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ANÁLISES FÍSICO-QUÍMICAS DA DROGA VEGETAL Kalanchoe Daigremontiana****. Danielle de Oliveira. Miloch 1 Luiza Gabrielly Lopes Rodrigues^2 Ely Eduardo Saranz Camargo^3 RESUMO O controle farmacognóstico de drogas vegetais é extremamente importante, uma vez que muitas espécies vegetais são vendidas sem qualquer garantia de qualidade, o que favorece desde a venda de espécies falsificadas até seu armazenamento de forma inadequada durante sua comercialização. O gênero Kalanchoe, pertencente a família Crassulaceae da ordem Saxifragales, apresenta algumas interessantes adaptações a climas áridos e quentes, tais como a abertura noturna dos estómatos, que permanecem fechados durante o dia, reduzindo a perda de água. Objetivou-se com este trabalho, descrever o estudo farmacognóstico por meio de análises físico- químicas da droga vegetal Kalanchoe Daigremontiana , para a identificação e controle de qualidade da matéria prima vegetal. Foi determinado o teor da água, determinação de cinzas totais, as cinzas em ácido, alcalóides, taninos, determinação do teor de flavonóides totais, glicosídeos flavonóides, glicosídeos antraquinônicos, glicosídeos cardiotônicos e glicosídeos saponínicos. Os resultados obtidos podem ajudar na identificação da planta vegetal em questão, bem como nos parâmetros de controle de qualidade para a identificação da matéria-prima. Palavras-Chave: Controle de qualidade. Plantas medicinais. Kalanchoe Daigremontiana. Análise físico-química. ABSTRACT The pharmacognostic control of plant drugs is extremely important, since many plant species are sold without any guarantee of quality, which favors from the sale of counterfeit species to their improper storage during their commercialization. The Kalanchoe genus, belonging to the Crassulaceae family of the order Saxifragales, has some interesting adaptations to arid and hot climates, such as the stomata opening at night, which remain closed during the day, reducing water loss. The objective of this work was to describe the pharmacognostic study by means of physical-chemical analyzes of the plant drug Kalanchoe Daigremontiana, for the identification and quality control of the plant raw material. Water content was determined, determination of total ash, acid ash, alkaloids, tannins, determination of total flavonoid content, flavonoid glycosides, anthraquinone glycosides, cardiotonic glycosides and saponin glycosides. The results obtained can help in the identification of the plant in question, as well as in the quality control parameters for the identification of the raw material.
(^1) Acadêmica de Farmácia; Faculdade Estácio Unijipa. E-mail: milochdanielle@gmail.com. ²Acadêmica de Farmácia; Faculdade Estácio Unijipa. E-mail: luizagabrielly2702@gmail.com. (^3) Professor Doutor do Curso de Farmácia da Faculdade Estácio Unijipa. E-mail: elycamargo@bol.com.br
Keywords: Quality control. Medicinal plants. Kalanchoe Daigremontiana. Chemical physical analysis. 1 INTRODUÇÃO Drogas vegetais são por definição, plantas medicinais ou suas partes que contenham substâncias responsáveis por alguma ação terapêutica, após processos de colheita, estabilização e secagem, podendo ser íntegra, rasurada ou triturada (LEGRAMANDI, 2011). O emprego das plantas medicinais contribui para a prevenção, tratamento e cura de doenças como primeiro recurso medicinal desde os tempos mais remotos, tendo representado a base da terapêutica durante muitos anos (PARISI; SILVA; CAMARGO, 2018). Segundo Legramandi (2011), o governo brasileiro reconhece o uso das plantas medicinais como uma forma terapêutica eficaz e segura, tenso seu uso recomendando com a publicação da Política Nacional de Práticas Integrativas e Complementares e da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos. Assim sendo, o estudo de plantas medicinais tem crescido de forma exponencial (GUIZZO et al., 2015). Deste modo, o controle farmacognóstico destas drogas é indispensável, uma vez que muitas espécies vegetais são vendidas sem qualquer garantia de qualidade, o que favorece desde a venda de espécies falsificadas até seu armazenamento de forma inadequada durante sua comercialização (PARISI; SILVA; CAMARGO, 2018). O gênero Kalanchoe, pertencente a família Crassulaceae da ordem Saxifragales, apresenta algumas interessantes adaptações a climas áridos e quentes, tais como a abertura noturna dos estómatos, que permanecem fechados durante o dia, reduzindo a perda de água (SILVA, 2007). Este gênero apresenta algumas propriedades medicinais e inseticidas, de modo que podem resultar em toxicidade quando ingeridas por crianças ou animais de pequeno porte (SILVA, 2007). Dentro desta perspectiva o presente trabalho visa descrever as análises físico-químicas da droga vegetal Kalanchoe Daigremontiana , são eles, determinação da água, determinação de cinzas totais, determinação de cinzas em ácido, alcalóides e taninos, determinação do teor de flavonóides totais, glicosídeos flavonóides, glicosídeos antraquinônicos, glicosídeos cardiotônicos e glicosídeos saponínicos.
