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Este documento discute sobre os fatores de virulência e resistência antimicrobiana de escherichia coli associada a enterite em suínos. Os fatores citados incluem fímbiras f4, f5, f6, f18, f41, toxinas st, lt e stec. O documento também detalha as características de e. Coli que infectam suínos, os tipos de infecções intestinais causadas por e. Coli enterotoxigênica (etec), as toxinas produzidas por etec e as consequências econômicas da colibacilose entérica em suínos.
O que você vai aprender
Tipologia: Esquemas
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Bruno Aleir da Cruz Colibacilose suína, patogenia, diagnóstico e tratamento: o que há de novo? Curitibanos, SC 2019
Bruno Aleir da Cruz Colibacilose suína, patogenia, diagnóstico e tratamento: o que há de novo? Trabalho Conclusão do Cursode Graduação em Medicina Veterinária do Centro de ciências rurais daUniversidade Federal de Santa Catarina como requisito para a obtenção do título de Bacharel em Medicina Veterinária em 26/11/ Orientador: ProfDr. Álvaro Menin Curitibanos, SC 2019
Bruno Aleir da Cruz Colibacilose suína, patogenia, diagnóstico e tratamento: o que há de novo? Este Trabalho Conclusão de Curso foi julgado adequado para obtenção do Título de Médico Veterinário e aprovado em sua forma final pelo Curso Medicina Veterinária Curitibanos, 26 de Novembro de 2019.
Prof. Alexandre de Oliveira Tavela, Dr. Coordenador do Curso Banca Examinadora:
Prof.(a) Álvaro Menin, Dr. Orientador Instituição UFSC
Prof. Adriano Tony Ramos, Dr. Avaliador Instituição UFSC
Profa.Aline Félix SchnneiderBedin, Dra. Avaliadora Instituição UFSC
Primeiramente agradeço a Deus, por todas as bênçãos concedidas durante minha vida. Ao meu pai, AleirJosé da Cruz, por ser minha fonte de inspiração e força durante todos os momentos em que passei para chegar até aqui. À minha querida mãe Roseli de Fátima Sell da Cruz mesmo que la do céu sempre me confortou em momentos difíceis, e me deu a dádiva da vida. As minhas irmãs Regiane Aline Sell da Cruz Monteiro e Patrícia Regina Sell da Cruz, por serem meus exemplos, e pelos melhores conselhos que já recebi. A minha afilhada Luiza Monteiro, por me contagiar com todo seu amor e doçura desde sua chegada. Ao meu cunhado André Ayres Monteiro, por toda a ajuda que já me deu. À Minha madrinha Maria Justina Conceição Silva, por todos seus conselhos e “puxões de orelha” dados a mim. Ao meu orientador Prof. Dr. Álvaro Menin, por todos os ensinamentos a mim repassados, todas as oportunidades concedidas para minha evolução dentro da graduação, e por ser um profissional exemplar. Aos professores doutores Adriano Tony Ramos e Aline Félix Schenneider Bedin, pelas oportunidades de executar pesquisas e estágios durante a graduação. Aos meus companheiros/irmãos de república Isabella Talita Sousa Dias, Ingrid Maira Freitas e Tiago Reis Nascimento pelo companheirismo e parceria durante os 4 anos e meio que morei em Curitibanos. A meus demais familiares que sempre me incentivaram. Aos amigos da turma e da vida que sempre nos apoiamos em momentos bons ou ruins. Enfim obrigado a todos que de alguma forma sempre me ajudaram a conquistar meus objetivos.
This work has as its general objective a bibliographic review about swine colibacillosis addressing current aspects about the pathogenesis, diagnosis and treatment. E. coli infection occurs through ingestion, associated with environmental and host predisposing factors. Among the virulence factors of enterotoxigenic isolates of E. coli associated with enteritis in swine, F4, F5, F6, F18, F41, ST, LT and STEC toxins among other factors are mentioned. The diagnosis of enteric colibacillosis is based on: bacteriological examination of luminal samples (first choice), primarily ileum or rectal swabs. Antibiotic therapy is required in many cases of enteric colibacillosis as an alternative for infection control, however antimicrobial therapy should allow safe and long-lasting therapeutic concentrations of the antibiotic in the intestinal lumen. Colibacillosis presents a challenging disease of great impact to the pig chain requiring modern and efficient control and prevention strategies. Keywords: Escherichia coli. Diarrhea. Antimicrobials.
