PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
GUILHERME GENOVEZ JUNIOR
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E MICRODUREZA DE
ESMALTE DENTÁRIO HUMANO REMINERALIZADO COM
AUXÍLIO DE PROTEÍNAS DA MATRIZ DO ESMALTE
Londrina
2018
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Composição e microdureza do esmalte dentário humano remineralizado com proteínas da matriz, Provas de Microscopia
Esta dissertação apresenta uma avaliação da composição e microdureza de esmalte dental humano remineralizado com auxílio de proteínas da matriz do esmalte, com foco em amelogenina e sua capacidade de conduzir a remineralização do esmalte humano. O estudo aborda também a interação proteína-proteína e a aplicação das proteínas da matriz do esmalte na regeneração do esmalte dental.
O que você vai aprender
- Quais são as vantagens de utilizar proteínas da matriz do esmalte na regeneração do esmalte dental?
- Como as proteínas da matriz do esmalte afetam a remineralização do esmalte dental humano?
- Qual é o papel da amelogenina na remineralização do esmalte dental?
- Como as proteínas da matriz do esmalte interagem entre si na formação do esmalte?
- Como as amelogeninas regulam a mineralização do esmalte?
Tipologia: Provas
2022
1 / 36
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PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO STRICTO SENSU
MESTRADO EM ODONTOLOGIA
GUILHERME GENOVEZ JUNIOR
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E MICRODUREZA DE
ESMALTE DENTÁRIO HUMANO REMINERALIZADO COM
AUXÍLIO DE PROTEÍNAS DA MATRIZ DO ESMALTE
Londrina 2018
GUILHERME GENOVEZ JUNIOR
Londrina 2018
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E MICRODUREZA DE
ESMALTE DENTÁRIO HUMANO REMINERALIZADO COM
AUXÍLIO DE PROTEÍNAS DA MATRIZ DO ESMALTE
Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação Stricto Sensu da Universidade Norte do Paraná - UNOPAR, como requisito parcial à obtenção do título de Mestre em Odontologia. Orientador: Prof. Dr. Ricardo Danil Guiraldo
GUILHERME GENOVEZ JUNIOR
AVALIAÇÃO DA COMPOSIÇÃO E MICRODUREZA DE ESMALTE
DENTÁRIO HUMANO REMINERALIZADO COM AUXÍLIO DE
PROTEÍNAS DA MATRIZ DO ESMALTE
Dissertação apresentada à UNOPAR, no Mestrado em Odontologia, área e concentração em Dentística, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre conferida pela Banca Examinadora formada pelos professores:
Prof. Dr. Ricardo Danil Guiraldo Universidade Norte do Paraná
Profa. Dra. Alejandra Hortencia Miranga González Universidade Norte do Paraná
Profa. Dra. Sandrine Bittencourt Berger Universidade Norte do Paraná Londrina, 21 de Fevereiro de 2018.
AGRADECIMENTOS
À minha família, especialmente minha esposa, Daniele Cristina Amâncio , e meus pais, Maria Salete Marquesi Genovez e Guilherme Genovez , pelo amor e apoio incondicionais que tornaram esta realização possível. Por compreenderem minhas ausências ao longo destes vinte e quatro meses. Que Deus os abençoe sempre! Ao Professor Ricardo Danil Guiraldo , orientador deste, pelo incentivo, constante presença e condução de minha jornada como pesquisador. Aos professores, membros da banca de avaliação, por sua presença e suas colocações, essenciais para a qualidade desta pesquisa: Professora Alejandra Hortencia Miranda González , docente de pós-graduação stricto sensu em odontologia da UNOPAR, a quem também agradeço por toda a ajuda, principalmente pelo auxílio da espectroscopia das amostras; e à Professora Sandrine Bittencourt Berger , membro suplente desta banca, por toda a atenção, tempo e disposição tomados com o treinamento para utilização dos equipamentos do laboratório, bem como ajuda na interpretação de alguns resultados e métodos. A todos os amigos do mestrado e do doutorado, especialmente à, Jaqueline Costa Fávaro Fernandes , Marília Franco Punhagui, Fabíola Stahlke Prado e Omar Geha , que presentes em diferentes momentos desta etapa, contribuíram para o sucesso deste trabalho.