Como materiais empregou-se uma espátula, vidro de relógio, becker, tela de amianto, tripé, bico de Bussen, bastão de vidro, papel filtro, funil de vidro, haste universal e garras, cadinho, chapa de aquecimento, já como reagentes foi o Ácido clorídrico 7% e água destilada. As cinzas obtidas previamente no ensaio de cinzas totais foram transferidas para um becker, adicionando-se 25 mL de ácido clorídrico 7% coberto com o vidro de relógio. O bécker foi posicionado sobre a tela de amianto, tripé e bico de Bunsen ligado, aquecidas, logo em ebulição aguardou-se durante 5 minutos, posteriormente o vidro de relógio foi lavado com 5 mL de água destilada quente, juntando esta água ao bécker. Um funil e filtro de papel posicionado sobre haste universal e garras, filtrou as cinzas insolúveis em ácido, lavando-o com água quente até que o filtrado se mostrasse neutro, foram aproximadamente 100 mL utilizados. O papel de filtro foi colocado em um cadinho e levado à mufla para incineração a 500°C. Os resultados obtidos representam a porcentagem de cinzas insolúveis em relação à massa inicial de droga vegetal. 2.4 ALCALÓIDES: Foram utilizados uma espátula, vidro de relógio, balança, becker, bastão de vidro, tela de amianto, bico de Bussen, tripé, haste universal e garras, funil de vidro, papel filtro, pinça de madeira, funil de decantação, pipeta graduada, pêra, proveta, chapa de aquecimento, lâmina de vidro, tiras reagente de pH, capela. E como reagentes, a Kalanchoe Daigremontiana pulverizada, ácido sulfúrico 1%, hidróxido de amônio, clorofórmio e hidróxido de chumbo. Para o teste de alcalóides, tarou a balança com vidro de relógio e então se pesou 2g de Kalanchoe Daigremontiana , logo, se depositou a droga vegetal em um becker com capacidade para 100 mL. Em uma proveta mediu-se 50 mL de ácido sulfúrico diluído a 1% tendo sido este transferido para o becker que continha as 2g da droga vegetal. Sobre uma tela de amianto e tripé colocou-se o bécker e ligou-se o bico de bunsen, após entrar em ebulição, foi aguardado um tempo de 2 minutos e com uma pinça de madeira se retirou o bécker com a solução transferindo-a sobre um funil de vidro e papel filtro dobrado em quatro, filtrou-se o extrato ácido até não haver mais líquido sobre o papel filtro e, por mais duas vezes foram adicionados 20 mL de ácido sulfúrico sobre o papel filtro, juntando-se ao primeiro filtrado. Acrescentou-se aproximadamente 15 gotas de hidróxido de amônio para
alcalinização do filtrado, e o teste de alcalinização foi realizado com fitas de medição de pH. Com o funil de decantação sobre a haste universal e garras, transferiu-se o extrato para o funil. Com a pera e pipeta graduada coletou-se 15 mL de clorofórmio transferindo a uma proveta, e desta para o funil de decantação que continha o extrato alcalinizado, agitou-se e então se aguardou por aproximadamente 15 minutos para decantação, durante a decantação observou-se a divisão das fases, a superior em uma fase aquosa alaranjada, e inferior em uma fase hidroalcoólica transparente, após decantação coletou-se a fase transparente em um béquer limpo, e repetiu-se esta etapa por mais duas vezes, totalizando três decantação. Após coletado em um becker a fase líquida