Figura 1: Ciclo da colibacilose entérica ................................................................................... 19 Figura 2: F4 isolado do conteúdo intestinal de um suíno com DPP. A imagem mostra uma cultura pura de E. coli hemolítico em ágar sangue .................................................................... 21 Figura 3: Fluxograma para amostragem de colibacilose entérica (neonatal e pós-desmame) em suínoss ...................................................................................................................................... 22 Figura 4: Imagens imuno-histoquímicas anti- Escherichia coli de seções do intestino delgado de suínos. (A) Controle negativo mostrando ausência de imunocoloração para E. coli. (B) Áreas focais leves de imunocoloração (até 25% da seção). (C) Áreas multifocais moderadas de imunocoloração (26% a 75% da seção). (D) Imunomarcação difusa marcada com múltiplos coccobacilos aderidos à superfície do enterócito e cobrindo as vilosidades (superior a 80% da seção). Coloração com hematoxilina de Mayer (A), Imuno-histoquímica (AEC usada) e coloração com hematoxilina de Mayer (B-D). 40 × (A – D). .................................................. 24 Figura 5: Procedimento de aplicação intraperitoneal em leitão neonato. ................................. 25 Figura 6: Etapas no início, gerenciamento e reavaliação da antibioticoterapia em um surto de colibacilose entérica ................................................................................................................. 26
AIDA - Adesina envolvida na adesão difusa cGMP - Monofosfato de guanosina cíclico EAST1 – Enterotoxina enteroagregativa de E. coli estável ao calor DE - Doença edema DPP- Diarreia pós-desmame EPEC - Escherichia coli enteropatogênico ETEC - Escherichia coli enterotoxigênica ID – Intestino delgado LPS - Lipopolissacarídeo LT - Toxina lábil ao calor PBPs- Proteína de ligação à penicilina PCR - Reação em cadeia da polimerase STa- Toxina estável ao calor a STb - Toxina estável ao calor b STEC - Toxina Shiga E.coli Stx2e - Toxina Shiga
16 Durante a multiplicação as bactérias produzem uma ou mais enterotoxinas como STa, STb e LT. Em receptores específicos do epitélio intestinal essas exotoxinas e ativam enzimas como guanilciclase e adenilciclase, resultando no incremento da concentração intracelular do AMP cíclico, causando aumento na transferência de bicarbonato de sódio e de água das células ao lúmen intestinal. Esse aumento no fluxo secretório leva ao quadro de diarreia. Como consequência, pode ocorrer desidratação, hemo-concentração, acidose metabólica e morte (BARCELLOS, 2007). Na Medicina Veterinária, o uso intensivo de antimicrobianos pode resultar na seleção de bactérias resistentes, tornando a ação dos princípios ativos menos eficazes (VAZ, 2009).E permitindo que bactérias patogênicas se adaptem ao ambiente competitivo (BECEIRO, TOMÁS & BOU, 2013). A associação de fatores de virulência e resistência a antibióticos são importantes mecanismos necessários para sobrevivência das bactérias sob condições adversas (BECEIRO, TOMÁS & BOU, 2013). Diversos estudos analisaram a distribuição de fatores de virulência e perfil de susceptibilidade em ETEC isoladas de suínos (ALMEIDA et al ., 2007). A eficácia da terapia antimicrobiana depende da capacidade do patógeno responder à terapia antimicrobiana, das características de exposição ao medicamento e da capacidade de atingir as concentrações necessárias de medicamentos ativos no local da infecção (MARTINEZ, TOUTAIN & TURNIDGE, 2013).
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2. Escherichia coli Escherichia coli é uma bactéria gram-negativa flagelada pertencente à família Enterobacteriaceae e é o agente causador de uma ampla gama de doenças em suínos, incluindo diarreia neonatal e diarreia pós-desmame (DPP), que são importantes causas de morte que ocorrem em todo o mundo em leitões lactentes e desmamados, respectivamente (FAIRBROTHER& GYLES, 2012). O número médio de fenótipos bioquímicos de E. coli em leitões aumentou conforme a idade dos animais (KATOULI et. al, 1995) e as populações de E. coli na microbiota fecal de suínos e no ambiente agrícola são dinâmicos e mostram altos níveis de diversidade (MARCHANT & MORENO, 2013) Os virotipos encontrados com maior frequência foram F18-STa, F4-LT-STa-STb, F18-STa-STx2e e F4-F5-LA-STa-STb (FAIRBROTHER, NADEAU &GYLES, 2005). As falhas nas estratégias comumente usadas para prevenir e controlar a colibacilose neonatal como reduzir o número de E .coli patogênicos no ambiente, implementando medidas de higiene e biossegurança interna e externa. A manutenção de condições ambientais adequadas e o alto nível de imunidade dos leitões, garantido pela imunidade lactogênica e pela vacinação de matrizes contra ETEC, podem levar ao desenvolvimento da doença(LUPPI, 2017). 3. ASPECTOS BACTERIOLÓGICOS GERAIS O conhecimento sobre a epidemiologia, a abordagem diagnóstica e os métodos de controle são de fundamental importância para o enfrentamento da doença. A ETEC que causa colibacilose neonatal expressa principalmente as fímbrias F4 (k88), F5 (k99), F6 (987P) ou F41, enquanto a ETEC da diarreia pós-desmame carrega as fímbrias F4 (k88) e F18 (tabela 1). Essas fímbrias aderem a receptores específicos nas células epiteliais da borda da escova intestinal (enterócitos), iniciando o processo de infecção. Após essa colonização, as bactérias produzem uma ou mais enterotoxinas que induzem diarreia, como a toxina estável a ao calor a (STa), a toxina estável ao calor b (STb) e a toxina lábil ao calor (LT). Foi demonstrado um papel na patogênese da doença para essas toxinas de E. coli juntamente com a demonstração por PCR dos genes que codificam fatores de virulência(fímbiras e toxinas)(LUPPI, 2017).
