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CapÌtulo 1
Biologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestruturaBiologia celular e ultraestrutura
Helene Santos Barbosa Suzana CÙrte-Real
- H1. H1. HistÛrico 1. H1. HistÛricoistÛricoistÛricoistÛrico
Citologia, ou biologia celular, È a ciÍncia que estuda os v·rios sistemas celulares, a maneira como as cÈlulas s„o reguladas e a compreens„o do funcio- namento de suas estruturas. A construÁ„o dos microscÛpios Ûpticos foi um passo decisivo para a descoberta das cÈlulas, e acredita-se que o primeiro tenha sido inventado em 1592, por Jeiniere da Cruz e seu pai, Zacharias Jansen, dois holandeses fabricantes de Ûculos. Tudo indica, porÈm, que o primeiro a fazer observaÁıes microscÛpicas de materiais biolÛgicos foi o holan- dÍs Antonie van Leeuwenhoek (1632-1723). O microscÛpio simples com apenas uma lente, construÌdo por Leeuwenhoek, foi aprimorado por Robert Hooke em 1665, ganhando mais uma lente.
A partir dos estudos de Hooke em biologia, publicados em um livro intitulado Micrographia (1665), que analisou cortes finos de cortiÁa obtidos da casca do sobreiro, verificou que estes eram constituÌdos por pequenas cavidades poliÈdricas (no latim,cella), as quais foram denominadas cÈlulas. Estes compartimentos representavam as paredes das cÈlulas vegetais mortas. Em
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1838, o bot‚nico alem„o Matthias Schleiden descreveu que a cÈlula era a unidade b·sica de todas as plantas e, mais tarde, em 1839, o zoÛlogo alem„o Theodor Schwann chegou ‡ mesma conclus„o para os animais. Com base nestes conhecimentos, elaborou-se a teoria celular que foi proposta por Schleiden e Schwann. Posteriormente, a associaÁ„o de tÈcnicas de coloraÁ„o e de citoquÌmica foi capaz de revelar as estruturas e a fisiologia das cÈlulas.
O grande avanÁo no conhecimento da biologia celular, sem d˙vida, foi a invenÁ„o dos microscÛpios eletrÙnicos em 1931, por dois engenheiros alem„es ñ Ernst Ruska e Max Knoll ñ, o que possibilitou a visualizaÁ„o das organelas celulares em grande detalhe.
A cÈlula È uma unidade funcional que estabelece interaÁ„o entre seus componentes, sob o aspecto fisiolÛgico, biossintÈtico e reprodutivo. A din‚- mica celular para a manutenÁ„o da vida È regida por um processo de automanutenÁ„o, que compreende a modificaÁ„o de estruturas, a substituiÁ„o de componentes, de tal forma articulada que garanta a sua organizaÁ„o estrutu- ral e funcional.
- CÈlulas procariÛticas e eucariÛticas2. CÈlulas procariÛticas e eucariÛticas2. CÈlulas procariÛticas e eucariÛticas 2. CÈlulas procariÛticas e eucariÛticas2. CÈlulas procariÛticas e eucariÛticas
A divergÍncia entre procariontes e eucariontes deve ter ocorrido apÛs serem estabelecidos os mecanismos de replicaÁ„o e transcriÁ„o do ·cido desoxirribonucleico (DNA), a traduÁ„o, o sistema de cÛdons e os metabolis- mos energÈticos e biossintÈticos. O principal critÈrio de distinÁ„o entre estes grupos È a sua organizaÁ„o celular. As cÈlulas procariÛticas (do latim pro- primeiro ecario-n˙cleo) s„o relativamente simples e se caracterizam por n„o apresentarem membrana, segmentando os ·cidos nucleicos DNA) e ribonucleicos (ARN) do citoplasma. AlÈm disso, algumas destas cÈlulas apresentam uma membrana plasm·tica circundada externamente pela parede celular. As cÈlulas eucariÛticas (do latimeu-verdadeiro ecario-n˙cleo) constituem o tipo celular da constituiÁ„o dos fungos, protozo·rios, animais e plantas. Estruturalmente, s„o cÈlulas mais complexas, ricas em membranas que formam compartimentos,
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definindo os meios intra e extracelulares. AlÈm desta funÁ„o, a membrana plasm·tica È o primeiro contato entre esses meios, traduzindo informaÁıes para o interior da cÈlula e permitindo que ela responda a estÌmulos externos que podem influenciar nas suas funÁıes biolÛgicas, participando decisivamente das interaÁıes cÈlula ñ cÈlula e cÈlula ñ matriz extracelular.