transparente levou-se para a chapa de aquecimento a 150 Cº por aproximadamente 20 minutos até evaporar totalmente o líquido, dai, pegou-se uma pipeta graduada e pera adicionando-se 6 gotas de acetato de cobre misturando com um bastão de vidro no becker com o líquido evaporado. Com o bastão de vidro depositou-se uma gota do extrato sobre uma lâmina de vidro de um lado, e uma gota de hidróxido de chumbo na qualidade de reagente sobre a mesma lâmina ao lado, e com o bastão de vidro se encostou as duas gosta para reagir, e então formar um precipitado constando a presença de alcalóide. 2.5 TANINOS: Os Materiais empregados para a obtenção de taninos foram uma espátula, vidro de relógio, balança, backer, tela de amianto, tripé, bico de Bunsen, haste universal e garras, funil de vidro, bastão de vidro, papel filtro, pipeta graduada, pêra, pinça de madeira. Os reagentes foram Kalanchoe Daigremontiana pulverizada, água destilada, cloreto férrico 2%, acetato neutro de chumbo 10%, ácido acético glacial 10% e molibdato de amônio. 2.5.1 Para obtenção do extrato Tarou-se a balança com vidro de relógio e então foi pesado 2g de Kalanchoe Daigremontiana para a extração de taninos. Em uma proveta coletou-se 40mL de água destilada, que foi transferida junto da droga vegetal (2g) para um becker. Sobre a tela de amianto, tripé e bico de Bunsen aceso, colocou-se o becker, que ao entrar
coloração azul ou violeta e coloração verde na presença de taninos catéquicos, formou-se a precipitação transparente levemente citrino. 2.5.6 Reação com molibdato de amônio Em um becker com capacidade para 50ml, com uma pipeta graduada, adicionou-se 1 mL de extrato, 15 mL de água destilada e adicionada ao extrato diluído 2 gotas de solução molibdato de amônio. Como resultado de taninos gálicos, não se apresentou coloração amarela e alaranjada escura, a solução mostrou-se completamente transparente e límpida. 2.6 GLICOSÍDEOS FLAVONOÍDICOS: Para este procedimento foi utilizado uma espátula, vidro de relógio, backer, chapa aquecedora, papel de filtro, funil de vidro, tripé, tubo de ensaio, haste universal e garras, pipeta graduada, pêra, pinça de madeira. E como reagentes, a Kalanchoe Daigremontiana pulverizada, etanol, magnésio, cloreto férrico e hidróxido de sódio. Neste procedimento pesou-se 4 g da droga pulverizada e etanol 75%, em seguida, a droga e o etanol foram adicionados em um becker e levada a fervura por cerca de 3 minutos. Após, foi deixado que o conteúdo sedimentasse e, após a sedimentação, realizou-se a filtragem com auxílio de algodão e um funil, passando o filtrado para um Erlenmeyer (este processo de filtragem foi repetido por mais duas vezes repetindo-se a dosagem de etanol), logo depois de finalizado o processo de filtragem, o filtrado foi levado para a chapa aquecedora, aquecendo até o volume do filtrado estar em cerca de 30 ml, após concentrado a quantidade desejada do filtrado foi realizado o processo de reações químicas. 2.6.1 Reações químicas 2.6.1.1 Reação de Shinnoda ou de Cianidina Coloca-se cerca de 3ml de extrato concentrado em um tubo de ensaio e adicionado cerca de 0,2g de magnésio metálico fragmentado e 1ml de ácido clorídrico R. Observa-se a coloração desenvolvida.
