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Os resultados de uma pesquisa sobre a estrutura da medula espinal de saguis, especificamente sobre as lâminas de rexed da coluna posterior. O estudo compara as diferenças entre grupos etários e gêneros, além de apresentar esquemas representativos das lâminas de rexed dos cornos posteriores das medulas espinais de representantes da região cervical, torácica e lombar da medula espinal dos saguis. O documento também discute as alterações bioquímicas relacionadas à estabilidade da área dos neurônios da substância cinzenta da coluna posterior.
O que você vai aprender
Tipologia: Slides
1 / 69
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SAGUI ( Callithrix jacchus ) Mestrando: João Faustino da Silva Neto Orientador: Expedito Silva do Nascimento Júnior NATAL-RN 2019
SAGUI ( Callithrix jacchus ) JOÃO FAUSTINO DA SILVA NETO Dissertação apresentada ao Programa de Pós- Graduação em Biologia Estrutural e Funcional (PGBIOEF) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte como parte dos requisitos para a obtenção do título de MESTRE EM BIOLOGIA ESTRUTURAL E FUNCIONAL , orientado pelo Prof. Dr. Expedito Silva do Nascimento Júnior. NATAL-RN 2019
SAGUI ( Callithrix jacchus ) JOÃO FAUSTINO DA SILVA NETO
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Orientador Prof. Dr. Fernando Vagner Lobo Ladd
Universidade Federal do Rio Grande do Norte - Membro Interno Prof. Dr. Paulo Leonardo Araújo de Gois Morais
Universidade do Estado do Rio Grande do Norte - Membro Externo
Dedico este trabalho a todas as pessoas que tornaram possível sua realização, em especial a minha família.
“A única coisa que temos e que mais ninguém tem somos nós mesmos. As nossas vozes, a nossa história, a nossa visão. Por isso, escrevam, desenhem, brinquem, dancem e vivam como só vocês conseguem” Neil Gaiman – escritor inglês em discurso no ano de 2012
O sagui de tufo branco ( Callithrix jacchus ) é um pequeno primata nativo do nordeste do Brasil e tem sido amplamente utilizado em modelos de pesquisa no mundo inteiro. A medula espinal do sagui possui as principais características da medula típica de mamíferos. Essa similaridade da medula espinal com outros primatas e com os humanos, além da facilidade de manejo, gestação curta e rápida formação de colônia, permite que os saguis sejam cada vez mais utilizados como modelos alternativos de primatas na pesquisa biomédica. Apesar de encontrarmos vários estudos associados ao encéfalo desses primatas, possuímos pouca informação sobre possíveis diferenças morfoquantitativas existentes substância branca e substância cinzenta da medula espinal de saguis. Isso evidência um pioneirismo importantíssimo frente a uma área de estudos tão escassa. Assim, este trabalho tem por objetivo caracterizar as diferenças morfológicas entre gênero e por idade na coluna posterior cinzenta da medula espinal do sagui. Analisando lâminas de Rexed através de técnicas citoarquitetônicas e verificando as principais diferenças entre os gêneros e idades dos animais. A caracterização citoarquitetônica foi obtida através da imunoistoquimica, morfometria dos corpos neuronais da coluna posterior desses primatas, além da análise estereologica sendo obtida através do método de Cavalieri. A característica serotoninérgica da medula espinal de saguis obtida pela imunoistoquímica mostra uma concentração de fibra reativas a 5-HT nas lâminas I, II e III, sendo corroborado pela literatura em diversos modelos animais. Os resultados do presente trabalho nos permitem chegar a uma estabilidade quanto aos aspectos bidimensionais entre os grupos “adulto/jovem macho” e “idoso macho” e entre os grupos “adulto/jovem macho” e “adulto/jovem fêmea” tanto em média de área (μm²) quanto em lâmina por lâmina. Essa estabilidade também é observada na média de volume em μm^3 da substância branca, substância cinzenta, coluna posterior e volume total da medula espinal de saguis comparando o grupo adulto/jovem macho e o idoso macho, assim como na comparação entre os grupos gêneros, com exceção do volume total da medula espinal que apresentou um aumento significativo (0,045) do grupo fêmea adulta/jovem em comparação ao grupo macho adulto/jovem. Palavras-chave: Saguis, medula espinal, coluna posterior, citoarquitetura, estereologia.