19 semana de idade, a ETEC positiva a F4 (K88) associa-se à diarreia em leitões após o desmame. A ETEC positiva a F18 só se encontra no período pós-desmame. O grau de colonização e proliferação determina se a doença resulta ou não da infecção. ETEC responsável pela diarreia neonatal possuem adesinas, proteínas de superfície chamadas fímbrias, identificadas como F4 (K88), F5 (K99), F6 (987P) e F41. As fímbrias permitem que os microrganismos aderem-sea receptores específicos nas bordas em escova dos enterócitos do intestino delgado. ETEC com fímbria F4 coloniza o jejuno e íleo, enquanto ETEC com fímbiras F5, F6, F41 coloniza principalmente o jejuno posterior e íleo (FAIRBROTHER & GYLES, 2012). Figura 1 : Ciclo da colibacilose entérica Fonte: Adaptado de Fairbrother (2015). A suscetibilidade a ETEC F5, F6 e F41 diminui com a idade e tem sido relacionados a uma redução no número de receptores ativos presentes nas células epiteliais intestinais com a idade. A maioria das cepas ETEC de colibacilose neonatal produz enterotoxina STa estável ao calor, que liga o receptor de glicoproteína guanililciclase C na borda em escova das células epiteliais intestinais das vilosidades e da cripta, estimulando a produção de monofosfato de guanosina cíclica (cGMP), levando à secreção de fluidos finaisde eletrólitos Secreção excessiva leva à desidratação e eventual morte (FAIRBROTHER & GYLES, 2012).
20 A acidose metabólica, definida como um estado de pH sistêmico reduzido, é uma complicação grave da colibacilose neonatal e é devida à produção de lactato. A maioria dos sinais clínicos anteriormente atribuídos à acidose era de fato devida aos níveis elevados de D- lactato no sangue. A fonte da D-lactatemia é a fermentação bacteriana de substrato não digerido que atinge o intestino grosso devido aos danos no epitélio da mucosa do intestino delgado. A compensação respiratória da acidose ocorre por hiperventilação, mas esse mecanismo é insuficiente devido a um tampão inadequado de bicarbonato (LORENZ, 2009). Uma adesina não-fimbrial identificada como adesina envolvida na aderência difusa (AIDA) foi associada a cepas de ETEC recuperadas de leitões desmamados com DPP e há evidências de que ela está causalmente envolvida na diarreia induzida experimentalmente em leitões recém-nascidos privados de colostro (RAVI et al., 2007). No entanto, o papel da enterotoxina enteroagregativa E. coli estável ao calor(EAST1) e AIDA na colibacilose em leitões ainda não foi esclarecido (ZAJACOVA et al ., 2013) As cepas de ETEC pós-desmame produzem uma ou mais das seguintes enterotoxinas conhecidas: enterotoxinas estáveis ao calor STa, STb, a enterotoxina lábil ao calor LT e a EAST1(FAIRBROTHER & GYLES, 2012). O mecanismo de ação da STa foi descrito para a colibacilose neonatal. A STb não altera o cGMP como descrito para a STa, mostrando um mecanismo de ação diferente. A ligação de STb ao seu receptor leva a uma absorção de Ca 2+^ nas células, induzindo a secreção duodenal e jejunal de água e eletrólitos. In vivo , acumulação significativa de Na + e Cl - ocorre intraluminalmente após intoxicação por STb. Além disso, o STb estimula a secreção de bicarbonato (HCO3-) (DUBREUIL, ISAACSON & SCHIFFERLI D. M., 2016) ALT faz parte de um grupo importante de toxinas da família de toxinas AB5. Dois subtipos de LT, LTI e LTII foram descritos. As diferenças entre LTI e LTII são devidas principalmente à dissimilaridade em sua subunidade B. O LTI pode ser dividido em LTIh e LTIp, produzidos respectivamente pela ETEC humano e suíno. Também foi demonstrado que cepas que expressam LT têm uma vantagem na colonização, promovendo a adesão da ETEC in vitro e in vivo (JOHNSON et al ., 2009).A LT ativa permanentemente a adenilciclase na borda baso lateral da célula e leva à hipersecreção de eletrólitos e água, causando desidratação. A acidose metabólica é uma complicação da colibacilose pós-desmame, mas é limitada até que ocorra colapso circulatório(DUBREUIL, ISAACSON &SCHIFFERLI, 2016).
