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Este documento discute as descobertas recentes sobre as células precursoras vasculares envolvidas na formação de vasos coronários, incluindo as epdcs (progenitores de células endoteliais do pericárdio) e as vias de sinalização envolvidas. O texto aborda a capacidade de diferenciação das células tronco hematopoiéticas em células endoteliais e a importância desta diferenciação na neovascularização pós-isquemia. Além disso, o documento discute os tipos de células-tronco considerados fontes potenciais para células cardíacas, incluindo as embrionárias, germinativas, cordão umbilical e medula óssea adulta. O texto também detalha a biologia da diferenciação de um grupo tão complexo de células, como as epdcs, e a importância de conhecer sua capacidade de diferenciação vascular em sítios adultos.
Tipologia: Notas de estudo
Compartilhado em 07/11/2022
4.5
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Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências.
São Paulo 2011
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Biologia Celular e Tecidual do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo, para obtenção do Título de Mestre em Ciências. Área de Concentração: Biologia Celular e Tecidual Orientador: Prof. Dr. José Xavier Neto
São Paulo 2011
Candidato(a): Bruno de Oliveira.
Título da Dissertação: Estudo do potencial vascular de precursores de vasos coronários em sítio adulto.
Orientador(a): José Xavier Neto.
A Comissão Julgadora dos trabalhos de Defesa da Dissertação de Mestrado, em sessão pública realizada a ................./................./................., considerou ( ) Aprovado(a) ( ) Reprovado(a)
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................... Nome: ........................................................................................... Instituição: .....................................................................................
Examinador(a): Assinatura: .................................................................................... Nome: ............................................................................................ Instituição: .....................................................................................
Presidente: Assinatura: .................................................................................... Nome: ............................................................................................ Instituição: .....................................................................................
Ao meu orientador Dr. José Xavier Neto. Obrigado pela confiança ao longo destes quase três anos. Agradeço pela orientação, compartilhamento de idéias e troca de experiências.
Ao Dr. José Eduardo Krieger, diretor do Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do Instituto do Coração, pelo apoio.
Ao Dr. Valdo José Dias da Silva, professor da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, ex-orientador e um exemplo profissional a ser seguido.
Ao Departamento de Biologia Celular e do Desenvolvimento do Instituto de Ciências Biomédicas da USP e aos seus funcionários, em especial a Celiana Marchiori, pela ajuda prestada.
À CAPES, pelo apoio financeiro.
Aos membros do Laboratório de Genética e Cardiologia Molecular do InCor, em especial a: Renata, Maúde, Silvana, Márcio, Arruda, Sileide e Dona Antônia, pela ajuda diária nas situações mais diversas.
À Ana Lúcia Garippo, pela ajuda em melhorar sempre a técnica de imunofluorescência na obtenção das imagens que fazem parte deste trabalho.
Aos amigos do antigo Grupo de Genética e Desenvolvimento Cardíaco do InCor: Allysson, Ana Azambuja, Débora e Pedro. Obrigado por tornarem o trabalho diário uma atividade prazerosa. Foi ótimo trabalhar com vocês! Agradeço em especial a Ana Azambuja e Allysson pela paciência em me auxiliar enquanto dava os meus primeiros na Biologia do Desenvolvimento.
As grandes amigas Hozana e Sylvia. Agradeço pela amizade, pela ajuda nos experimentos/manuscrito/dissertação, pela troca de experiências, cumplicidade e acima de tudo pela humildade, profissionalismo e respeito que poucas pessoas neste meio conseguem ter. Não poderia deixar de dizer que sem a opinião de vocês essa dissertação não teria amadurecido tanto.
Aos outros companheiros do laboratório. Obrigado pela companhia nos intervalos para o café, idas ao bandeijão, bate papos descontraídos e pelo aprendizado que compartilhamos.
Aos amigos de fora do laboratório. Obrigado pelo incentivo, pelas conversas sem sentido e momentos de descontração. Agradeço a Thiago Borsari pelo apoio e pela revisão de grande parte do texto e das figuras apresentadas aqui. Obrigado!!!
À minha família, a quem dedico todas as minhas conquistas e em especial a minha avó Severina. Saiba que você é e sempre será minha fonte de inspiração e sempre motivo de orgulho.
Aos meus pais João e Lourdes. Não teria palavras para agradecer tudo o que fizeram e fazem por mim. Obrigado pelo carinho, apoio e incentivo que sempre me deram. Obrigado pela força na realização de mais esta etapa.
A todos aqueles que direta ou indiretamente contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigado!!!
Oliveira B. Study of the vascular potential of coronary vessel precursors in adult site [Masters Thesis (Cellular and Tissue Biology)]. São Paulo: Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2011.
