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Técnicas Experimentais
Muito do nosso atual conhecimento acerca da estrutura da matéria é baseado em investigações espectroscópicas. Informações sobre a estrutura molecular e sobre a interação de moléculas com seus vizinhos podem ser derivadas de diversos modos a partir dos espectros de emissão e absorção gerados quando a radiação interage com os átomos ou moléculas da matéria. Apresentamos aqui uma breve descrição sobre os processos de absorção e de fluorescência sob condições foto-estacionárias (excitação com uma fonte contínua).
Conceitos básicos
A luz, em seu aspecto ondulatório, é uma onda eletromagnética, que consiste de campo elétrico e magnético mutuamente perpendiculares que oscilam senoidalmente. Quando uma onda deste tipo encontra uma molécula, ela pode ser espalhada (sua direção de propagação muda) ou absorvida (sua energia é transferida à molécula). A probabilidade relativa de cada processo é uma propriedade da molécula particular encontrada. Se a energia eletromagnética da luz é absorvida, a molécula passa a um estado excitado. Uma molécula ou sua parte que pode ser excitada por absorção é chamada cromóforo. Esta energia de excitação é usualmente convertida em calor (energia cinética) pela colisão da molécula excitada com outra molécula (molécula do solvente). Em algumas moléculas é re-emitida em fluorescência. Em ambos casos, a intensidade da luz transmitida por um conjunto de cromóforos é menor que a intensidade da luz incidente. Uma molécula possui um conjunto de quantidades discretas (quanta) de energia, descritas pelas leis da mecânica quântica. Estas quantidades são chamadas níveis de energia da molécula. Os níveis principais de energias são determinados pelas possíveis distribuições espaciais dos elétrons e são chamados níveis eletrônicos de energia; sobre estes estão superpostos níveis vibracionais,
que indicam os vários modos de vibração da molécula. Há ainda subdivisões menores chamados níveis rotacionais. O nível eletrônico mais baixo é chamado estado fundamental e os outros são os estados excitados (Freifelder, 1982).
Figure 3.1 Esquemas para as probabilidades de transição de uma molécula envolvendo os estados vibracionais de dois estados eletrônicos, sendo R a distância internuclear. O mínimo de energia corresponde à distância de equilíbrio em cada estado eletrônico (www.chemkeys.com).
Espectro molecular Podemos expressar a energia total de excitação de uma molécula, com boa aproximação, como a soma das energias de excitações parciais dos níveis eletrônico, vibracional e rotacional mencionadas acima: E = Eel + Evib + Erot (3), onde os subscritos el, vib e rot significam eletrônica, vibracional e rotacional, respectivamente. As Figuras 3.1 e 3. ilustram os níveis vibracionais e rotacionais em dois estados eletrônicos de uma molécula, I e II, e as possíveis transições entre eles.
podem ser observados com espectroscopia Raman, assim como espectroscopia infravermelha. Espectros eletrônicos consistem de transições entre os níveis rotacionais dos vários níveis vibracionais de um estado eletrônico e os níveis rotacionais e vibracionais de um outro estado eletrônico. Isto é chamado de sistemas de bandas. Ele contém todas as bandas vibracionais da transição eletrônica em observação, cada uma das quais com sua estrutura rotacional. Em geral todos três números quânticos mudam nessas transições: J e v, e mais aquele que caracteriza o estado eletrônico (n, l, ml ou j e mj) (Alcantara, 2002).
