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TALITA DA SILVA MENDES DE FARIAS
Caracterização do perfil diário da lipólise e
lipogênese no tecido adiposo de ratos
adultos e a influência da pinealectomia
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Fisiologia e Biofísica do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
Área De Concentração: Fisiologia Humana
Orientador: Prof. Tit. Dr. Fabio Bessa Lima
São Paulo 2010
RESUMO
Farias, T. S. M. Caracterização do perfil diário da lipólise e lipogênese no tecido adiposo de ratos adultos e a influência da pinealectomia. 2010. 62 f. Dissertação (Mestrado em Fisiologia e Biofísica) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010.
Sabendo-se da correlação do hormônio melatonina com mudanças metabólicas no tecido adiposo e devido a trabalhos que apontam, mas que não caracterizam de fato a existência de um perfil diário dos processos de lipólise e lipogênese em adipócitos isolados de ratos, o presente trabalho teve como objetivo investigar se há ritmicidade dos eventos lipolíticos e lipogênicos no tecido adiposo peri-epididimal e caracterizar, no caso da detecção de oscilação rítmica circadiana, se a pinealectomia interfere ou não nesse processo. O sacrifício dos animais, controles e pinealectomizados, foi realizado de quatro em quatro horas, a saber, 6h30min, 10h, 14h, 18h, 22h; 2h e 5h30min. Coletou- se o tecido adiposo peri-epididimal desses animais e isolaram-se os adipócitos para mensurar por meio de ensaios biológicos ex vivo (com adipócitos isolados) a sua capacidade de realizar lipólise e lipogênese.Em relação a lipogênese (tanto a taxa basal como a estimulada por insulina), observaram-se algumas diferenças estatisticamente significativas nas determinações feitas entre os horários analisados. Isto ocorreu tanto em adipócitos de animais controles quanto de pinealectomizados. No entanto, a comparação entre grupos (Controle X Pinealectomizado), levando-se em conta o horário do dia, não mostrou diferenças significativas entre os grupos, indicando que remoção da glândula pineal não interfere nesse processo metabólico do tecido adiposo branco peri-epididimal. O estudo da lipólise (tanto a taxa basal como a estimulada por isoproterenol) mostrou que existem algumas diferenças estatisticamente significativas entre os horários analisados, contudo, como no caso da lipogênese, a pinealectomia também não interferiu no ritmo desse processo. A utilização do programa COSINOR, para análise da existência de ritmos desses processos, evidenciou que existe um ritmo, tanto na lipogênese quanto na lipólise, mas que não ocorre de maneira circadiana, ou seja, não ocorre em intervalos de 24h ±4. Possivelmente, seriam ritmos ultradianos. Ainda foi verificada interferência da pinealectomia nas taxas de consumo
ABSTRACT
FARIAS, T. S. M. Characterization of the daily profile of lipolysis and lipogenesis in adipose tissue of adult rats and the influence of pinealectomy. 2010. 62 f. Master thesis (master's degree in physiology and biophysics) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo, 2010.
Knowing the correlation of the hormone melatonin with metabolic changes in adipose tissue and because of studies that point, but do not in fact characterize the existence of a daily profile in the processes of lipolysis and lipogenesis in isolated rat adipocytes, the present study investigated whether there is a rhythmicity of lipogenic and lipolytic events in peri-epididymal adipose tissue and characterized, in the case of detection of circadian rhythmic, if pinealectomy interfered in this process. The sacrifice of animals, both controls and pinealectomized, was performed every four hours, namely, 6h30min, 10h, 14h, 18h, 22h; 2h e 5h30min. The peri-epididymal adipose tissue was collected from these animals and adipocytes were isolated to measure, by means of ex vivo biological assays, their ability to perform lipolysis and lipogenesis. In relation to lipogenesis (both the basal and the insulin-stimulated rates), there were some statistically significant differences in the determinations around the clock. This occurred in adipocytes both from control as well as from pinealectomized animals. However, the time-of-day comparison between groups (Control X pinealectomized) showed no significant differences, indicating that removal of the pineal gland did not intervene in the metabolic activity of peri-epididymal white adipose tissue. The study of lipolysis (both basal and stimulated rate to isoproterenol) showed that there are some statistically significant differences between the times around the clock, however, as in the case of lipogenesis, pinealectomy did not affect the daily profile of this process. The use of COSINOR program for analysis of the existence of rhythms of these processes showed that indeed there is a rhythm, both in lipogenesis and in lipolysis, but it does not occur in a circadian manner, i. e., it does not occur at a 24 (± 4) hr interval. Possibly, results are more compatible with an ultradian rhythm. Although interference of pinealectomy was verified in rates of food consumption, water intake and body weight evolution, there were no significant differences between groups.
