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Um estudo sobre a atividade da enzima redutase do nitrato em plantas de gabiroba e os efeitos da disponibilidade hídrica no solo sobre essa enzima. O texto discute a importância da atividade da redutase do nitrato na assimilação de nitrogênio inorgânico em moléculas orgânicas complexas, como aminoácidos e nucleotídeos, e a relação entre o nível de aminoácidos no floema da raiz e a absorção e assimilação de nitrogênio pela planta.
Tipologia: Notas de aula
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Tecnólogo em produção de grãos
Agosto de 2010
Dissertação apresentada à Universidade Federal de Goiás – UFG, Câmpus Jataí, como parte das exigências para a obtenção do título de Mestre em Agronomia (Produção Vegetal).
Agosto de 2010
LUCIELLE JANUÁRIO DE OLIVEIRA – filha de Pedro Januário da Silva e Maria Lucia Oliveira de Siqueira, nascida em Ipameri (GO), em 14 de setembro de
Essa etapa que agora se encerra não teria se concretizado se não fosse o apoio e amizade de inúmeras pessoas.
Ao Programa de Pós-graduação em Agronomia da Universidade Federal de Goiás- Campus Jataí, sua comissão de coordenação, seus professores, pelas oportunidades, ensinamentos e ajuda.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Cientifico e Tecnológico (CNPq) pela concessão da bolsa de estudos para o curso de mestrado.
Aos professores Drº Samuel Mariano Gislon da Silva e Drº Antonio Paulino Costa Netto , pela orientação e paciência na elaboração deste trabalho, serei sempre agradecida por tudo.
A todos os meus familiares e em especial a minha amiga Sueli pela paciência, dedicação, amizade e principalmente pela ajuda na conclusão deste trabalho, espero ser merecedora de tanta confiança e amizade.
Aos meus amigos Raquel, Jonathan, Joyce , pelo amor, carinho, incentivo, amizade e pelas horas de descontração que me proporcionaram mais alegria durante toda a minha caminhada.
Aos amigos Francys , Hellen , Kerley , Vânia e Betânia pela amizade sincera, durante todas as minhas alegrias e pela força durante os momentos de dificuldade.
Aos amigos do Curso de Mestrado pelo companheirismo, carinho e convivência durante estes anos.
A todos, que de alguma forma contribuíram para a realização desta etapa de minha vida.
i SUMÁRIO
Página
LISTA DE FIGURAS ................................................................................................................................ iii
LISTA DE TABELAS ............................................................................................................................. iv
RESUMO ................................................................................................................................................. v ABSTRACT ............................................................................................................................................ vi
1 – INTRODUÇÃO ................................................................................................................................ 07
2 – REVISÃO DE LITERATURA ................................................................................................ 09 2.1 – Aspectos relevantes da espécie campomanesia sp .................................................... 09 2.2 – O nitrogênio no solo e na planta ...................................................................................... 10 2.3 – A assimilação do nitrogênio pelas plantas ................................................................ 11 2.4 – A Redutase do Nitrato ......................................................................................................... 13 2.5 – Aspectos fisiológicos de tolerância a seca ................................................................ 15 2.6 – Anóxia e Hipóxia ................................................................................................................... 17
3 – MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................................ 19 3.1 – Localização do experimento .............................................................................................. 19 3.2 – Formação de mudas ............................................................................................................ 19 3.3 – Obtenção do substrato ........................................................................................................ 19 3.4 – Tratamento e condução do experimento ................................................................ 20 3.5 – Analises Morfológicas.......................................................................................................... 21 3.5.1 – Altura de Planta...... .......................................................................................................... 21 3.5.2 – Diâmetro médio do caule ................................................................................................ 21 3.5.3 – Número de folhas por planta ......................................................................................... 21 3.5.4 – Diâmetro da raiz principal ............................................................................................... 21 3.5.5 – Comprimento da Raiz ................................................................................................ 21 3.5.6 – Número de raízes secundárias ..................................................................................... 22 3.6 – Atividade da redutase do nitrato ...................................................................................... 22
iii LISTA DE FIGURAS Página
Figura 1. Modelo adaptado do dímero da redutase do nitrato indicando os três domínios de ligação, dos quais as seqüências de polipeptídeos são similares nos eucariontes: complexo molibdênio (CoMo), grupo heme e FAD. O nitrato é reduzido no complexo molibdênio próximo à região amino terminal. As seqüências dos polipeptídios nas regiões hinge são altamente variáveis entre as espécies.................................................................................... 13
iv LISTA DE TABELAS
Página Tabela 1. Características químicas e físicas de um Latossolo Vermelho escuro distroférrico utilizado no estudo............................................. 20
Tabela 2. Atividade da enzima redutase do nitrato (μmoles NO^2 -^ h-^1 gmf-^1 ) em limbo foliar de Campomanesia sp. submetidas a diferentes condições de disponibilidade hídrica....................................... ........... 27
Tabela 3. Características agronômicas de um sistema em hipóxia.................... 28
Tabela 4. Características agronômicas de um sistema em capacidade de campo................................................................................................. 28
Tabela 5. Características agronômicas de um sistema em déficit hídrico.......... 28
Tabela 6. Atividade da enzima redutase do nitrato (μmoles NO^2 -^ h-^1 gmf-^1 ) em raízes de plantas de campomanesia sp. submetidas a diferentes condições de disponibilidade hídrica.................................................. 31
vi ASSIMILATION OF NITRATE IN CAMPOMANESIA SP.UNDER DIFFERENT CONDITIONS OF WATER AVAILABILITY.