A membrana plasm·tica e a membrana das diferentes organelas celulares medem cerca de 7 a 10 μm de espessura e s„o visÌveis somente ao microscÛ- pio eletrÙnico. Trata-se de uma estrutura trilaminar constituÌda de duas camadas eletrondensas (escuras) e uma camada eletronl˙cida (clara) central. Molecularmente s„o formadas por uma bicamada fluÌda de fosfolipÌdios (fosfoglicerÌdeos e esfingolipÌdios) e colesterol, onde est„o inseridas molÈculas de proteÌnas. A membrana plasm·tica n„o È uma estrutura est·tica, os lipÌdios movem-se pro- porcionando fluidez ‡ membrana.
Esquema mostrando a bicamada da membrana plasm·tica:
Figura 2. A membrana plasm·tica È formada por molÈculas de lipÌdeos (fosfoglicerÌdeos e esfingolipÌdeos), colesterol, proteÌnas perifÈricas (localizadas somente em uma das camadas dos fosfolipÌdeos) e as transmembranares (localizadas nas duas camadas dos fosfolipÌdeos, ligando o meio extracelular ao citoplasma). A cadeia de peque- nas molÈculas verdes representa os carboidratos localizados somente no lado exter- no da membrana plasm·tica.
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Os carboidratos presentes nesta estrutura, como, por exemplo, glicose, manose, fucose e galactose, est„o ligados ‡s proteÌnas, formando as glicoproteÌnas; ou aos lipÌdios, resultando nos glicolÌpidios e nos glicoesfingolipÌdios. Estes carboidratos est„o presentes apenas na face externa da membrana e forne- cem identidade ‡ cÈlula.
A membrana apresenta uma propriedade imprescindÌvel para manu- tenÁ„o da viabilidade celular, que È a permeabilidade seletiva, controlando a entrada e a saÌda de subst‚ncias da cÈlula. A passagem de molÈculas polares maiores e os Ìons requer canais, formados por proteÌnas transmembranares.
O transporte de molÈculas para o interior das cÈlulas pode ser: a) transporte passivo ñ por difus„o ou por osmose, quando n„o envol- ve o consumo de energia do sistema, sendo utilizada apenas a energia cinÈtica das molÈculas. Sendo assim, a movimentaÁ„o dos Ìons e molÈ- culas d·-se a favor do gradiente de concentraÁ„o (do meio hipertÙnico para o meio hipotÙnico). A difus„o pode ser auxiliada por enzimas (difus„o facilitada) ou pode n„o ter participaÁ„o de nenhuma delas (difus„o simples). A difus„o simples ocorre quando molÈculas hidrofÛbicas pequenas e polares, como O 2 , CO 2 , N 2 e C 6 H 6 , passam pela membrana sem serem bloqueadas; b) transporte ativo ñ È quando o transporte das molÈculas envolve a utilizaÁ„o de energia pelo sistema, na forma de adenosina trifosfato (ATP). A movimentaÁ„o das subst‚ncias se d· contra o gradiente de concentraÁ„o, ou seja, do meio hipotÙnico para o hipertÙnico, como, por exemplo, a bomba de sÛdio e pot·ssio, que tem funÁ„o de manter o potencial eletroquÌmico das cÈlulas. Entretanto, partÌculas maiores n„o conseguem atravessar a membrana, mas podem ser incorporadas ‡ cÈlula pela prÛpria estrutura da membrana celular, ocorrendo, assim, a formaÁ„o de vesÌculas. A este processo, no qual a membrana celular envolve partÌculas ou fluido do exterior, d·-se o nome de endocitose. Ele ocorre por dois mecanismos:
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2.2. Citoplasma
O citoplasma, ou citossol das cÈlulas eucariotas, È formado por uma soluÁ„o coloidal, viscosa e de aspecto relativamente uniforme, que contÈm ·gua (80%), Ìons diversos, amino·cidos e proteÌnas. No citoplasma est„o localizados o n˙cleo e as organelas celulares, o retÌculo endoplasm·tico, o complexo de Golgi, os lisossomos, as mitocÙndrias, os peroxissomos e, ainda, as inclusıes lipÌdicas, os gr‚nulos de glicogÍnio e os ribossomos. Estas estrutu- ras s„o respons·veis pelas funÁıes celulares, como digest„o, respiraÁ„o, secre- Á„o, sÌntese e transporte de proteÌnas. No citoplasma est„o tambÈm os ele- mentos do citoesqueleto, respons·veis por v·rias atividades din‚micas das cÈlu- las, e os centrÌolos, estruturas geradoras dos microt˙bulos.