Key words : Adipose tissue. Pinealectomy. Lipolysis. Lipogenesis. Metabolism. Circadian profile.
los pela lipólise quando existe um déficit calórico (AHIMA et al .; 2000; FONSECA-ALANIZ et al. , 2006). Quando há maior oferta de nutrientes, como no período pós-prandial, ocorre aumento da liberação de insulina que estimula a lipogênese. O armazenamento de lipídeos e sua incorporação em TAG dependem da captação de ácidos graxos contidos nos quilomícrons. No tecido adiposo, os quilomícrons sofrem ação da lipase de lipoproteínas (LPL) que degrada os triacilgliceróis dos quilomícrons e os ácidos graxos então liberados são transferidos para os adipócitos (CURI, 2009). Neste processo, reações bioquímicas em cadeia que têm início a partir de substratos lipídicos resultam em biossíntese e esterificação de ácidos graxos (AG) para a formação de triacilgliceróis (TAG) que são incorporados e armazenados na gota lipídica do adipócito. Em períodos de jejum, em que ocorre menor disponibilidade de ácidos graxos e triacilgliceróis, o processo de lipólise é ativado e o conteúdo energético armazenado anteriormente sob forma de triacilgliceróis é hidrolisado em diacilglicerol (DAG) e monoacilglicerol (MAG) para finalmente ocorrer liberação de três moléculas de ácidos graxos e uma molécula de glicerol por molécula de TAG para ser utilizado como fonte de energia. (YEAMAN, 2004; LAFONTAN et al. , 2009). O processo de lipólise é dependente da ativação da enzima lipase hormônio sensível (HSL) por meio de uma fosforilação realizada pela cinase protéica A (PKA) e ocorre, principalmente, mediante estimulação por catecolaminas quando há grande demanda energética, ou no estado de jejum. A atividade funcional do tecido adiposo, tanto em condições normais como patológicas, demonstram forte correlação com mecanismos circadianos. Os níveis circulantes de adipocinas, como a adiponectina e a leptina, apresentam um perfil oscilatório num período de 24 horas, assim como a interleucina-6 (IL-6) e fator de necrose tumoral-α (TNFα) (GIMBLE e FLOYD 2009; YILDIZ et al ., 2004). Dados apontam que a desregulação circadiana está correlacionada com aumento do risco de obesidade e de comorbidades: doenças cardiovasculares, diabetes, hipertensão, resistência a insulina, hipercolesterolemia e hipertrigliceridemia (HOLMBACK et al. , 2002; DI LORENZO et al., 2003)
1.2 Glândula pineal e melatonina.
A glândula pineal é uma estrutura única que tem sua origem de uma evaginação do diencéfalo, situada em sua margem posterior e acima dos colículos superiores em humanos. Foi descoberta há quase 2000 anos, quando, em 130-230 DC, o médico grego Galeno de Pérgamo descreveu sua localização e a nomeou de glândula pineal. Muitas funções foram atribuídas a esta estrutura durante esses anos, desde órgão vestigial, sem função alguma, até a interpretação cartesiana de “sede da alma”. No entanto, foi apenas na década de 1950 que a glândula ganhou importância no “mundo” das ciências biológicas, uma vez que, nessa época, foi demonstrada a associação da melatonina, hormônio produzido pela glândula pineal, com funções endócrinas. A pineal, mesmo tendo perdido ao longo da evolução sua capacidade de ritmicidade endógena própria, ainda é considerada como um órgão endócrino ativo através da ação do seu hormônio. Como dito acima, esta glândula produz e sintetiza a melatonina (N-acetil- 5-metoxitriptamina) que é um composto orgânico do grupo das indolaminas que, por possuir em sua molécula os agrupamentos acetil e metoxi, apresenta uma característica anfifílica, ou seja, é tanto hidro- como lipossolúvel. Assim, graças a estas características de solubilidade, a melatonina pode atingir todos os compartimentos do organismo.
Figura 1: Estrutura química da melatonina.