ABSTRACT - The assimilation of nitrogen in plants is affected by the drought and also by the waterlogged soil, and abserved dramatic reductions in the activity of nitrate reductase,from smaal decreases in water potencial and in the absence of oxygen in the soil macro and micropores.In this context,the objective this work was to asses the presence or not of nitrate reductase activity in gabiroba plant and to verify the affects of different water availability in the soil on the activity os this enzyme in order to verify the possible strategies forsurvivol.The experimente was carried out under natural vegetation.Established and three conditions of water availability:water budget deficit,field capacity and hipoxia in seven different times(before undergoing treatmente)12 hours, 24 hours,1 weeks,3 weeks and 4 weeks after submission of the treatments. The activity of nitrate reductase was determined in shoots and roots of plants,using the in vivo that reflects and potential activity of nitrate reductase in situ.Patients were also evoluated agronomic traits in the studied treatments.Plants Campomanesia sp.present activity of nitrate reductase in leaf and root tissue.The activity of nitrate reductase is predominantly foliar.A availability of water affected the enzyme activity when compared to normal handling.Plants Campomanesia sp. showed greater tolerance of nitrate assimilation in drought conditions compared to conditions of flooding.
Keywords:Gabiroba,Water availability,enzumate activity.
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1. INTRODUÇÃO
Apesar da escassa informação técnica disponível atualmente, o interesse no aproveitamento econômico das gabirobas é grande. Alguns fatores limitantes estão ligados à germinação de sementes, ao desenvolvimento das plântulas, à variabilidade de genótipos encontrados e à predação intensa de frutos (Carmona, 1994). Por isso, torna-se de grande importância estudos que visem o aumento da produtividade das chamadas “plantas nativas do cerrado”, em relação à disponibilidade de água no ambiente e conseqüentemente no aproveitamento dos elementos minerais essenciais disponíveis no solo. O suprimento desses elementos minerais essenciais para as plantas e a adequada proporção entre eles são de fundamental importância na qualidade de frutos e órgãos assim como na produtividade. Dentre os elementos minerais essenciais, a disponibilidade do nitrogênio é um dos fatores mais importantes nos processos de crescimento e de desenvolvimento de plantas, se apresentando como o elemento mineral essencial de maior impacto para diversas características agronômicas de interesse. O nitrogênio é o elemento mineral essencial exigido em maior quantidade referindo-se as exigências das culturas, o que se deve ao fato de estar envolvido nas principais reações bioquímicas em plantas e microrganismos, além de ser constituinte de vários compostos em plantas, destacando-se os aminoácidos, proteínas, ácidos nucléicos e clorofilas (Novais et al., 2007). As plantas de um modo geral são capazes de utilizar diversas formas de nitrogênio. A principal forma nitrogenada absorvida pelas plantas, independentemente da natureza química do nitrogênio aplicado no solo, é o nitrato. Mas, para que este possa ser utilizado, é necessário que seja reduzido a amônio, e então incorporado em compostos orgânicos. A conversão do nitrato a amônio é constituída por duas etapas, sendo a primeira delas a redução do nitrato a nitrito, que é dependente da atividade da enzima redutase do nitrato, e a segunda etapa na conversão de nitrito a amônio, pela redutase do nitrito (Meguro & Magalhães, 1982). A redutase do nitrato é primeira enzima atuante na rota de assimilação e incorporação de nitrogênio
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2. REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Aspectos relevantes da espécie Campomanesia sp.