2.3. N˙cleo
Estrutura extremamente importante para as cÈlulas eucariÛticas, pois nele est„o contidos os ·cidos nucleicos (cÛdigo genÈtico), protegidos pelo envoltÛrio nuclear. … no seu interior que ocorre a duplicaÁ„o do DNA e a transcriÁ„o dos ARNs.
O n˙cleo tem sua localizaÁ„o geralmente no centro da cÈlula e a sua forma pode estar relacionada ao tipo celular. O envoltÛrio nuclear È composto por duas membranas, uma externa e outra interna, com composiÁıes proteicas distintas, que delimitam um espaÁo vari·vel que oscila entre 40 e 70 mm. A membrana interna deste envoltÛrio se encontra associada ‡ l‚mina nuclear, que, por sua vez, est· ligada fortemente ‡ cromatina. A membrana externa do envoltÛrio circunda a membrana interna e È contÌnua com a membrana do retÌculo endoplasm·tico (RE). Este fato faz com que o espaÁo existente entre as membra- nas do envoltÛrio seja tambÈm contÌnuo ‡ luz do RE. Assim como a membrana do RE, a membrana externa do envoltÛrio ñ face citoplasm·tica ñ apresenta ribossomos aderidos que est„o envolvidos ativamente na sÌntese proteica. O envoltÛrio nuclear È interrompido regularmente, formando os poros nucleares.
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Eles tÍm n˙mero e densidade bastante vari·veis, dependendo do tipo celular e estado metabÛlico da cÈlula. Pelos poros, ocorre o transporte bidirecional seleti- vo de proteÌnas e ARNs entre o citossol e o n˙cleo.
No n˙cleo (Figura 3) de cÈlulas em intÈrfase encontra-se a cromatina ñ compactada (heterocromatina) ou frouxa (eucromatina) ñ composta de molÈcu- las de DNA, proteÌnas histÙnicas e n„o histÙnicas. As histonas, proteÌnas b·sicas encontradas nos eucariotos, s„o importantes componentes da estrutura da cromatina, participando n„o somente como repressoras, mas tambÈm como ativadoras na transcriÁ„o do DNA. Por outro lado, as proteÌnas n„o histÙnicas desempenham papel estrutural e enzim·tico, participando da atividade gÍnica.
No n˙cleo interf·sico tambÈm est„o os nuclÈolos, cuja funÁ„o È sintetizar ARNs e envi·-los para o citoplasma. Os nuclÈolos podem ter estrutura reticular ou compacta e o tamanho e a forma dependem do estado funcional da cÈlula, variando conforme o tipo celular. Durante o ciclo celular, geralmente os nuclÈolos desaparecem a partir do final da prÛfase, reaparecendo no final da telÛfase.
A l‚mina nuclear est· presente no n˙cleo, tendo papel importante na reorganizaÁ„o nuclear apÛs o tÈrmino da divis„o celular. Ela est· ancorada ‡s proteÌnas integrais da membrana interna do envoltÛrio nuclear e ligada forte- mente ‡ cromatina. … constituÌda por proteÌnas filamentosas intermedi·rias do tipos A e B que se polimerizam em uma rede bidimensional.
Da estrutura do n˙cleo faz parte a matriz nuclear, que forma uma rede proteica fibrogranular alicerÁando o n˙cleo. Ela est· associada ao DNA duran- te os processos de duplicaÁ„o e regula a transcriÁ„o nos eucariotos, juntamente com as histonas.
