5. Por que é possível afirmar, com certeza, que as antocianinas não participam da fotossíntese?

Por que esses pigmentos encontram-se armazenados nos vacúolos e não nos cloroplastos, impossibilitando a sua participação direta na fotossíntese. Todavia, a sua contribuição para a proteção do aparelho fotossintético não pode ser desprezada, contribuindo como filtros da radiação ultravioleta, prejudicial aos pigmentos envolvidos na fotossíntese.

6. Quais são as funções dos flavonoides (antocianinas e betalaínas) nos tecidos vegetais?

Além de sua importância como atrativo para insetos e outros polinizadores, os flavonoides também afetam o modo pelo qual as plantas interagem com outros organismos, como, por exemplo, com as bactérias simbióticas, que vivem no interior das raízes de leguminosas e com microorganismos fitopatogênicos. Os flavonoides também têm sido utilizados como marcadores, na quimiotaxonomia, além de apresentarem reconhecida atividade antioxidante. Sua ação direta na fotossíntese não é provável, embora estejam comumente associados à proteção do aparelho fotossintético contra os danos provocados pela radiação ultravioleta.

7. Por que certos frutos ficam mais vermelhos quando exposto à luz solar?

Porque os níveis elevados de radiação luminosa, que se tornam disponíveis quando os frutos são expostos à luz do sol, são fatores que estimulam o acúmulo de antocianinas.

8. Se você fizesse um extrato de pétalas de uma flor vermelha, que tipo de pigmento seria encontrado ao fazer sua separação por partição em solventes? O que aconteceria se você alterasse o pH das soluções?

Na fase inferior do sistema de separação, seriam encontrados pigmentos hidrossolúveis (flavonoides), como as antocianinas. A coloração das soluções variaria de acordo com a mudança do pH do extrato de pétalas. Em se tratando de pétalas, o mais comum é a presença de pigmentos hidrossolúveis. Todavia, caso existissem pigmentos carotenoides vermelhos nas pétalas, a fase superior também poderia se manter avermelhada, uma vez que esses pigmentos são lipossolúveis.

Prática 3.2 - Separação dos Pigmentos Cloroplastídicos por Cromatografia

em Papel

Aula prática fundamentada em Maestri et al. (1995) Fisiologia Vegetal - Exercícios Práticos. Caderno Didático 20, Editora UFV-Viçosa, MG. 91 p.

Fundamentação teórica:

A separação dos pigmentos é explicada pelas diferentes afinidades que cada um deles apresenta pelas fases móvel (tetracloreto de carbono) ou estacionária (água do papel) do sistema. Como os pigmentos apresentam diferentes estruturas químicas, os mais apolares são mais arrastados pela fase móvel, ficando mais distanciados da origem. O grau de apolaridade dos pigmentos varia na seguinte ordem: carotenos (mais apolares), xantofilas, clorofila a e clorofila b (menos apolares). A ordem de separação dos pigmentos no cromatograma segue essa ordem. Como os carotenos são hidrocarbonetos (apolares), eles se distanciam mais da origem, sendo o mais arrastado pelo tetracloreto. As xantofilas, hidrocarbonetos oxigenados, localizam-se abaixo dos carotenos, havendo um espaço entre eles. Mais abaixo e distanciadas das xantofilas, localizam-se as duas clorofilas. Devido à presença do radical metil (-CH 3 ; apolar) apolar na sua molécula, a clorofila a localiza-se ligeiramente mais distanciada da origem do que a clorofila b , que, em contraste, apresenta o radical aldeído (-CHO; polar) na sua estrutura. Como essa é a única diferença entre as estruturas das clorofilas a e b , as bandas correspondentes a elas geralmente não se separam no cromatograma. Em resumo, a aula prática demonstrou que pelo menos quatro diferentes tipos de pigmentos relacionados à fotossíntese são encontrados em folhas de angiospermas: clorofila a , clorofila b , carotenos e xantofilas. Esses pigmentos se separaram em função de seus diferentes níveis de apolaridade e de afinidade pelos solventes presentes no sistema (água e tetracloreto de carbono), o que determinou suas diferentes posições no cromatograma.

Questionário:

1. Descreva as principais características das estruturas moleculares dos pigmentos dos cloroplastos e compare esses pigmentos quanto as suas polaridades.