Figura 1: imagem histológica de medula espinal. ................................................... 12 Figura 2: lâminas de Rexed. ................................................................................... 14 Figura 3: Uma fotografia de uma seção transversal da medula espinhal de sagui no nível de C7 com lâminas de Rexed. ........................................................................ 15 Figura 4:sagui de tufo branco (Callithrix jacchus). .................................................. 20 Figura 5: Núcleo de primatologia-UFRN, corredor interno. ..................................... 20 Figura 6:Núcleo de primatologia-UFRN, fachada externa do biotério. .................... 20 Figura 7: região torácica da medula espinal sendo medida por paquimetro digital. Fonte: Laboratório de Neuroanatomia..................................................................... 24 Figura 8: Região toráxica da medula espinal sendo pesada em balança de precisão................................................................................................................... 24 Figura 9: esquema representativo de amostragem dos segmentos da medula espinal dos saguis. .................................................................................................. 26 Figura 10: sistema teste aplicado a uma fotomicrografia da medula espinal de sagui para contagem de pontos........................................................................................ 29 Figura 11: Corno posterior do segmento cervical do sagui. Coloração em Níssil. Em A é apresentado neurônios que formam a lâmina I, em B a lâmina II, em C a lâmina III, em D a lâmina IV, em E a lâmina V, em F a lâmina VI. ...................................... 32 Figura 12: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento cervical (C6) de um animal macho em A e fêmea em C (C8) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ..................... 33 Figura 13: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento torácico (T5) de um animal macho em A e fêmea em C (T6) utilizando o método de níssil .10X. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D.. ............ 34
Figura 14: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (L4) de um animal macho em A e fêmea em C (L3) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ..................... 35 Figura 15: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento sacral (S2) de um animal macho em A e fêmea em C (S3) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ..................... 36 Figura 16: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento cervical (C1) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (C4) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 37 Figura 17: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento torácico (T11) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (T5) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. .. 38 Figura 18: Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (S4) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (S4) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 39 Figura 19:Delimitação das lâminas de Rexed do corno posterior do segmento lombar (S4) de um animal idoso em A e adulto/jovem em C (S4) utilizando o método de níssil. Esquemas representativos dos respectivos cornos em B e D. ... 40 Figura 20: gráfico das áreas de neurônios em μm² das lâminas de Rexed entre grupos etários. ........................................................................................................ 42 Figura 21: gráfico das áreas de neurônios em μm² das lâminas de Rexed entre gêneros. .................................................................................................................. 43 Figura 22: Expressão imunohistoquímica de serotonina no segmento cervical da medula espinal de sagui em (A); (B) Ampliação da caixa em A, evidenciando fibras serotonérgicas no corno posterior ........................................................................... 45 Figura 23: Expressão imunohistoquímica de serotonina e representação das lâminas I, II e III no corno posterior da região cervical (A), torácica (B) e lombar (C)………………………………………………………………………………………….. 46
Tabela 1: dados e medidas macromorfométricas dos animais. .............................. 24 Tabela 2: Teste de significância da área total dos neurônios da coluna posterior entre grupos etários. ............................................................................................... 41 Tabela 3: Teste de significância das áreas dos neurônios das lâminas da coluna posterior entre grupos etários. Fonte: elaborado pelo autor.. .................................. 41 Tabela 4: Teste de significância da área total da coluna posterior entre gêneros.. 42 Tabela 5: Teste de significância das áreas dos neurônios das lâminas da coluna posterior entre gêneros. .......................................................................................... 43 Tabela 6: teste T para duas amostras do Vref. total entre gêneros. ....................... 47 Tabela 7: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre gêneros. 47 Tabela 8: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre gêneros. ................................................................................................................................ 48 Tabela 9: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre gêneros. ..... 48 Tabela 10: teste T para duas amostras do Vref. total entre grupos etários. .......... 48 Tabela 11: teste T para duas amostras do Vref. substância branca entre grupos etários. .................................................................................................................... 48 Tabela 12: teste T para duas amostras do Vref. substância cinzenta entre grupos etários. .................................................................................................................... 49 Tabela 13: teste T para duas amostras do Vref. coluna posterior entre grupos etários. .................................................................................................................... 49
5 - HT: serotonina NPY: neuropeptídio Y DAB: diaminobenzina
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1. INTRODUÇÃO 1.1. Anatomia geral da medula espinal. A medula espinal é um órgão do sistema nervoso central, localizada internamente ao canal vertebral, é limitada superiormente pelo bulbo do tronco encefálico, ao nível do forame magno, possuindo o limite inferior localizado entre a primeira (L1) e a segunda vértebra lombar (L2) (MACHADO e HAERTEL, 2013). É apresentada como um “cordão” de tecido nervoso, levemente achatada em seu eixo anteroposterior e apresentando duas dilatações, denominadas de intumescências cervical e lombossacral, as quais estão relacionadas a emergência das raízes nervosas que formam os plexos braquial, cervical e lombossacral. Percorrida longitudinalmente por sulcos e fissuras, acidentes anatômicos, que determinam uma relação com suas estruturas internas. Nota-se anteriormente uma fissura mediana anterior e posteriormente, o sulco mediano posterior, sendo visível apenas no nível cervical o sulco intermédio posterior. Lateralmente são observados também os sulcos laterais anterior e posterior, onde fazem conexão as raízes ventrais (motoras) e as dorsais (sensitivas) dos nervos espinais, respectivamente. (MACHADO e HAERTEL, 2013; MARTINEZ, et al. 2014). A medula espinal é formada por duas substâncias, a branca formada por concentrações de axônios mielinizados e a cinzenta, formada por uma concentração de corpos de neurônios (Fig.1). A substância branca, apresenta-se dividida em funículos anteriores, limitados pelos Figura 1 : imagem histológica de medula espinal. 2X. Fonte da figura: imagens histológicas cedidas pelo laboratório de histologia do UNI-RN.