O gênero Campomanesia sp é popularmente conhecida como gabiroba, guabiroba, guabiroba-do-campo, guariroba ou guavira. Pertence à família Myrtaceae, a qual inclui cerda de 130 gêneros e 4000 espécies que se distribuem nas regiões pantropicais e subtropicais (Souza e Lorenzzi, 2005). A planta é um arbusto de 0,3 até 2 metros de altura e ramos amarelados. As folhas são opostas, simples, inteiras com pontuações translúcidas, ápice agudo, base obtusa, membranáceas, levemente avermelhadas quando novas; coriáceas, oblongas com face ventral pruinosa e dorsal amarelada, quando adultas. As Flores são axilares isoladas, pedicelos glabros; brancas; pentâmeras; dialipétalas; sépalas triangulares, agudas, ciliadas; pétalas ovais, conchiformes; androceu com muitos estames, anteras pequenas, rimosas; ovário ínfero, placentação axial, estigma captado. Os frutos são globosos, bacáceos de 2,0 a 2,5 cm de diâmetro com 6 lóculos; polpa amarelada quando madura. Sementes pequenas, discóides, reniformes e pardas (Ferreira, 1972). Tem ocorrência no cerrado, cerradão e campo sujo (Silva et al., 2001). É uma planta de ampla distribuição, podendo ser encontrada nos estados de São Paulo, Tocantins, Mato Grosso, Mato Grosso do Sul, Goiás, Distrito Federal, Bahia, Minas Gerais e Santa Catarina, chegando às regiões adjacentes da Argentina e do Paraguai (Legrand e Klein, 1977). É uma planta caducifólia sendo que o florescimento ocorre de modo bem intenso, por um curto período de tempo (Almeida et al., 1998), de agosto a novembro, com pico em setembro. Frutifica de setembro a novembro (Silva et al., 2001). As espécies de Campomanesia têm importância econômica bastante diversificada. Seus frutos podem ser consumidos “in natura” e na forma de doces, sorvetes, refrescos e, muitas vezes, como flavorizantes em destilados alcoólicos
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devido aos seus atributos de qualidade como: elevada acidez, ácido ascórbico (vitamina C), minerais, fibras alimentares e hidrocarbonetos monoterpênicos (α- pineno, limoneno e β-(z) ocimeno), presentes em maior quantidade no óleo volátil dos frutos, e que lhes conerem o aroma cítrico (Vallilo et al. , 2006). O conhecimento a respeito da planta é importante para sua inserção no mercado consumidor, preservação em seu estado natural e implantação de futuras lavouras comerciais. Sua presença marcante nas áreas de cerrado faz com que sejam extremamente importantes para o reflorestamento e recuperação de áreas devastadas nessa região.
2.2 O nitrogênio no solo e na planta
O nitrogênio é considerado um dos elementos minerais essenciais que causam maior impacto no desenvolvimento e produtividade, das plantas e, conseqüentemente, aumenta os índices de qualidade dos produtos agrícolas (Viana, 2007). A adição do nitrogênio ao solo pode ocorrer na forma de fertilizantes minerais e orgânicos, por meio da água da chuva e pela fixação biológica (Malavolta, 2006). Esse nutriente está sujeito a um grande número de processos, principalmente as transformações de formas orgânicas em inorgânicas e vice-versa, podendo resultar em ganhos ou perdas do sistema como um todo (Havlin et al. , 2005). A maioria dos solos, cerca de 5% do nitrogênio total, está na forma mineral, sendo essa a principal forma absorvida pelas plantas. A reserva de nitrogênio no solo é principalmente orgânica, estando sujeita às transformações que determinarão as relações de equilíbrio entre nitrogênio orgânico e mineral, em função do comportamento do NO 3 -^ e NH 4 +^ como íons no solo e das necessidades de plantas e microorganismos (Ceretta & Fries, 1998). As plantas absorvem nitrogênio do solo na forma de nitrato, amônio, uréia e aminoácidos, prevalecendo o nitrato em grande parte dos solos por ser o produto final da utilização microbiológica do nitrogênio amoniacal, onde bactérias quimiossintetizantes dos gêneros Nitrossomonas e Nitrobacter que oxidam a amônia e utilizam os elétrons removidos no seu metabolismo (Willians & Miller, 2001).