Espectroscopia de Absorção
O intervalo de energia entre os estados rotacionais-vibracionais mais baixos do estado eletrônico fundamental e do primeiro estado eletrônico de uma molécula simples é, tipicamente, de 3,5 eV (~80 kcal/mol). Esta energia é muito maior do que a energia térmica à temperatura ambiente, de 0,025 eV (0,6 kcal/mol). Conseqüentemente, para toda finalidade prática, na ausência de radiação que possa excitar uma transição, todas as moléculas numa solução estão no estado eletrônico fundamental. O intervalo de energia entre níveis vibracionais é da ordem de 0,4 eV (~10 kcal/mol). Esta energia também é maior que a energia térmica. Assim, ao menos aproximadamente, podemos considerar que somente o nível vibracional mais baixo está apreciavelmente povoado. Entretanto, diferenças entre energias rotacionais são somente de 0,04 eV (1 kcal/mol) ou menos e, conseqüentemente, muitos níveis rotacionais são povoados (Cantor e Schimmel, 1998). A absorção de radiação visível ou ultravioleta (UV) próximo corresponde à excitação dos elétrons mais externos. Existem três tipos de transição eletrônica que podem ser considerados:
a. Transições envolvendo elétrons n, σσσσ e ππππ Absorção de radiação visível e ultravioleta em moléculas orgânicas é restrita a certos grupos funcionais da molécula que contêm elétrons de valência de baixa energia de excitação.
Transições σ → σ∗ Um elétron num orbital ligante σ é excitado ao correspondente orbital antiligante σ∗. A energia requerida é grande. Por exemplo, o metano (que tem somente ligações C-H e pode somente se submeter a transições σ → σ∗) mostra um máximo de absorbância em 125 nm. O pico de absorção, devido a estas transições, não é visto no espectro típico do ultravioleta e visível (200-700 nm).
Transições n → σ∗ Compostos saturados contendo átomos com pares solitários (elétrons não ligantes) são capazes de transições n → σ∗. Estas transições usualmente necessitam menos energia que as transições σ → σ∗. Podem ser iniciadas pela luz cujos comprimentos de ondas estão no intervalo 150-250 nm. O número de grupos funcionais orgânicos com picos n → σ∗ na região ultravioleta é pequeno.
Transições n → π∗ e π → π∗ A maioria da espectroscopia de absorção de compostos orgânicos é baseada em transições de elétrons n ou π para o estado excitado π∗. Isto se deve a que os picos de absorção para estas transições caem numa região experimentalmente conveniente do espectro (200 – 700 nm). Estas transições necessitam um grupo insaturado na molécula para fornecer os elétrons π. As absorções molares de transições n → π∗ são relativamente baixas e estão em intervalos de 10 a 100 M−1cm−1. Transições π → π∗ normalmente dão absorções molares entre 10^3 a 10^4 M−1cm−1.
Figura 3.3 Esquema de energias correspondentes a transições eletrônicas (SHU - School of Science and Mathematics: www.shu.ac.uk/schools/sci/chem/tutorials/).
Intensidade de absorção
Se a luz da intensidade I 0 passa através de uma substância de espessura b (em cm) e concentração molar c (M ou mol.L−1), a intensidade I da luz transmitida obedece à lei de Beer-Lambert:
I= Io ⋅ 10 −^ εb^ c ou log( Io/I) = εcb
Onde ε é o coeficiente de absorção molar. Os dados de absorção são reportados como transmitância ( T = I/ Io⋅ 100 %) ou, mais usualmente, como a
absorbância, A = log( Io I). Quando b = 1 cm, A é chamado de densidade óptica,
ODλ. A densidade óptica é mais conveniente porque é igual a ε c. O coeficiente de absorção molar é característico de uma substância em condições definidas de comprimento de onda, solvente e temperatura. Tem unidades M−1cm−1. A lei de Beer-Lambert tende a sofrer limitações devidas a certos desvios. Desvios químicos, que são resultados de alterações químicas associadas com a mudança de concentração, já que em soluções relativamente concentradas (> 0,01 M) a distância média entre as moléculas diminui e as interações entre as mesmas começam a afetar as distribuições de cargas. Isto pode alterar a habilidade das espécies absorverem num dado comprimento de onda e em alguns casos, quando c é alto, ε aparece ser uma função de c. Muitas moléculas, em algumas soluções, formam dímeros ou polímeros maiores à medida que a concentração aumenta, ocasionando certos problemas já que o espectro dos dímeros pode diferir daquele dos monômeros. Outro efeito em concentrações altas é a agregação; isto conduz freqüentemente ao espalhamento da luz, decrescendo a quantidade de luz transmitida. Outra causa do desvio da lei de Beer é a desnaturação de proteínas em baixas concentrações. Desvios e limitações instrumentais: dependem do equipamento e da forma como a medição é feita.
