Docente: Dyego Miranda
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Aula 08 - Extração e Quantificação de Ácidos Nucleicos (DNA e RNA), Notas de aula de Biomedicina
A oitava aula, começo do assunto da segunda avaliaçao! :)
Tipologia: Notas de aula
2011
1 / 8
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Docente: Dyego MirandaDocente: Dyego Miranda
Todo procedimento
laboratorial envolvendo
análise de DNA ou RNA
tem que passar pelo
processo de extração;
Diferentes etapas são
necessárias para se obter
o DNA ou o RNA
purificado.
Lise das membranas
lipídicas
◦ (^) Membranas: fosfolipídios + proteínas ◦ (^) Rompimento da membrana celular e dos compartimentos membranosos (organelas); ◦ (^) Provocada por uma solução detergente (^) Ex.: dodecil sulfato de sódio ( SDS )
Purificação do DNA
◦ (^) Remoção dos componentes celulares Proteínas e organelas e restos celulares; ◦ (^) Proteinase K Desnaturação das proteínas ◦ (^) Fenol Remove proteínas e outros contaminantes da solução aquosa do DNA; ◦ (^) Clorofórmio Ajuda a desnaturar proteínas e a remover o fenol residual; ◦ (^) NaCl 2 O sal ajuda a manter as proteínas dissolvidas no líquido extraído, impedindo que elas precipitem com o DNA.
Reidratação do DNA
◦ Após a retirada do álcool, o DNA precisa se
solubilizar em algum solvente: H 2 O ultra-pura ou
TE;
◦ O solvente de reidratação servirá para
armazenamento do DNA extraído;
◦ Deve ser livre de contaminantes e enzimas
capazes de destruir o DNA (DNASE-free);
◦ Armazenar o DNA a -20℃ (RNA -70℃).
Após a extração, é necessário determinar a
concentração de DNA extraído;
Geralmente feito por espectrofotometria ou algum outro
equipamento mais avançado (nanodrop, picodrop)
O DNA possui leitura de absorbância em um
comprimento de onda na faixa de 260nm;
As proteínas possuem uma leitura de absorbância na
faixa de 280nm;
Razão 260/280nm mostra a pureza do material extraído:
◦ (^) ≥1,75 – 1,8 = material de boa qualidade (puro) ◦ (^) <1,75 = contaminação por lipídeos e/ou proteínas ◦ (^) Na extraçao de RNA a razão 260/280nm ideal = 2