12 De forma geral, o nitrato absorvido pelas raízes pode ser assimilado nesses órgãos ou nos órgãos aéreos, dependendo da sua disponibilidade e da espécie vegetal. No processo de assimilação, o nitrato é reduzido a nitrito no citosol pela enzima redutase do nitrato; posteriormente, o nitrito é reduzido a amônio nos plastídeos da raiz ou nos cloroplastos das folhas pela enzima redutase do nitrito (Tischner, 2000). O amônio absorvido pela raiz ou produzido por assimilação do nitrato, ou ainda originário da fotorrespiração, é convertido nos aminoácidos glutamina e glutamato pela ação seqüencial das enzimas glutamina sintetase e glutamato sintase, localizadas no citosol e nos plastídeos das raízes ou nos cloroplastídeos (Becker et al ., 1993). Os aminoácidos gerados pela ação dessas enzimas por sua vez servem de substrato para reações de transaminação, para a produção de todos os outros aminoácidos necessários à síntese de proteínas (Taiz e Zeiger, 2004). O transporte e a assimilação do nitrato são diretamente regulados por variações na concentração de glutamina (Gojon et al., 1998) ou, ainda, pelo incremento na concentração total de aminoácidos solúveis que não o acúmulo de um aminoácido específico (Barneix & Causin, 1996). O incremento na concentração de CO 2 atmosférico também afeta o metabolismo de nitrato, assim como, a temperatura radicular afeta a absorção e o transporte. A taxa e a quantidade de nitrogênio assimilado pelas plantas durante o seu ciclo dependem da atividade das enzimas envolvidas no ciclo do nitrogênio e da disponibilidade de energia necessária para os processos de assimilação (Bredemeier & Mundstock, 2000). A assimilação do nitrogênio é considerada um processo dispendioso energeticamente às plantas, razão porque ocorre predominantemente nas folhas, centro de síntese de ATP e agentes redutores. O processo de incorporação do nitrogênio compete com a fotossíntese por massa e energia, consumindo 12 ATPs para cada nitrogênio assimilado pela planta (Blomm et al., 1992). A via de assimilação do nitrato é um processo biológico essencial, por ser a principal rota pela qual o nitrogênio inorgânico é incorporado em compostos orgânicos. Assim a atuação da redutase do nitrato é de suma relevância na incorporação de nitrogênio inorgânico em moléculas orgânicas complexas como
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aminoácidos e nucleotídeos, sendo a etapa limitante nesse processo (Beevers et al., 1965).
2.4 A Redutase do Nitrato
A transformação de nitrato em aminoácidos é controlada pela atividade da redutase do nitrato pelo fato de ser a primeira enzima no caminho metabólico. A redutase do nitrato é uma enzima chave no processo de assimilação de nitrato pelas plantas (Campbell, 2001). Essa enzima é uma flavoproteína formada por duas subunidades idênticas, com três grupos: FAD (flavina adenina dinucleotídeo); grupo heme e um complexo constituído entre o molibdênio (Mo) e uma molécula orgânica, a pterina, razão porque é, também, denominada uma molibdopterina (Taiz & Zeiger, 2004). O NADH liga-se ao FAD de cada subunidade e inicia a transferência de dois elétrons a partir do grupo carboxil terminal (C terminal) até o grupo amino terminal (N terminal). Os elétrons atravessam o grupo heme e chegam ao complexo molibdênio, onde ocorre a redução do nitrato à nitrito, como pode ser observado na figura abaixo.
Figura 1: Modelo adaptado do dímero da redutase do nitrato indicando os três domínios de ligação, dos quais as seqüências de polipeptídeos são similares nos eucariontes: complexo molibdênio (CoMo), grupo heme e FAD. O nitrato é reduzido no complexo molibdênio próximo à região amino terminal. As seqüências dos polipeptídios nas regiões hinge são altamente variáveis entre as espécies.
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Regiões Hinge
NADH
2 e- MoCo HEM FAD
MoCo HEM FAD NADH
2 e- NO 3 -
NO 3 -