Espectrofotômetro
Um espectrofotômetro é formado por um conjunto de componentes do seguinte tipo:
Fontes de radiação. São lâmpadas que emitem feixes de radiação eletromagnética na região do espectro denominado óptico. Uma fonte ideal é aquela que apresenta uma intensidade aproximadamente constante em toda faixa de comprimento de onda de operação, com pouco ruído e longo período de estabilidade. As fontes mais comuns nos espectrofotômetros que operam na região espectral do UV-Visível são: as lâmpadas de deutério (tempo de vida: 1 000 h) para excitação na região do ultravioleta (λ < 350 nm) e de tungstênio ou tungstênio-halogênio (λ > 350 nm; tempo de vida 10 000 h) para excitação na região do visível e infravermelho próximo.
Componentes ópticos. Dependendo do tipo de componentes ópticos, os espectrofotômetros são classificados em: dispersivos e interferométricos. Elementos dispersivos são aqueles que difratam a luz, como os prismas e grades de difração. Elementos interferométricos são aqueles que produzem processos de interferência da radiação eletromagnética, como por exemplo o interferômetro de Michelson. No caso dos espectrofotômetros de absorção na região Ultravioleta - Visível - Infravermelho próximo, os instrumentos são sempre dispersivos e normalmente são grades de difração. A grade é um componente óptico que contém uma série de ranhuras, que são os elementos responsáveis pela difração da radiação eletromagnética baseada na lei de difração de Bragg. Dependendo do número de ranhuras por milímetro, haverá maior ou menor resolução dos espectros.
Detectores Duas grandes classes de espectrofotômetros estão disponíveis: os que utilizam como sistema de detecção um tubo fotomultiplicador e os que utilizam arranjo de diodos.
Algumas das bandas de absorção consistem de picos múltiplos e os comprimentos de onda correspondentes aos picos que têm coeficientes de absorção molar menores são freqüentemente registrados. Por exemplo:
Aminoácido (^) λλλλMAX (nm) 10 −−−−3^333 εεεε (M−−−−^1 cm−−−−^1 ) Triptofano 280 5, 219 47 274 1, 222 8,
Tirosina
193 48 257 0, 206 9,
Fenilalanina
188 60 Histidina 211 5, Cisteína 250 0,
O espectro de absorção dum cromóforo é principalmente determinado pela estrutura química da molécula. Entretanto, um número grande de fatores ambientais produz mudanças detectáveis em λMAX e ε. As características gerais destes efeitos ambientais são os seguintes: Efeitos de pH. O pH do solvente determina o estado de ionização dos cromóforos ionizáveis. Efeitos de polaridade. Para cromóforos polares, o valor de λMAX para transições n → π∗ ocorre em comprimentos de onda mais curtos em solventes polares (água, álcoois) do que em solventes não polares. Esta mudança dá-se em direção a comprimentos de onda maiores para transições π → π∗. Esta última transição é a mais comum para moléculas biológicas. Exceções são os aminoácidos que são geralmente usados em análises de conformação (Freifelder, 1982).
Espectroscopia de Emissão
A fluorescência é um tipo de luminescência que consiste no processo de emissão envolvendo estados eletrônicos de mesma multiplicidade de spin (estados eletrônicos singletes). Tais transições na mecânica quântica são "permitidas" e as taxas emissão são tipicamente perto de 10^8 seg−^1. Estas altas taxas de emissão dão como resultado um tempo de meia-vida de fluorescência perto a 10−^8 s ou 10 ns. Certas substâncias que apresentam fluorescência significativa, como por exemplo a antroil-ouabaína (Figura 2.11), geralmente têm elétrons deslocalizados presentes nas ligações duplas conjugadas. O diagrama sugerido por A. Jablonski para os níveis de energia ilustra o processo de absorção e emissão de luz (Figura 3.5).