A produção de melatonina está sob controle de um relógio mestre localizado no núcleo supraquiasmático (NSQ) no hipotálamo anterior (SIMONNEAUX et al., 2004; RUSAK e ZUCKER, 1979). Esse núcleo recebe informações dos fotorreceptores presentes na retina a partir da via retino-
Figura 2: Principais etapas da síntese de melatonina Fonte: (GANGULY et al., 2002)
A produção da melatonina é controlada por sistemas endógenos com ritmo circadiano, ou seja, sua síntese e secreção ocorrem predominantemente à noite enquanto que a estimulação luminosa ambiental suprime tal produção (ARMSTRONG, 1989; CIPOLLA-NETO e AFECHE, 1999). Dessa forma, sua secreção é proporcional à duração do período escuro, exibindo um padrão cíclico de secreção com baixos valores durante o dia e altos valores durante a noite. Tais características de secreção determinam o papel fisiológico da glândula pineal que é sinalizar para o meio interno, pela presença ou ausência de melatonina nos líquidos corporais, se é dia ou noite no meio exterior e também sinalizar, pelo perfil diário do hormônio, qual a estação do ano. Dessa forma, através da secreção da melatonina, pode-se afirmar que a pineal está
envolvida na modulação de diversas funções fundamentais para a sobrevivência dos organismos, conferindo ritmos a uma série de funções neuroendócrinas que modulam, por exemplo, o ciclo sono-vigília e a atividade reprodutora e metabólica de várias espécies (BARTNESS e GOLDMAN, 1989). Muitos trabalhos apontam que a melatonina apresenta atuação em diversos sistemas do organismo. Diante disso, pode-se destacar o envolvimento deste hormônio na regulação de ritmos circadianos de processos fisiológicos e neuro-endócrinos, função reprodutiva de mamíferos (MACCHI e BRUCE, 2004; ARENDT, 1986), na associação temporal e possível interação da melatonina com o sono e temperatura corporal, mostrando que o ritmo de declínio da temperatura corporal durante uma noite normal é parcialmente modulado pelo aumento endógeno de melatonina (CAGNACCI, 1996), da função imuno-modulatória devido a sua ação no sistema imunológico (CAROLEO et al. , 1992; STEINHILBER et al ., 1995), da função oncostática (COC et al ., 1998; TAN et al ., 1994), da função de indução da diferenciação dos osteoblastos (ROTH et al., 1999), da função vaso-reguladora (DOOLEN et al ., 1998; VEERMAN et al ., 1995), da excelente ação antioxidante e antienvelhecimento (REITER, 1998; REITER, 1992) e, ainda, a sua secreção pode ser afetada por desordens psiquiátricas e neurológicas (FIORINA et al., 1996). Como visto, a melatonina desempenha diversas funções nos seres vivos, e grande parte dessas funções são mediadas por receptores. Nos mamíferos, já foram caracterizados três tipos de receptores de membrana para melatonina, sendo eles MT1, MT2 E MT3. Os receptores de alta afinidade MT 1 e MT 2 pertencem à superfamília dos receptores ligados à proteína G possuindo sete alças transmembrânicas ligando-se à proteína Gi e promovem uma redução na geração citoplasmática do AMPc. O receptor MT 1 , além de ligar-se à Gi, tem afinidade pela proteína Gq/ que lhe confere a característica de poder aumentar a produção de diacilglicerol e IP 3 , podendo resultar em maior concentração intracelular de cálcio e atividade da PKC. Por outro lado, está demonstrado em vários sistemas que a melatonina, mediada pelo receptor MT 1 , pode ativar correntes retificadoras de potássio, diminuindo a despolarização celular e resultando em uma redução do influxo de cálcio através dos canais de cálcio dependentes de voltagem. Os
adipócitos através de receptores específicos MT1 e MT2 (ALONSO-VALE et al ., 2006). Pessoas que apresentam uma alteração na secreção de melatonina, como, por exemplo, aquelas que possuem um estilo de vida noturno, podem ter um risco aumentado de problemas de saúde, incluindo a obesidade e o diabetes (QIN et al_._ , 2003). 1.3 Ritmos circadianos