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localizada em v·rios pontos da cÈlula ou concentrada em determinadas ·reas do citoplasma. O RE rugoso, em parceria com os polirribossomos, tem um importante papel na sÌntese e exportaÁ„o de proteÌnas. As proteÌnas s„o captu- radas pelo RE, por receptores presentes na sua membrana, assim que comeÁam a ser sintetizadas pelo complexo de ribossomos e ARNm. As proteÌnas sintetiza- das podem ter dois destinos: como proteÌnas transmembranares ou proteÌnas hidrossol˙veis. As proteÌnas transmembranares podem permanecer na membra- na do retÌculo ou serem destinadas ‡ membrana plasm·tica e ‡ membrana de outras organelas. Por outro lado, proteÌnas hidrosol˙veis, quando sintetizadas, podem ser direcionadas para o complexo de Golgi ou encaminhadas aol˙men de alguma organela e secretadas no meio extracelular.
Figura 4. RetÌculo endoplasm·tico rugoso (RE) dilatado de fibroblasto, apre- sentando ribossomos aderidos ‡ membrana.
2.5. Complexo de Golgi
O complexo de Golgi, aparelho de Golgi ou simplesmente Golgi (Figura 5) foi descrito em 1898 pelo biÛlogo italiano Camilo Golgi e È formado por vesÌculas e t˙bulos achatados empilhados e organizados, chama-
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dos de cisternas (cerca de 4 a 8 cisternas). As cisternas voltadas para o retÌculo endoplasm·tico s„o convexas (cisternas cis). As centrais s„o denomi- nadas cisternas medianas, e as mais prÛximas ao sÌtio de secreÁ„o s„o cÙncavas (cisternas trans). O complexo de Golgi apresenta como principais funÁıes o processamento de lipÌdeos e proteÌnas (denominados de glicosilaÁ„o, sulfataÁ„o e fosforilaÁ„o) e a separaÁ„o e o endereÁamento de molÈculas sintetizadas fazendo parte da via biossintÈtica secretora (RE ñ sÌntese; Golgi ñ processamento e seleÁ„o; vesÌculas ñ transporte). As vias secretoras compreendem o transpor- te de lipÌdeos, proteÌnas e polissacarÌdeos aos destinos finais e o empacotamento das macromolÈculas em diferentes vesÌculas de transporte. Essas vesÌculas trans- portadoras direcionam proteÌnas/lipÌdeos/hormÙnios do retÌculo endoplasm·tico para o complexo de Golgi (facecis); o transporte de proteÌnas/lipÌdeos (mo- dificados) do complexo de Golgi para o retÌculo endoplasm·tico (facecis) e para a superfÌcie celular (facetrans) e, ainda, o transporte das molÈculas que originam os lisossomos (facetrans).
Figura 5. Citoplasma de cÈlula eucariÛtica apresentando complexo de Golgi (G) com suas cisternas empilhadas, vesÌculas e mitocÙndrias.
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conter de 1.000 a 1.600 mitocÙndrias, enquanto alguns ovÛcitos podem conter atÈ 300 mil. Possuem organizaÁ„o estrutural e composiÁ„o lipoproteica caracterÌsticas, e contÍm um grande n˙mero de enzimas e coenzimas que participam das reaÁıes de transformaÁ„o da energia celular. Esta organela È caracterizada pela presenÁa de um envoltÛrio formado por duas membranas estrutural e funcionalmente distintas, as quais delimitam dois espaÁos. Existe um espaÁo intermembranar separando as membranas interna e externa, e um segun- do gerado pela membrana interna, delimitando a matriz mitocondrial. A mem- brana interna apresenta uma sÈrie de invaginaÁıes para o interior da mitocÙndria, gerando as cristas mitocondriais, onde est„o presentes os componentes da cadeia respiratÛria respons·veis pela sÌntese de ATP. As mitocÙndrias apresen- tam uma molÈcula de DNA circular, semelhante ‡quelas encontradas nas bactÈ- rias. AlÈm disso, contÍm todo mecanismo necess·rio para replicaÁ„o e transcri- Á„o do DNA e traduÁ„o de proteÌnas. Entretanto, apenas uma pequena quantidade de proteÌnas È codificada pelo DNA mitocondrial. Com base nessas evidÍncias, surge a teoria endossimbiÛtica.