2.6.1.2 Reação com cloreto férrico Dilui-se o extrato com água destilada, e em seguida foi colocado em dois tubos de ensaio 5ml de extrato em cada um. Em um dos tubos foi adicionado pela parede 1 ou 2 gotas de cloreto férrico 2%, enquanto o outro serviu de teste branco. Imediatamente foi verificado a cor que se desenvolveu quando o reativo entrou em contato com o extrato. 2.6.1.2 Reação com hidróxido de sódio Diluí-se o extrato com água destilada, e após foi colocado em dois tubos de ensaio 5ml de extrato cada, em um dos tubos adicionar 1 ou 2 gotas de hidróxido de sódio 5%, o outro serviu de teste branco. Foi verificada a cor desenvolvida no tubo em que foi adicionado hidróxido de sódio. 2.7 GLICOSÍDEOS ANTRAQUINÔNICOS Os materiais utilizados foram uma espátula, vidro de relógio,Backer, chapa aquecedora, papel de filtro, funil de vidro, tripé, Tubo de ensaio, haste universal e garras, pipeta graduada, pêra, pinça de madeira, lâmina microscópica, anel e aquecedor, enquanto que de reagentes foi a Kalanchoe Daigremontiana pulverizad,alcool a 25%, ácido sulfúrico, clorofórmico, hidróxido de amônio e hidróxido de potássio. 2.7.1 Identificação através de reação de Bornträeger Ferve-se brandamente cerca de 2 gramas de droga pulverizada com 30mL de álcool a 25%, durante 1 a 2 minutos, em seguida o líquido ainda quente é filtrado. Após, separar 10mL do filtrado e hidrolisar à fervura por 2 minutos com 5mL de ácido sulfúrico 10%, arrefecer. Extrair as geninas com 10mL de clorofórmio. Separ 5mL da camada benzênica ou clorofórmica e agitar com igual volume de hidróxido de amônio R. 2.7.2 Identificação por processo de microssublimação
2.8.1 Reações de identificação do núcleo esteroidal Reação de Liebermann-Burchard (objetivo: identificação de fenatreno) : Em um dos béckers que foi evaporado a solução, adicionou-se 1 mL de anidrido acético, misturou-se com um bastão de vidro, e transferiu-se para um tubo de ensaio, em seguida adicionou-se 1 mL de ácido sulfúrico concentrado pelas paredes do bastão de vidro, para não correr o risco de cair fora do tubo, então observar. 2.8.2 Reações de identificação de 2-desoxiaçúcares Reação de Keller-Kiliani: Em um dos béckers que foi evaporado a solução, adicionou-se 1 mL de ácido acético glacial, misturou-se com um bastão de vidro, e transferiu-se para um tubo de ensaio, juntou-se à solução 8 a 10 gotas de cloreto férrico a 2%. Transferir cuidadosamente a solução, através das paredes, para um tubo de ensaio contendo cerca de 1,0ml de ácido sulfúrico concentrado. 2.9 GLICOSÍDEOS SAPONÍNICOS: Foram utilizados espátula, vidro de relógio, balança, becker, tripé, bico de Bunsen, haste universal e garras, funil de vidro, bastão de vidro, papel filtro, pipeta graduada, pêra, pinça de madeira, tubo de ensaio, algodão, proveta, tubos de ensaio. Como reagente foi empregado a Kalanchoe Daigremontiana pulverizada, água destilada, ácido clorídrico, clorofórmico, ácido sulfúrico, nitrato de prata, vanilina, ácido acético glacial e ácido tricloroacético. Foi fervido cerca de 3 gramas de droga pulverizada grosseiramente em 50ml de água destilada durante 3 minutos, a solução foi filtrada através de algodão para uma proveta de 100ml, e novamente fervido o resíduo do recipiente durante 3 minutos com 50ml de água destilada, e novamente filtrado para a mesma proveta. O volume foi completado até 100ml com água destilada. Foi separado 10ml do extrato para teste de espuma e hemólise. O restante de 90ml do extrato foi reservado para hidrolisar e realizar testes químicos. 2.9.1 Processo físico