The Proepicardium (PE) is a transient extracardiac structure giving rise to all components of the coronary vessels. To evaluate the vasculogenic potential of the PE in an adult site, we transplanted a neonatal heart into the subcutaneous of an adult ear. Later, two PE from GFP-transgenic mice were transferred to the surface of this heart (group A). In another group, we transferred the PEs directly into the ear pinna (group B). To evaluate the incorporation of GFP cells derived from the PE, and to investigate their possible differentiation, we performed immunofluorescence (IF) for GFP in combination with other markers: Cardiac Troponin-1 (cTn-1), Smooth Muscle alpha Actin (SMαA), PECAM and endothelial Nitric Oxide Synthase (eNOS/NOSIII). In the group that received the heart and the PE transplantations, double IF against GFP and cTn-1 showed extensive incorporation of GFP+ cells in the periphery of the grafted heart. In the same group, the double labeling with anti-SMαA revealed that GFP+ cells are found internal to the medial smooth muscle layer and into the lumen, suggesting the incorporation of PE cells in the endothelial layer. The endothelial contribution of PE cells was confirmed in the two groups by double staining with GFP and PECAM, which is an early marker of endothelial and blood differentiation. Double staining with GFP and eNOS, a terminal endothelial marker, was present only in the group that received heart transplantation with PE (group A). Double GFP/PECAM IF revealed colocalization in intraluminal cells, consistent with the blood differentiation that is observed in coronary vessels precursors before overt endothelial differentiation. Therefore PE cells can differentiate and likely participate in the process of neovascularization when transplanted to adult sites. These findings demonstrate that the vasculogenic potential of the PE cells is conserved in an adult site and our model is adequate to study the mechanisms involved in the development and regeneration of vasculature.
Key Words: Proepicardium. Vasculogenesis. Angiogenesis. Endothelium.
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O sistema cardiovascular é o primeiro a ser estabelecido durante o desenvolvimento embrionário (Manner et al., 2001; Brade et al., 2006). Nas últimas décadas grandes avanços foram conquistados no que diz respeito à compreensão dos mecanismos envolvidos na embriogenia deste sistema, levando a um melhor entendimento dos diferentes mecanismos moleculares e morfogenéticos atuantes em etapas precoces da diferenciação vascular e cardíaca. Além disso, novas descobertas também foram realizadas com relação aos tipos celulares e vias sinalização envolvidas em etapas chave destes processos (Tomanek e Zheng, 2002; Ishii et al., 2007; Lavine et al., 2008; Zhou et al., 2008; Azambuja et al., 2010).
Tendo em vista tais avanços, novas perspectivas de intervenção e prevenção de diversos tipos de doenças cardiovasculares vêm surgindo.
Nos últimos anos abriram-se perspectivas para um uso amplo das células pluripotentes em medicina. Hoje, além dos transplantes de células da medula óssea, diversos modelos terapêuticos têm sido propostos para doenças dos sistemas cardiovascular, endócrino e neuro muscular.
As doenças cardiovasculares apresentam características que as tornam alvos atraentes para a terapia celular (TC), porque em resposta a agressões variadas este sistema apresenta reações estereotipadas destinadas a preservar sua função. Embora eficientes no curto prazo, essas reações regulatórias se tornarão os principais agentes de destruição do órgão ao longo prazo (Orlic et al., 2001). Portanto, a existência de danos semelhantes em agressões heterogêneas fornece uma base racional para o uso de estratégias comuns de preservação da função cardíaca.
Em muitos tipos de doença cardíaca, como em cardiopatias isquêmicas, o objetivo terapêutico é a recuperação da contratilidade do órgão através da ampliação da malha circulatória. Contudo, em casos especiais, como em cardiomiopatia dilatada ou em infartos muito extensos, a reconstituição da contratilidade cardíaca também demanda a adição de miócitos sadios (Orlic et al., 2001; Dimmeler et al., 2005). Para a maioria dessas doenças a ampliação da malha circulatória significa a recuperação de grande parte da função perdida. Assim, novas descobertas que contribuam para o entendimento do processo de diferenciação
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vascular poderiam ser aplicadas para dirigir a diferenciação de células multipotentes ao fenótipo vascular desejado antes da sua inserção no sítio lesado, tornando a TC muito mais segura e eficiente a médio e longo prazos.
Embora a capacidade de diferenciação das células tronco hematopoiéticas em cardiomiócitos tenha sido colocada em dúvida, (Balsam et al., 2004; Murry et al., 2004; Dimmeler et al., 2005) é aparente que todas as modalidades de células-tronco de medula óssea apresentem uma elevada capacidade de diferenciação em células endoteliais, contribuindo de forma marcante para a neo-vascularização pós isquemia ou neo-endotelização pós injúria (Murry et al., 2004; Urbich e Dimmeler, 2004; Dimmeler et al., 2005).