GENOVEZ JR Guilherme. Evaluation of composition and microhardness of human dental enamel remineralized with the help of enamel matrix proteins. 35p. [Dissertação de Mestrado]. Programa de Pós-Graduação em Odontologia - Universidade Norte do Paraná, Londrina, 201 8. ABSTRACT The use of enamel matrix proteins as promoter of the remineralization of hard tissues in dentistry began in the implantodontics and periodontics areas. As new studies confirmed its effectiveness in bone tissue, regeneration of dental cementum was observed, and it was not long before research began evaluating its action on the other tissues of the tooth. The aim of this work was to evaluate changes in the composition and microhardness of human dental enamel remineralized with the aid of enamel matrix proteins, based on in vitro tests. To this, were taken 42 human third molars extracted for orthodontic reasons and stored frozen for a period not exceeding three months. From these teeth were made enamel samples for hardness and FT-IR tests. The samples were divided into 3 groups: healthy enamel, demineralized enamel and enamel treated with Emdogain (Straumann AG). The microhardness test (n = 10) and composition analysis with FT-IR (n = 4) were performed. The application of Emdogain have showed the ability to return hardness to the demineralized enamel to levels resembling sound enamel. FT-IR showed phosphate in the bands between 900- 1200 cm-1, indicative of hydroxyapatite in the samples where this product was used, at levels near to sound enamel. In conclusion, the studied commercial solution of enamel matrix proteins demonstrated the ability to remineralize human enamel to levels resembling sound enamel. Key Words : Tooth Enamel, Amelogenin, Biomimetics.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Diagrama ilustrando as secções (em vermelho) das coroas para o preparo das amostras Figura 2: Diagrama ilustrando a confecção das amostras. A: A Secção de dente (branco) incluída em resina acrílica (amarelo) em matriz (verde). B: Regularização da superfície vestibular. Figura 3: Aspecto das amostras em dois momentos. A: Logo após o processo de regularização e polimento da superfície, exibindo alto brilho. B: Após a ciclagem ácida, com aspecto fosco e lesão de mancha branca estabelecida. Figura 4: Apresentação comercial do Emdogain (Straumann AG, Basel, Suiça), e conteúdo da embalagem: Seringa contendo a solução, adesivo com informações de lote e validade e cânula para aplicação. Figura 5: Exemplos de observação de indentações knoop ao ensaio de microdureza final para amostras dos três grupos. 1: Amostra do Grupo 1 (esmalte íntegro); 2: Grupo 2 (esmalte desmineralizado); e 3: Grupo 3 (esmalte remineralizado com solução de amelogeninas). Figura 6 : Gráfico do FT-IR, demonstrando espectros sobrepostos de amostras dos três grupos. Em preto o espectro de amostra do Grupo 1 (esmalte íntegro), em azul espectro de amostra do Grupo 2 (esmalte desmineralizado), e em vermelho espectro de amostra do Grupo 3 (esmalte remineralizado com amelogeninas).
LISTA DE SÍMBOLOS
μm Micrometros C Celsius cm Centímetro g Grama mm Milímetro nm Nanômetros
SUMÁRIO
- 1 INTRODUÇÃO
- 2 REVISÃO DA LITERATURA
- 3 PROPOSIÇÃO
- 4 MATERIAIS E MÉTODOS
- 5 RESULTADOS
- 6 DISCUSSÃO
- 7 CONCLUSÃO
- REFERÊNCIAS
12 Estes processos são fisiológicos durante a amelogênese^13 , mas podem ser reproduzidos artificialmente, e autores indicam suas possíveis aplicações clínicas na reversão de manchas brancas5,14,15^ e lesões de erosão dentária^16 , bem como na prevenção, melhorando a resistência à futuros desafios ácidos17,18. O objetivo neste estudo foi avaliar o grau de remineralização obtido com auxílio de proteínas da matriz do esmalte, comparando esmalte hígido e esmalte tratado com auxílio de proteínas da matriz do esmalte. A hipótese nula testada foi que não há diferença de dureza entre o esmalte hígido e o esmalte tratado.