Colocado em um tubo de ensaio, 5ml de extrato e 5ml de água (extrato 1%); arrolhar e agitado vigorosamente no sentido vertical durante 5 segundos, deixar o extrato em repouso por 30 minutos. 2.9.2 Processo químico Preparo de genina para reações de identificação: em um erlenmeyer de 250ml de capacidade, colocar 90ml de extrato preparado na extração das saponinas, adicionar 10ml de ácido clorídrico concentrado. Ferver com cuidado durante 15 minutos em chama baixa. Após esse tempo, desligar o aquecimento e arrefecer o líquido fervente, transferir o líquido hidrolisado para um funil de separação de 250ml. Extrair as sapogeninas em 3 vezes com 20ml de clorofórmio cada. Em cada reação de identificação, evaporar cerca 6ml de extrato clorofórmico. 2.9.3 Reações gerais C.1- Reação de Rossol: Colocar 2 gotas de ácido sulfúrico R sobre o resíduo e observar. C.2- Reação de Mitchell: Colocar 2 gotas de ácido sulfúrico contendo traço de nitrato de prata e observar. C.3- Reação com reativo sulfo-vanílico: Colocar 2 gotas de solução a 1% de vanilina em ácido sulfúrico R e observar. C.4- Reação de Rosenthal: Colocar 2 gotas de solução a 1% de vanilina em ácido clorídrico e observar. 2.9.4 Reações específicas Reação de Liebermann: foi redissolvido o resíduo do extrato clorofórmico em 3ml de ácido acético glacial. Adicionou-se uma gota de cloreto férrico SR e transferimos para um tubo de ensaio. Com cuidado, vertemos pela parede do tubo, 3ml de ácido sulfúrico R (sem misturar). Observou-se a superfície de contato dos dois líquidos. 2.9.5 Reações executadas sobre a solução clorofórmica.
3,0 g de droga - 0,7 g de cinzas 100 g de droga - x 3x = 70 x = 70/ x = 23,3 / 100 x = 0,23 g% de cinzas por grama. 3.3 DETERMINAÇÃO DE CINZAS EM ÁCIDO As cinzas insolúveis em ácido compreendem o resíduo obtido na fervura das cinzas totais com ácido clorídrico diluído, após filtragem, lavagem e incineração. O método destina-se a determinação de sílica e constituintes silicosos da droga através dos seguintes cálculos: 0,23 g em cinzas totais. A farmacopéia brasileira estabelece para drogas vegetais, teores máximos de cinzas insolúveis em ácido, entre 2,5 e 4% em sua terceira edição (BRASIL, 1988) e entre 2,0 e 6,0% na sua quarta edição (BRASIL, 1996) e para a quinta edição não são estabelecidos valores de cinzas insolúveis em ácido (BRASIL, 2010). 3.4 ALCALÓIDES Os alcaloides que contêm um átomo de hidrogênio em um anel heterocíclico são denominados de alcaloides verdadeiros sendo também classificados de acordo com sistema anelar presente na molécula. Os resultados, dados como positivos, apresentam algumas características, tais como: a) coloração amarelo claro com reativo de Sheibler; b) coloração amarelo tijolo com os reativos de Bouchardat, Bertrand e Dragendorff e, c) para o reativo de Bertrand o desenvolvimento de um precipitado floculoso branco, indicam a presença de alcaloides (PARISI; SILVA; CAMARGO, 2018).
Figura 1 – Resultado do teste evidenciando presença de alcalóide. Fonte: Os autores, 2020. 3.5 TANINOS Os taninos constituem substâncias fenólicas que são solúveis em água, e possuem massa molecular entre 500 e 3000 Dalton que apresentam a habilidade de formar complexos insolúveis em água com alcaloides, gelatinas e outras proteínas. De maneira tradicional estas substâncias podem ser classificadas de acordo com sua estrutura química em dois grupos: taninos hidrolisáveis (galotaninos e elagitaninos) e taninos condensados (PARISI; SILVA; CAMARGO, 2018). Os resultados dos testes deste estudo para taninos foram negativos, não havendo reação, tampouco mudanças de coloração que apontasse características positivas.