Hoje, diversos tipos de células-tronco, como as embrionárias, germinativas, do cordão umbilical e da medula óssea adulta têm sido cogitadas como fonte para TC (Asahara et al., 1997; Orlic et al., 2001; Dimmeler et al., 2005). Problemas práticos e éticos têm consolidado uma preferência pelas células pluripotentes da medula óssea adulta e graus variados de sucesso têm sido registrados tanto em protocolos clínicos, quanto experimentais, indicando que a TC pode se tornar uma realidade (Dimmeler et al., 2005).
Atualmente, uma nova janela de oportunidade se abriu com a descoberta da indução do fenótipo de células tronco a partir de células terminalmente diferenciadas por transdução viral de alguns genes chave (Takahashi e Yamanaka, 2006). Contudo, ainda há muito que se aprimorar na TC cardíaca, tanto do ponto de vista do conhecimento básico, quanto do ponto de vista operacional a fim de tornar a TC um procedimento de rotina.
Para que o potencial da TC cardíaca possa ser explorado eficazmente é necessário um maior conhecimento da diferenciação dos diversos tipos de células pluripotentes, assim como acesso a sistemas de referência adequados. Para isso, a exploração da embriogenia cardíaca e desenvolvimento dos vasos coronários se tornam alvos interessantes para o melhor entendimento no processo de formação deste sistema, possibilitando identificar desta forma possíveis modelos e vias de diferenciação a serem usados em TC.
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1.1 Desenvolvimento vascular
O sistema cardiovascular é o primeiro a se estabelecer durante o desenvolvimento dos vertebrados. O sucesso neste processo permite ao organismo em formação o transporte adequado de nutrientes para diferentes tecidos e descarte de metabólitos; para tanto é necessário o estabelecimento de uma malha vascular que dê suporte a este complexo sistema de transporte. Nesta seção abordaremos o processo de desenvolvimento vascular desde o desenvolvimento de um plexo vascular primitivo, até a formação de um vaso sanguíneo maduro durante o desenvolvimento embrionário.
1.1.1 Precursores mesodérmicos
Durante o processo de gastrulação (Figura 1) os três folhetos germinativos, endoderme, ectoderme e mesoderme, são estabelecidos (Risau, 1997). A indução da mesoderme por morfógenos da família dos fatores de crescimento de fibroblastos (FGFs) tem papel essencial na indução da mesoderme lateral e paraxial e na formação dos angioblastos e células hematopoiéticas (Risau e Flamme, 1995). Além dos fatores da família dos FGFs, membros de outra grande família; a dos fatores de crescimento e transformação (TGF-β); foram encontrados induzindo mesoderme, incluindo notocorda e somitos, o que sugere uma atuação sinérgica desses morfógenos durante a formação da mesoderme [revisado por (Risau e Flamme, 1995)].
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Figura 1. Estrutura e movimentos do processo de gastrulação. (A) Esquema de embrião de humano em estágio de implantação uterina durante a fase de gastrulação, na qual são estabelecidos os três folhetos germinativos (endoderme, mesoderme e ectoderme). Células epiblasticas migram através do nó e sulco primitivo para o espaço entre o epi e hipoblasto (setas brancas). (B e C) Corte transversal do embrião no terço posterior. (B) A entrada de células do epiblasto pelo sulco primitivo e nó aos poucos vai substituindo as células do hipoblasto (que mais tarde farão parte do saco vitelínico), formando a endoderme. (C) Movimento de células do epiblasto; após a formação da endoderme formam agora a camada mesodérmica.
Em mamíferos, os primeiros sinais do desenvolvimento de um plexo vascular primitivo são observados na formação da mesoderme lateral do saco vitelínico. Células hematopoiéticas e endoteliais possuem um precursor comum; o hemangioblasto, induzido na mesoderme pela sinalização de FGF (Risau e Flamme, 1995). No saco vitelínico esses hemangioblastos formam agregados celulares – as ilhotas sanguíneas
Estas ilhotas sanguíneas são aglomerados sólidos de células formados a partir do mesoderma esplâncnico (Figura 2). Na periferia desses agregados celulares encontram se os angioblastos, enquanto o centro das ilhotas é constituído por precursores hematopoiéticos (Risau, 1997; Carmeliet, 2000b). Podemos definir os angioblastos como um tipo celular que expressa alguns marcadores de células endoteliais – marcadores precoces de diferenciação, tais como PECAM (molécula