Figura 3.5 Diagrama de Jablonski para o sistema de níveis de energia para a molécula de benzeno (www.chemkeys.com).
Na Figura 3.5, os diferentes tipos de processos para a desativação molecular dos estados eletrônicos e vibracionais excitados, estão representados por: transições radiativas permitidas por multiplicidade de spin (setas contínuas, ); transições radiativas proibidas por multiplicidade de spin (setas tracejadas, ); as transições não radiativas (setas onduladas, ∼∼), como no processo de relaxação
Figura 3.6 Esquema óptico de um espectrofluorímetro modelo SLM-500 Aminco (www.chemkeys.com).
Um espectrofluorímetro se diferencia de um espectrofotômetro nos seguintes elementos : Monocromador: composto por um arranjo óptico no qual uma fonte de luz policromática incidente se descompõe em seus diferentes comprimentos de onda através de uma grade de difração. Os comprimentos de onda para a excitação da amostra são selecionados pelo monocromador de excitação, e a radiação emitida é analisada pelo monocromador de emissão, sendo a intensidade da radiação emitida determinada pelo tubo fotomultiplicador, como nos espectrofotômetros. Fontes de radiação: nos instrumentos comerciais mais comuns a fonte de radiação é uma lâmpada de emissão contínua, que pode ser de xenônio e mercúrio. A lâmpada de xenônio emite praticamente em toda a região visível e ultravioleta (250 nm< λ <800 nm) e a de mercúrio emite, nesta mesma região, na forma de linhas. A lâmpada de xenônio oferece maior número de comprimentos de onda possíveis para a excitação da amostra, enquanto que a lâmpada de mercúrio oferece maior intensidade nos comprimentos de onda que emite. Um detalhe importante no espectrofluorímetro é que a radiação emitida pela amostra é focalizada na entrada do monocromador de emissão em um ângulo de
90 ° em relação à radiação incidente. Esta geometria é diferente daquela de um espectrofotômetro de absorção no qual a luz que emerge da amostra e vai para o detector tem a mesma direção da luz incidente. Isto se deve ao fato de que a intensidade de emissão é muito menor do que a intensidade da radiação de excitação, e conseqüentemente o sinal de emissão, se analisado na mesma direção da excitação, ficaria mascarado (Atvars e Martelli, 2002).
3.3. Fluorescência em proteínas
Quase todas as proteínas contêm fluoróforos naturais, já que os aminoácidos aromáticos tirosina, triptofano e fenilalanina são fluorescentes e contribuem à fluorescência (ultravioleta). A fluorescência intrínseca de proteína é geralmente excitada na máxima absorção perto de 280 nm, ou em comprimentos de ondas maiores. A fenilalanina não é excitada na maioria de situações experimentais. Além disto, o rendimento quântico da fenilalanina em proteínas é pequeno. A absorção de proteínas em 280 nm é devida a resíduos de tirosina e tripto- fano. Em comprimentos de ondas maiores do que 295 nm, a absorção é devida principalmente ao triptofano. A emissão da tirosina em água ocorre em 303 nm e é relativamente insensível à polaridade do solvente. O pico de emissão do triptofano em água ocorre em 348 nm e é muito dependente da polaridade (Lakowicz, 1983). Algumas regras empíricas para interpretar o espectro de fluorescência de proteínas:
- Toda a fluorescência de uma proteína é devida ao triptofano, tirosina e fenilalanina, a menos que a proteína contenha outro componente fluorescente.