A mitocÙndria È considerada a usina da cÈlula, uma vez que esta È capaz de processar oxigÍnio e glicose e convertÍ-los em energia na forma de ATP, por meio do ciclo de Krebs e da cadeia respiratÛria.
Figura 6. Fibroblasto: mitocÙndrias apresentando a matriz mitocondrial eletrodensa, cristas mitocondriais e a dupla membrana.
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2.8. Peroxissomos
Os peroxissomos (Figura 7) s„o organelas envolvidas por apenas uma membrana e n„o contÍm DNA e nem ribossomos; todas as suas proteÌnas devem ser importadas do citosol. Apresentam em seu interior um conte˙do granuloso fino e s„o geralmente arredondadas, medindo cerca de 0,5mm de di‚metro. No seu interior, È comum se observar a presenÁa de uma porÁ„o fortemente eletrodensa, o nucleoide. Dentre as enzimas encontradas nos peroxissomos destacam-se a catalase, a urato oxidase, a D- amino·cido oxidase e as enzimas respons·veis pela beta oxidaÁ„o dos ·cidos graxos. Os peroxissomos assemelham-se ao retÌculo endoplasm·tico porque se autorreplicam sem possuir genomas prÛprios. Nas cÈlulas animais, os peroxissomos participam da biossÌntese de precursores de glicerolipÌdeos, do colesterol e do dolicol. O n˙mero relativo de peroxissomos na cÈlula pode variar rapidamente em resposta ‡s mudanÁas ambientais e ‡s condiÁıes fisiolÛ- gicas. Os processos de sequestro e degradaÁ„o dos peroxissomos s„o deno- minados macroautofagia e microautofagia.
2.9. Inclusıes lipÌdicas
Inclusıes lipÌdicas (tambÈm chamadas de corpos lipÌdicos, gotas lipidÌcas ou adipossomas) s„o organelas ricas em lipÌdios presentes em todos os organis- mos, incluindo fungos, procariotos e eucariontes. Elas variam de tamanho, tÍm aspecto circular e est„o distribuÌdas por todo o citoplasma das cÈlulas.
Os corpos lipÌdicos s„o circundados n„o pela cl·ssica bicamada de membrana, mas por uma monocamada de fosfolipÌdios, a qual, no mÌnimo em algumas cÈlulas, deve ter uma ˙nica composiÁ„o de ·cidos graxos. O n˙cleo interno dos corpos lipÌdicos È rico em lipÌdios neutros, mas estudos com leucÛcitos tÍm demonstrado que os corpos lipÌdicos n„o s„o simples sacos de lipÌdios neutros. Considera-se atualmente que sejam organelas funcionalmente ativas, altamente reguladas e din‚micas. Pelo uso de tÈcnicas para identificaÁ„o
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mesmo tempo em que fornecem glicogÍnio para outras cÈlulas do organismo. Principal fonte de energia no cÈrebro, os glicogÍnios produzidos pelos astrÛcitos s„o mobilizados para atividade neuronal.
Figura 8. GlicogÍnio distribuÌdo no citoplasma de cÈlula eucariÛtica.
2.11. Citoesqueleto
O citoesqueleto confere ‡s cÈlulas eucariÛticas a manutenÁ„o da diversi- dade de formas, a realizaÁ„o de movimentos coordenados e direcionados e sua estruturaÁ„o interna. Esse citoesqueleto depende de uma complexa rede de filamentos de proteÌnas que se estende por todo o citoplasma, sendo constituÌdo por trÍs principais tipos de estruturas: os microt˙bulos, os filamentos intermedi·rios e os filamentos de actina.
Os microt˙bulos s„o formados por subunidades: b-tubulina e a-tubulina, as quais se associam uma ‡s outras, conferindo-lhe assim uma forma cilÌndrica, com o di‚metro de 25 mm. Os microt˙bulos direcionam o deslocamento de vesÌculas, participam da divis„o celular com a formaÁ„o do fuso mitÛtico para o deslocamento dos cromossomos e est„o presentes na manutenÁ„o da estrutura celular e na morfologia dos cÌlios e flagelos.
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Os filamentos intermedi·rios recebem esta denominaÁ„o por apresenta- rem um di‚metro intermedi·rio entre filamentos de actina e microt˙bulos ( mm de di‚metro). Sua composiÁ„o È proteica, formando uma rede estrutural por toda a cÈlula.