Clorofilas - As moléculas da clorofila a são constituídas por um anel tetrapirrólico de cadeia fechada, contendo um átomo de magnésio no centro do tetrapirrol. As moléculas de clorofila a apresentam no anel 2 um radical metil (-CH 3 ), o que as difere das moléculas de clorofila b que, nesse anel, apresentam um radical aldeído ou formil (-CHO). Essa é a única diferença entre as moléculas das clorofilas a e b. Carotenoides - Os carotenoides constituem um grupo de pigmentos que incluem principalmente os carotenos e as xantofilas. Os carotenos são hidrocarbonetos, enquanto as xantofilas (zeaxantina, anteraxantina e violaxantina) são hidrocarbonetos que contém alguns átomos de oxigênio nas suas moléculas. Pelas diferenças entre as estruturas químicas, pode-se concluir que os carotenoides são mais apolares do que as clorofilas.

2. Como é explicada a separação dos pigmentos pela cromatografia em papel, considerando-se a estrutura molecular de cada composto?

Os pigmentos que participam da fotossíntese são predominantemente apolares, estando associados às porções lipídicas das membranas dos tilacoides. Cada tipo de pigmento tem

uma estrutura química definida, o que determina uma apolaridade maior ou menos intensa. A separação dos pigmentos na cromatografia em papel ocorre devido a maior afinidade dos pigmentos ou pela água do papel (fase estacionária; polar; associada às microfibrilas de celulose) ou pelo tetracloreto de carbono (fase móvel; solvente orgânico apolar adicionado no fundo da cuba). Quanto maior a afinidade do pigmento pela fase estacionária (água), menor será a sua movimentação na tira de papel. Em contraste, quanto mais apolar for o pigmento e, consequentemente, maior for a sua afinidade pelo tetracloreto de carbono (fase móvel), mais arrastado ele será na tira de papel e mais distante ele ficará da origem do cromatograma.

3. Por que as clorofilas a e b quase sempre não se separam na cromatografia em papel 

As clorofilas a e b possuem estruturas moleculares muito parecidas e, por isso, possuem afinidades pela água e pelo tetracloreto de carbono muito próximas, dificultando a sua completa separação na cromatografia de papel.

4. Identifique as fases estacionária e móvel do sistema cromatográfico. Explique como elas atuam na separação dos pigmentos.

A água corresponde à fase estacionária, que se encontra adsorvida às microfibrilas de celulose do papel (matriz). Os pigmentos menos apolares têm maior afinidade pela água, ficando mais retidos à matriz da tira de papel, o que dificulta o seu distanciem da origem. O tetracloreto de carbono corresponde à fase móvel e pelo fato de ser um solvente orgânico apolar, tem maior afinidade pelos pigmentos mais apolares, carregando os mesmos para regiões mais distanciadas da origem na tira de papel-filtro.

5. Na cromatografia, caracterize os termos  “origem”, “frente” e “valor Rf”.

A origem corresponde ao local marcado na base da tira de papel-filtro onde as camadas de extrato dos pigmentos foliares são aplicadas. A frente corresponde à posição máxima alcançada pelo tetracloreto de carbono na tira de papel-filtro e, no caso da cromatografia de pigmentos da fotossíntese, se encontra no limite da banda do pigmento mais afastado da origem (pigmento mais apolar; β -caroteno). O valor Rf ( R etardation f actor; R etention f actor ), ou fator de atraso, corresponde à relação entre a distância percorrida pela banda contendo cada um dos pigmentos e a distância máxima percorrida pela fase móvel (frente) no cromatograma. O Rf pode ser utilizado para a identificação de substâncias, pigmentos, etc., pela comparação dos valores do Rf da amostra com valores Rf de padrões autênticos conhecidos.

6. Quais são as principais características dos cloroplastos relacionadas à fase fotoquímica da fotossíntese?

Os cloroplastos, organelas vegetais responsáveis pela fotossíntese, apresentam estrutura constituída por dupla membrana (envelope do cloroplasto), pela matriz (estroma) e por membranas internas, que formam os tilacoides, constituídos por um sistema de vesículas achatadas. Os tilacoides apresentam membranas lipoproteicas cuja composição química difere bastante das membranas do envelope. Os tilacoides apresentam maior proporção de ácidos graxos polinsaturados em suas membranas, o que confere a elas alta fluidez, mas, em contraste, elevada sensibilidade a danos causados por espécies reativas de oxigênio (EROs). A estrutura das membranas dos tilacoides favorece a captura da energia radiante, uma vez que os pigmentos da fotossíntese encontram-