13 2 REVISÃO DA LITERATURA 2.1 Esmate Dentário Humano A microestrutura e composição do esmalte humano, parâmetro amplamente utilizado para a constatação do grau de mineralização desta estrutura, foi alvo das pesquisas de Oliveira et al. (2010)^1 , que avaliaram terceiros molares hígidos com rizogênese completa (n=12) e segundos molares decíduos (n=12), através de microscopia eletrônica, difração de raios-X, e espectroscopia de dispersão de raios- X. No esmalte dos dentes permanentes foram observados prismas mais volumosos e espaçados (percentual de cálcio variou de 52,5% a 56, 62%, e fósforo de 21,11% a 21 ,19%), valores superiores aos obtidos para dentes decíduos. Por fim, a espectroscopia detectou principalmente hidroxiapatita, silicato de cálcio, e fosfato de cálcio hidratado. De acordo com os autores, estes parâmetros poderão servir como referência para análises futuras. Moradian-Oldak (2012)^6 , ao abordar o papel da matriz proteica extracelular do esmalte, aponta a amelogenina como principal proteína estrutural da matriz orgânica do esmalte, constituindo mais de 90% do conteúdo proteico do esmalte. 2.2 Amelogeninas Lau et al. (1989)^2 relacionam a localização dos genes responsáveis pela produção de amelogeninas através de teste Southern Blot para análise de DNA em células somáticas humanas, murinas e humanas hibridizadas com a sequência para amelogenina proveniente de murinos. Os autores determinaram que a sequência que determina a amelogenina se encontra no braço distal do cromossomo X na região entre p22.1 e p22.3 e próximo ao centrômero do cromossomo Y, possivelmente na proximal do braço longo, na região Yq11. Esta descoberta é consistente com a hipótese de que a perturbação do gene da amelogenina está relacionada com os tipos de amelogênese imperfeita relacionados ao cromossomo X. Moradian-Oldak (2001)^3 em revisão, descreve o papel das amelogeninas na montagem, processamento e controle da morfologia dos cristais hidroxiapatita. A autora discorre sobre os eventos extracelulares envolvidos na amelogênese, apontando que as nanoesferas de amelogenina são a unidade estrutural básica da mineralização do esmalte em sua matriz. Nas etapas iniciais da amelogênese, a
15 Desta forma podem ocorrer interações entre amelogeninas livres e peptídeos de terminais N de outras proteínas da matriz, como a ameloblastina e a enamelina. Apicella et al. (20 1 6)^6 , indicam que a produção de amelogenina nos mamíferos depende da síntese de aminoácidos a partir da leitura de um gene que determina a sequência correta destas moléculas na construção da proteína. Que, em simulação, sua produção a partir de genes suínos têm semelhanças com a descrita na literatura a partir de genes humanos e murinos, principalmente para suas estruturas secundária e terciária, que correspondem aos terminais C e N. Margolis et al. (20 1 6)^7 , em revisão crítica, avaliam o papel das proteínas da matriz do esmalte na formação deste tecido. Os autores apontam que além da amelogenina, a enamelina e a enamelizina são as proteínas essenciais para uma formação mineral de esmalte apropriada. Mas a amelogenina tem potencial automontante e é peça-chave no controle da forma e organização dos cristais de apatita. A montagem da amelogenina ocorre por pontes de hidrogênio em seus terminais N e C. Os terminais C da amelogenina determinam o paralelismo entre os cristais, mas não são essenciais no controle da forma dos mesmos. O processamento proteolítico da amelogenina é essencial para que ocorra a formação de esmalte. A montagem das cadeias de amelogenina e sua solubilidade são afetadas por temperatura e pH. As amelogeninas assumem conformações alongadas , e a presença de íons metálicos multivalentes (incluindo o Ca^2 +). 