Os filamentos de actina (Figura 9) est„o distribuÌdos por todo o citoplasma das cÈlulas eucariÛticas e apresentam di‚metro de 5 mm. Eles s„o formados por uma proteÌna globular, a actina, que apresenta as isoformas: a, b e g. Estes filamentos, nas cÈlulas epiteliais, est„o concentrados nos prolongamentos citoplasm·ticos, participando, juntamente com os desmossomos, do contato com outras cÈlulas e com a membrana basal, mantendo, assim, a integridade organizacional do epitÈlio. Nos miofibroblastos, importantes cÈlulas do tecido muscular, os filamentos de actina est„o organizados paralelamente ‡ membrana plasm·tica, mantendo estas cÈlulas tensionadas ao substrato e s„o, ent„o, denominados fibras de estresse.
Figura 9. Fibra estresse (asterisco) localizada abaixo da membrana, formada por microfilamentos de actina.
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3.1.2. ColoraÁ„o com Giemsa 1- Fixar com Bouin por 5 minutos em temperatura ambiente; 2- Lavar trÍs vezes com ·lcool etÌlico a 70%; 3- Lavar uma vez com ·gua destilada; 4- Corar com Giemsa (6 gotas de corante para cada 1mL de tamp„o fosfato 0,2M ñ soluÁ„o de uso ñ filtrado), por 15 minutos em tempe- ratura ambiente; 5- Lavar duas vezes em ·gua destilada. Para clarificaÁ„o, passar em sÈrie de acetona / xilol (acetona 100% duas vezes, acetona 70% / xilol 30%, acetona 50% / xilol 50%, acetona 30% / xilol 70%, xilol 100% duas vezes); 6- Montar com Permount.
PreparaÁ„o do tamp„o fosfato 0,2M:
SoluÁ„o A: NaH2PO4. 1 H2O (fosfato de sÛdio monob·sico) ................. 27,6 g ¡gua tridestilada.......................................................................... 1 L SoluÁ„o B: Na2HPO4 (fosfato de sÛdio bib·sico)...................................... 39,4 g ¡gua tridestilada.............................................................................1L SoluÁ„o estoque do tamp„o: SoluÁ„o A................................................................................28 mL SoluÁ„o B.................................................................................72 mL SoluÁ„o de uso: Diluir 1:10 (soluÁ„o estoque: ·gua tridestilada).
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3.2. Protocolo de marcaÁ„o do retÌculo endoplasm·tico
O RE pode ser observado por microscopia de fluorescÍncia pela utiliza- Á„o de marcador fluorescente especÌfico, o ER-Tracker. E, por microscopia eletrÙnica de transmiss„o, utilizando-se citoquÌmica ultraestrutural, revelando a enzima glicose-6-fosfato.
3.2.1. ER-Tracker
- PreparaÁ„o de reagentes O ER-Tracker Green È fornecido liofilizado em 100 mg. Preparar uma soluÁ„o estoque de 1mM. Para isso, deve-se diluir todo o conte˙do do frasco liofilizado em 128 mL de DMSO. … recomendado que esta soluÁ„o seja separada em alÌquotas e estocada emfreezer com dessecante.
Preparo da soluÁ„o de marcaÁ„o
- Diluir a soluÁ„o estoque de ER-Tracker a 1 mm para a concentraÁ„o recomendada de 500 mm em meio simples;
- Para cÈlulas aderidas, remover o meio da cultura, lavar trÍs vezes com meio simples e adicionar a soluÁ„o de marcaÁ„o prÈ-aquecida. Incubar as cÈlulas por 30 minutos a 37 ∞C. Substituir a soluÁ„o de marcaÁ„o por meio de cultura e visualizar as cÈlulas, utilizando microscÛpio de fluorescÍncia. Se as cÈlulas a serem marcadas precisarem ser fixadas, consultar as etapas de marcaÁ„o a seguir.
FixaÁ„o das cÈlulas ER-Tracker Green Lavar as cÈlulas em meio simples por trÍs vezes. Fixar com PFA 4% por 20 minutos em temperatura ambiente. Lavar trÍs vezes com PBS, mon- tar entre l‚mina e lamÌnula com DABCO.