22 ETEC, eram hemolíticas em 97,6% dos casos. Os restantes 2,4% de isolados não hemolíticos de ETEC, para os quais a atividade hemolítica foi consistentemente testada (LUPPI et. al , 2016). Figura 3 : Fluxograma para amostragem de colibacilose entérica (neonatal e pós-desmame) em suínoss Fonte: Adaptado de Luppi (2017). A identificação de genes de virulência que codificam para as fímbrias e toxinas da cepa isolada é crucial para determinar seu papel no problema clínico observado. Atualmente, na rotina de diagnóstico, análises genotípicas como a reação em cadeia da polimerase (PCR) para a detecção de genes que codificam fatores de virulência são realizadas em muitos laboratórios para caracterizar as cepas isoladas. Primers que detectamgenes que codificam toxinas (STa, STb, LT e EAST1) e fímbiras (F4, F5, F6, F18, F41) de ETEC, para a proteína de membrana externaem E. coli enteropatogênico (EPEC) e para Stx2e toxina nas cepas STEC ( cepas de E.coli envolvidas na doença do edema), estão disponíveis e podem ser usadas para realizar ensaios de PCR para diagnósticos de rotina (CASEY &BOSWORTH B. T., 2009). Certas cepas de F18 produzem enterotoxinas e a toxina Stx2e. Essas cepas são classificadas como ETEC ao invés de STEC, pois produzem DPP clínica mais do que doença do edema (FAIRBROTHER& GYLES, 2012). O uso de PCR de ponto final para a identificação direta de fatores de virulência em amostras de suínos doentes, sem realizar uma bacteriologia semiquantitativa e tipagem de
23 isolados individuais, pode dificultar a interpretação e não ser confiável. Essa abordagem diagnóstica não permite a quantificação do patógeno e pode fornecer uma mistura de todos os fatores de virulência detectáveis pertencentes a diferentes cepas de E.coli presentes na amostra e, como resultado, falsas combinações desses fatores. Além disso, não se pode excluir que genes semelhantes de fatores de virulência de outras Enterobacteriaceae intestinais possam ser detectados (KRALIK &RICCHI, 2017). Diferentes clones dentro de um sorogrupo podem ter evoluído adquirindo genes de virulência diferentes, resultando em variação clonal associada a uma região ou país em particular. Como um exemplo, ETEC de O139 sorogrupo, associado com o F18ab fímbrias, tipicamente causa DPP na Austrália e DE na Europa, enquanto o sorogrupo predominante associadoà DPP em suínos em todo o mundo é O149 (FAIRBROTHER& GYLES, 2012). A histopatologia em tecidos embebidos em parafina e fixados em formalina (íleo, jejuno e intestino grosso deve ser incluída) pode ser usada como uma investigação adicional para um diagnóstico definitivo de colibacilose. Em leitões que sofrem de colibacilose entérica neonatal, observa-se ETEC F4 positivo aderindo à maior parte da membrana da borda da escova enterocitária do jejuno e íleo da mucosa intestinal, enquanto outros ETEC colonizam principalmente o jejuno distal ou o íleo (FAIRBROTHER & GYLES, 2012). Outras alterações incluem congestão vascular, hemorragias e um número aumentado de células inflamatórias (neutrófilos e macrófagos na lâmina própria) (FAIRBROTHER & GYLES, 2012). As lesões microscópicas na ETEC DPP são caracterizadas por camadas bacterianas observadas em adesivos na superfície apical das células epiteliais das vilosidades no íleo e menos consistentemente no jejuno. Atrofia vilosa leve e um número aumentado de neutrófilos pode ser observado na lâmina superficial própria (FAIRBROTHER & GYLES, 2012). A imuno-histoquímica (figura 4) e a hibridização por fluorescência in situ podem ser utilizadas como ferramentas para a confirmação da etiologia das lesões observadas.