- O λMAX de emissão do espectro de fluorescência do triptofano muda para comprimentos de ondas mais curtos e a intensidade de λMAX incrementa à medida que a polaridade do solvente decresce. a. Se λMAX é mudado a comprimentos de onda mais curtos quando a proteína está num solvente polar, o triptofano deve estar num ambiente interno e não polar. b. Se λMAX é mudado a comprimentos de ondas mais curtos quando a proteína esta num meio não polar, o triptofano está na superfície da
usada para determinar a conformação da proteína ou sua posição na membrana. Por suposto, a informação é limitada pelo número de resíduos de triptofano e pelo fato de que um triptofano não pode ser posicionado na região de interesse da proteína (Lakowicz, 1983).
Associação de ligantes a macromoléculas
Um evento comum nos sistemas vivos é a ligação não covalente de uma ou mais moléculas a uma macromolécula simples. Uma molécula ligada a uma macromolécula é chamada ligante. Existem muitos tipos de ligação. Por exemplo, uma molécula pode ter só um sítio de ligação simples ou pode haver muitos sítios. Os sítios podem ser idênticos ou diferentes e eles podem ser apenas para uma classe de moléculas ou diversas moléculas distintas. Além disso, múltiplos sítios podem ser interdependentes, no sentido em que a ocupação de um sítio por uma molécula ligante pode afetar a afinidade de outros sítios para seus ligantes.
3.4. Macromoléculas com um sítio de ligação
Considera-se uma molécula P que tem um sítio de ligação para uma molécula A. Na saturação, um mol de P combina-se com um mol de A para formar um complexo PA. P + A↔ PA (1) A constante de dissociação KD para essa reação é definida como:
[ ]
[ ][ ]
PA
K P A
D = (2)
Definindo-se r como o número de moles de moléculas ligadas a um mol de macromoléculas, então:
[ ] [ ]
[ ]
[ ]
[ ]
P PA
PA
P
r A TOTAL
LIGADA = = + (3)
A maioria das equações que descrevem ligação são expressas em termos de KD e r. Para avaliar r, uma concentração particular [A’] de ligantes é somado a uma conhecida concentração [P’] das macromoléculas e então a concentração de
ligantes ligados [PA] ou de ligantes não ligados [A] são medidos. Onde: [A’] = [A]
- [PA] e [P’] = [P] + [PA]. Combinando as equações 2 e 3:
(^1) r (^) = (^) [KA D]+ 1 (4) Usando esta equação, o gráfico de 1/r contra a 1/[A] é uma linha reta cujo coeficiente angular é KD.
3.4. Macromoléculas com vários sítios de ligação.
Muitas macromoléculas biológicas têm mais de um sítio de ligação. Por exemplo, uma típica molécula de proteína pode algumas vezes ligar vários centros de íons de H+. Ademais, os sítios de ligação não sempre são idênticos. Múltiplos sítios de ligação podem ser independentes ou interativos, no caso em que a ocupação de um sítio influi na ligação de um segundo sítio. Discutiremos aqui sítios de ligações independentes.
Ligações fortes No caso de ligações firmes, assume-se que cada molécula ligante está ligada se o número total de moléculas ligantes adicionadas for menor que o número total de sítios de ligações na solução. Também, se a quantidade de ligante adicionado excede ao número n de sítios de ligação na solução, cada um dos sítios n é ocupado e os ligantes adicionais permanecem sem ligar. A partir da concentração de ligante na qual algumas moléculas ficam sem ligar, o número de sítios de ligação pode ser medido, isto é, a concentração na qual a quantidade de moléculas ligadas alcança um máximo.
Ligações fracas
Sítios de ligação fracos independentes e idênticos: Se todos os sítios são idênticos e independentes vamos ter a seguinte equação:
[ ]
n A
K
r n
= +^ D
na qual KD é uma constante de dissociação média. Quando a equação (5) é usada, um gráfico 1/r em função de 1/[A] nos dá uma linha reta. Se os sítios de