Figura 5 - A. 4 - Reação com Hidróxido de sódio: Reação precipitada. Fonte: Os autores, 2020. 3.7 GLICOSÍDEOS ANTRAQUINÔNICOS Os derivados antraquinônicos são frequentemente compostos alaranjados, algumas vezes observados in situ , como nos raios parenquimáticos do ruibarbo e cáscara-sagrada. Geralmente solúveis em água quente ou álcool diluído, podendo estar presentes nos fármacos na forma livre ou na forma de glicosídeo, ou seja, na qual uma molécula de açúcar está ligada nas formas de O- e C-glicosídeo, em várias posições (PARISI; SILVA; CAMARGO, 2018). Para este estudo, o resultado foi negativo, obtendo-se uma reação de cor amarela. Figura 6 - A.1- Identificação através de reação de Bornträeger. Resultado negativo (cor amarela). Fonte: Os autores, 2020.
Figura 7 - A.2: Identificação por processo de microssublimação Fonte: Os autores, 2020. 3.8 GLICOSÍDEOS CARDIOTÔNICOS Alguns esteroides presentes na natureza são caracterizados pela sua alta especificidade e poderosa ação que exerce no músculo cardíaco. Além disso, esses esteroides ocorrem como glicosídeos esteroidais e, devido a sua ação sobre o músculo cardíaco são denominados de glicosídeos cardioativos, cardíaco ou cardiotônico (PARISI; SILVA; CAMARGO, 2018). A realização do teste para verificar a presença ou ausência de cardiotônicos na matéria-prima vegetal, foi realizada após a preparação do extrato. Realizou-se o teste de Liebermann-Burchard com o objetivo de identificação do núcleo ciclopentanoperidrofenantreno, houve uma separação de fases, e coloração amarela clara, como observado na figura 8, resultado negativo para a identificação do núcleo esteroidal de glicosídeos cardiotônicos.
As saponinas são metabólitos secundários largamente distribuídos em plantas superiores e também em alguns organismos marinhos. São conhecidas por serem compostos surfactantes, não voláteis, além de apresentarem gosto amargo e acre. O termo saponina tem origem da palavra sapone , que em latim significa sabão. Esta nomenclatura é atribuída às moléculas de saponina que formam espuma persistente quando agitadas em solução aquosa. Esta substância pode ser usada como detergentes, agentes espumantes e emulsificantes (SANTOS, 2009). Os resultados dos processos físicos e químicos, das reações gerais (C.1 - Reações de Rossol, C.2 - Reação de Mitchell, C.3 - Reação com reativo sulfo – vanílico e C.4 - Reação de Rosenthalen), das reações específicas (Reação de Liebermann) e gerais (Reações com ácido Tricloroacético), podem ser visualizadas nas imagens a seguir.
Figura 10 – A - Processo físico: Reações espumas / B - Processo Químico / C.1 - Reações de Rossol / C.2 - Reação de Mitchell / C.3 - Reação com reativo sulfo – vanílico / C.4 - Reação de Rosenthalen / D - Reação de Liebermann / E - Reações com ácido Tricloroacético. Fonte: Os autores, 2020. CONCLUSÃO O estudo das plantas medicinais é uma atividade de caráter multidisciplinar e, que deve ser considerada sob vários aspectos a fim de garantir que a população terá acesso a formas de tratamento de qualidade. Conclui-se que todas as etapas realizadas no presente trabalho são importantes e devem ser recomendadas como parâmetros seguros para o controle de qualidade da droga vegetal Kalanchoe Daigremontiana. Fica ainda evidente que os testes que foram realizados nesse trabalho identificam a espécie o que contribui para o uso correto das plantas medicinais.