Os ritmos biológicos são modificações endógenas e periódicas que acontecem nos seres vivos e possibilitam melhor adaptação ao meio ambiente (MENNA-BARRETO, 1997). Tais modificações ocorrem por mudanças na fisiologia e no comportamento dos organismos o que lhes permite antecipar a regulação de sua biologia, decorrente de mudanças previsíveis no ambiente (JOHNSTON et al. , 2009). Os ritmos biológicos podem ser classificados de acordo com o período de repetição do evento considerado, a saber: ritmos circadianos, com período de 24 ± 4h; ritmos ultradianos, com período menor do que 20h e ritmos infradianos com período maior do que 28h. Um ritmo biológico pode estar ajustado a ciclos geofísicos, como, por exemplo, o ciclo sono-vigília que é modulado pelo ciclo diário de claro-escuro. Além dos ciclos geofísicos, um ritmo pode estar regularmente sob a influência de outros ritmos biológicos do próprio organismo ou de outros organismos mostrando que os ritmos não ocorrem de forma isolada no ambiente, mas recebem pistas temporais que contribuem para sobrevivência do indivíduo e o seu sucesso reprodutivo (ROTENBERG, 1997). As pistas temporais promovem o ajuste dos ritmos, sincronizando-os através de dois mecanismos: arrastamento e mascaramento. No arrastamento, o ajuste temporal de um ritmo ocorre pela ação de outro ritmo. Mais comumente, refere-se ao processo de ajuste temporal de organismos a ciclos ambientais (como a sincronização do ritmo da temperatura central pelo ciclo claro/escuro ambiental). Pode-se dizer que um ritmo está arrastado/sincronizado quando mantém relações de fase estáveis com o ciclo arrastador/sincronizador. Já, no mascaramento, fatores ambientais podem ter ação direta sobre o ritmo expresso, modificando a expressão de um ritmo biológico sem que haja
envolvimento do relógio biológico. Em condições experimentais, tal mecanismo poderia ocultar o verdadeiro sincronizador. No entanto, a possibilidade de responder diretamente a um estímulo ambiental, sem que necessariamente seja um ciclo, proporciona aos organismos uma flexibilidade que não lhes é permitida nos mecanismos rígidos do arrastamento e dá ao mascaramento um importante papel na adaptação temporal, atuando então como agente da plasticidade (MARQUES e MENNA-BARRETO, 1997). A importância da manutenção da ritmicidade está baseada nas evidências de que uma relação temporal constante entre os diversos ritmos fisiológicos leva à determinação de uma ordem temporal interna imprescindível à saúde do organismo. Assim, alterações na organização temporal estão envolvidas na etiologia de várias doenças e na redução da expectativa de vida do indivíduo. Além disso, os ritmos biológicos são importantes para manutenção da homeostasia do organismo por permitir a temporização adequada dos processos biológicos em antecipação às mudanças no meio externo tais como a alternância do dia/noite ou das estações do ano, por exemplo. O estudo realizado por Alonso-Vale et al. (2008) demonstrou que a exposição rítmica à melatonina em cultura de adipócitos influencia a atividade metabólica dos adipócitos, mostrando que há um aumento significativo na taxa lipolítica quando a melatonina está ausente no meio de cultura. Além disso, Borges-Silva et al. (2005) mostraram que a pinealectomia aumenta a resposta lipolítica dos adipócitos quando estes são estimulados com isoproterenol. E outros trabalhos ainda mostraram que a melatonina apresenta em efeito inibitório sobre a lipólise basal ( in vitro ) em adipócitos da região inguinal (ZALATAN et al. , 2001). Quando se utiliza a adrenalina como agente lipolítico, observa-se que ocorre uma variação diurna rítmica na sensibilidade do adipócito. Tal ritmicidade persiste em testes ex vivo sugerindo que seja da natureza intrínseca dos adipócitos exibir uma variação diária (SUZUKI et al., 1983). Em relação à lipogênese, estudos em nosso laboratório, revelaram que adipócitos primários isolados em cultura tratados intermitentemente com melatonina apresentaram queda na capacidade de incorporação de glicose em lipídeos(em resposta à insulina) quando a melatonina estava ausente. Quando
fase escura para a fase clara. Além disso, a caracterização circadiana desses processos é de grande relevância para o entendimento da fisiologia metabólica do tecido adiposo. Já o estudo utilizando animais pinealectomizados ganha importância uma vez que já foi demonstrada a grande atuação da melatonina na regulação de processos metabólicos, inclusive mostrando que sua presença ou ausência interferem, in vitro , nas taxas de lipólise e lipogênese.
6 CONCLUSÃO
Os dados apresentados conduzem às seguintes conclusões: Existe um padrão diário dos processos de lipólise e lipogênese, e que, no entanto, não se caracteriza como um ritmo circadiano; A pinealectomia não influência o perfil diário dos processos metabólicos, lipólise e lipogênese, avaliada em adipócitos isolados da gordura PE de ratos Wistar adultos. Técnicas mais apropriadas devem ser utilizadas para demonstrar, cronobiologicamente, o perfil desses processos metabólicos.
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