2.3 Ação das Amelogeninas no Reparo do Esmalte Humano Kirkham et al. (2007)^10 sintetizaram peptídeos automontantes para avaliar seu potencial para organizar espontaneamente uma matriz e orientar a mineralização de tecidos duros, incluindo os tecidos dentais. Os autores constataram a formação dos peptídeos com microscopia eletrônica de transmissão. Foram avaliados pré-molares humanos (n=16), com lesões de cárie produzidas artificialmente. Metade das amostras (n=8) recebeu a aplicação de uma solução de peptídeos por 30 minutos, a outra metade (n=8) não recebeu o tratamento com esta solução. Todas as amostras foram então submetidas à ciclagem alternando soluções remineralizadoras e desmineralizadoras do esmalte dentário. Após a ciclagem, foi calculado o ganho ou perda mineral comparando-se a espectrofotometria para a quantificação de fósforo. Outro grupo de amostras recebeu uma aplicação de gel preparado com a mistura da solução de peptídeos e solução mineralizadora, e incubado por 7 dias para análise
16 em microscopia eletrônica de transmissão. Foi observado maior ganho mineral após ciclagem de pH nas amostras que receberam a solução de peptídeos. A microscopia constatou a formação de fibrilas de peptídeos relacionadas a zonas com maior densidade de elétrons, que denotam áreas onde ocorreu nucleação da apatita. Fan et al. ( 2009 )^14 compararam a qualidade da remineralização promovida por amelogenina à obtida com auxílio de fluoretos. Em seu estudo utilizaram amostras de esmalte de terceiros molares humanos, que foram submetidas a condicionamento ácido e expostos a soluções de amelogenina em diferentes concentrações ou fluoreto, e analisados em microscopia eletrônica de varredura, difração de raios-X e espectroscopia no infravermelho transformada de Fourier (FT-IR). Ao microscópio, observou-se a formação de cristais de apatita, que mostraram-se mais densos e organizados conforme a concentração de apatita utilizada. Os autores concluem que o uso destas proteínas tem potencial aplicação em dentística restauradora e na prevenção da progressão de lesões de cárie. Pesquisa conduzida por Fan et al. ( 2011 )^19 avalia o impacto da solução remineralizadora em esmalte humano previamente submetido a aplicação de amelogenina. Os autores comparam o efeito de soluções com diferentes concentrações de cálcio, fósforo e flúor, em diferentes variações de pH e temperatura. As amostras foram comparadas através de ensaios de microdureza, microscopia eletrônica de varredura por emissão de campo, espectroscopia por transformada de Fourrier e difração de raios-X. Os autores relatam que a regeneração do esmalte é mais efetiva em solução com pH 6,8 ± 0,4, contendo cálcio e fósforo. A presença de flúor melhorou a dureza das amostras. Cochrane et al. ( 2010 )^18 , em revisão crítica, avaliando novas abordagens na remineralização avançada do esmalte dentário, ressalvam que a odontologia moderna tem como objetivo o manejo não invasivo de lesões de cárie não cavitadas através de sistemas de remineralização que reparem o esmalte dentário com fluorapatita ou fluorhidroxiapatita. Tratamentos que, em indivíduos de alto risco à doença serão adotadas como medidas profiláticas, e em casos onde há lesão evidente serão medidas não invasivas que restaurem dureza e estética do esmalte afetado para que este resista a futuros desafios ácidos. A oferta de fluoretos na remineralização também pode implicar numa concentração maior deste elemento no esmalte regenerado e poderá ampliar ainda mais as vantagens de utilização das proteínas da matriz do esmalte.