13 sulcos laterais anteriores e a fissura mediana anterior, também são observados os funículos laterais, separados pelos sulcos laterais anteriores e posteriores, além dos funículos posteriores delimitados pelo sulco lateral posterior e o sulco mediano posterior, sendo o próprio funículo posterior é dividido em dois fascículos. O fascículo cuneiforme, mais lateral, responsável por conduzir os impulsos nervosos provenientes dos membros superiores e da metade superior do tronco e o fascículo grácil, responsável por conduzir impulsos nervosos dos membros superiores e metade inferior do tronco. (MACHADO e HAERTEL, 2013; MARTIN, 2013; COSENZA, 2013). A substância cinzenta é circundada pela substância branca e possui a forma da letra H
15 sensibilidade cutânea dos mecanorreceptores e nociceptores; classe 3, neurônios excitados apenas por nociceptores (BROW, 1981). Menétrey et al. (1977) subdividiu a classe 1 e 2 e ainda adicionou a classe 4 a partir dos seus estudos dos neurônios das colunas dorsais em ratos. A classe 1a são os neurônios que se excitam pelo movimento de pelos e o toque, a classe 1b representam os neurônios que se excitam a partir do movimento de pelos, toque e pressão ou pressão leve. A classe 2a dos neurônios é excitada pelos movimentos dos pelos, toque ou pressão e picadas, a classe 2b por pressão ou picada. A classe 4 tem a sua excitação devido aos movimentos articulares ou pressão de tecidos profundos. 1.2. Anatomia da medula espinal do sagui. A medula espinal de sagui possui 8 segmentos cervicais, 12 segmentos torácicos, 7 segmentos lombares, 3 segmentos sacrais e 4 coccígeos segmentos. Possuindo, assim como no humano, duas intumescências, a cervical e a lombar. A intumescência cervical se estende de C5 a T1 e a ampliação lombar de L3 a L6 no sagui. Os segmentos mais largos da medula espinal são encontrados no segmento cervical, seguidos pelo segmento lombar, torácico, sacral e coccígeo apresentado um par de nervos espinais a cada um dos segmentos espinais da medula espinal do sagui. (WATSON, et al., 2015; IWANAMI, et al., 2005). Em relação as lâminas de Rexed da coluna posterior da substância cinzenta da medula espinal dos saguis, a lâmina 1, a camada marginal, é uma lâmina fina que contém pequenos neurônios fusiformes. A lâmina 2 (substância gelatinosa) é dividida em zonas externa e Figura 3 : Uma fotografia de uma seção transversal da medula espinhal de sagui no nível de C7 com lâminas de Rexed. Fonte: WATSON, et al., 2015.
16 interna; contém pequenos neurônios arredondados ou ligeiramente alongados. As lâminas 3 e 4 formam o núcleo próprio do corno dorsal. A lâmina 3 é morfologicamente heterogênea, com neurônios arredondados, ligeiramente alongados e em forma de fuso. A lâmina 4 é uma lâmina mais espessa, com menor densidade de neurônios, alguns dos quais com treinos dendríticos que se parecem com antenas. A lâmina 5 é a camada mais larga do chifre dorsal, com neurônios triangulares, multipolares e em forma de fuso. A parte lateral da lâmina 5 é reticulada com feixes de axônios e consiste em grandes neurônios, enquanto a parte medial é compacta e composta de neurônios de pequeno a médio porte. A lâmina 6 é encontrada apenas nos aumentos cervical e lombossacral (WATSON, et al., 2015). 1.3. Características neuroquímicas da coluna posterior A medula espinhal tem uma rica inervação de serotonina (5-HT), que se supõe ser originário de neurônios localizado principalmente no complexo medular da rafe com pequenas contribuições do cinza central e a formação reticular (HADJICONSTANTINOU, M. et al., 1984). 5 - HT é o neurotransmissor mais amplamente distribuído no cérebro, embora seu conteúdo no SNC seja inferior a 5% do conteúdo de todo o corpo (JACOBS e AZMITIA, 1992). Nas décadas seguintes, ficou claro que as vias de sinalização do 5-HT estão envolvidas em funções cerebrais essenciais, incluindo processamento sensorial, controle cognitivo, regulação das emoções, controle autonômico e atividade motora (LESCH e WAIDER, 2012). As fibras nervosas imunorreativa a 5-HT foram distribuídas homogeneamente ao longo da medula espinal em todas as lâminas; entretanto, eram mais evidentes nas lâminas I, e X e menos evidentes nas lâminas VII (TORRES DA SILVA et al., 2016). A neuroquímica da coluna dorsal da medula espinal do sagui revela fibras bem definidas, contendo neuropeptídio Y (NPY), sendo mais densamente distribuídas nas lâminas apicais da coluna posterior. espinhal era escassa, sendo observada de forma mais densa nos níveis sacrais superiores (GIBSON et al, 1984a; GIBSON et al, 1984b).