18 e submetidas ao gel de quitosana puro), foram preparadas. As amostras foram mantidas em solução de saliva artificial e fosfato de cálcio. Os autores comprovaram o crescimento de uma nova camada de esmalte através de microscopia eletrônica de varredura e microscopia eletrônica de transmissão. Foram testadas a microdureza e módulo elástico, em vinte pontos. As amostras com adição de gel de quitosana e amelogenina obtiveram melhores resultados quando comparadas às que receberam condicionamento ácido, mas piores resultados quando comparadas às do grupo sem tratamento. Os autores concluem que a amelogenina tem papel fundamental nos processos de regeneração do esmalte humano, e ressaltam que as propriedades mecânicas obtidas com o gel de quitosana e amelogenina aliadas à robustez da união entre a camada de esmalte original e induzido poderiam aumentar significativamente a longevidade de restaurações dentárias. Cao et al. ( 2014 )^16 testaram os efeitos de uma solução comercial de proteínas da matriz do esmalte em amostras de esmalte humano após desmineralização com ácido fosfórico 37% por 1 minuto. A solução foi diluída em gel de agarose. As amostras foram divididas em três grupos: apenas aplicação de ácido fosfórico (n=1), aplicação do ácido e tratamento com gel de agarose com proteínas da matriz do esmalte (n=7) e aplicação do ácido e tratamento com gel de agarose puro (n=3). As amostras foram submetidas a testes para avaliação do módulo de elasticidade e nanodureza, espectroscopia por difração de raios-x, espectroscopia por energia dispersiva e avaliação em microscópio eletrônico de varredura. As amostras que receberam gel com proteínas da matriz do esmalte apresentaram maior densidade de prismas de esmalte ao microscópio eletrônico; maior concentração de cálcio, fósforo e flúor (sugerindo a formação de fluorapatita) na espectroscopia por difração raios-x; e picos mais elevados para componentes da hidroxiapatita na espectroscopia por energia dispersiva. Não houve diferenças no modulo de elasticidade e nanodureza para as amostras tratadas com gel de agarose com ou sem proteínas da matriz do esmalte, mas a amostra que recebeu apenas condicionamento ácido obteve resultados inferiores. Os autores concluem que o uso de proteínas da matriz do esmalte facilita a mineralização em esmalte previamente desmineralizado, apontado este material como uma possibilidade para o reparo em casos de erosão dentária. Ran et al. ( 2014 )^17 estudaram a resistência à desmineralização do esmalte remineralizado com ajuda de proteínas da matriz do esmalte. Em seu estudo, utilizaram 45 blocos de esmalte dentário bovino, cada um com uma metade livre e a
19 outra isolada com esmalte de unha. As amostras foram divididas em três grupos respectivamente tratados com água destilada, fluoreto de sódio e proteínas da matriz do esmalte. As amostras foram submetidas à ciclagem ácida por 6 dias. Após este desafio, foram testados microdureza, grau de desmineralização do cálcio, microscopia de força atômica, microscopia de varredura, espectroscopia por difração de raios-X, microscopia polarizada e microrradiografia transversa. O grupo tratado com proteínas da matriz do esmalte demostraram menor redução na microdureza, menor desmineralização, menor incidência de poros na superfície do esmalte ao microscópio eletrônico de varredura, e valores semelhantes com o grupo dos fluoretos nos exames de microscopia de força atômica, espectroscopia por difração de raios-X, microscopia polarizada e microrradiografia transversa. Schmidlin et al. ( 2016 )^5 comparam os efeitos de produtos à base de proteínas da matriz do esmalte, peptídeos automontantes, solução de fluoretos e saliva artificial, em esmalte bovino. Avaliam a capacidade de aumentar dureza do esmalte previamente desmineralizado, em diferentes profundidades para os quatro grupos, e concluem que proteínas da matriz do esmalte e peptídeos automontantes têm resultados semelhantes, superiores aos obtidos com solução de fluoretos ou saliva artificial, atingindo efetivamente profundidades de até 200 μm.