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Este documento discute sobre os agentes infecciosos associados à anemia hemolítica em gatos, incluindo mycoplasma haemofelis, candidatus mycoplasma haemominutum e cytauxzoon felis. Apresenta informações sobre as espécies, sintomas, patogenicidade e distinção morfológica entre elas, além de métodos de diagnóstico como pcr e visualização em lâmina. O documento também discute sobre a importância de co-fatores na manifestação clínica da doença.
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Tipologia: Provas
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FIRMINO, F.P. Estudo da infecção por hemoplasmas em felinos domésticos do Distrito Federal. Brasília:Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, Universidade de Brasília, 2008, 67 p. Dissertação de Mestrado.
Página PREFÁCIO ix RESUMO x ABSTRACT xi CAPÍTULO I Introdução 1 Referencial Teórico 3 Objetivos 11 Referências 12 CAPÍTULO II Título do Artigo 16 Introdução 16 Material e Métodos 18 Resultados 22 Discussão 32 Conclusões 36 Referências 37 CAPÍTULO III Considerações Finais 41 ANEXOS 42
conhecida como hemoplasmose. Mycoplasma haemofelis é capaz de causar anemia severa em gatos, enquanto Candidatus Mycoplasma haemominutum ainda tem sido associado a doenças imunossupressoras (Sykes et al., 2007). Por outro lado, Mycoplasma haemofelis pode também ser considerado um agente oportunista, estando presente em animais sadios e levando a doença quando esses animais são estressados por outras doenças e procedimentos cirúrgicos (Harvey, 2006). Animais de três anos, ou menos, com anemia, FeLV positivos, com histórico de abscessos por mordidas e com acesso a rua fazem parte do chamado “grupo de risco”, animais considerados portanto, susceptíveis a infecção pelos hemoplasmas e outras doenças infecciosas (Jain, 1993). As limitações no estudo da hemoplasmose estavam no fato de que até recentemente o diagnóstico era realizado apenas por meio da identificação citológica em esfregaços sanguíneos. No entanto, o desenvolvimento de novos métodos moleculares tem facilitado a sensibilidade e a especificidade da identificação destes agentes. Ainda pouco se sabe a respeito do Candidatus Mycoplasma turicensis (Willi et al, 2005).
O presente trabalho teve por objetivo identificar as espécies infectantes dos felinos domésticos do Distrito Federal por meio da PCR e digestão enzimática e analisar o aspecto hematológicos dos animais estudados infectados ou não por hemoplasma.
Etiopatogenia
Mycoplasma haemofelis foi descrito em 1942 por Clark como um eperitrozoon infeccioso de gatos anêmicos no Sul da África, denominado então como sendo da espécie Eperythrozoon felis. Em 1953, foi descrito um organismo semelhante causando anemia infecciosa em gatos nos EUA e, finalmente, em 1955 foi classificado como Haemobartonella felis (Lappin e Tasker, 2002).
Mycoplasma haemofelis é um agente de 0,5 - 0,6 μm Gram - negativo inicialmente classificado como pertencente à família Anaplasmacetae, ordem Rickettsias, não cultiváveis em ágar, chamado de Haemobartonella felis (Stoffregen et al., 2006; Foley, 2001; Messick et al., 1998; Berent et al., 1998;). Recentemente, com o seqüenciamento do gene 16S rRNA, o agente foi reclassificado como pertencente à família Mycoplasmatacetae (Berent et al., 1998). O microorganismo é altamente pleomórfico (Jain, 1993a) e é parasita obrigatório de eritrócitos (Souza e Almosny, 2002). Uma membrana simples recobre o organismo e o citoplasma é composto de grânulos que variam de tamanho e densidade, podendo ainda ser visualizados organelas e vacúolos no citoplasma (Harvey, 2006). O organismo aparece na superfície
dos eritrócitos, podendo ter formato discóide, de pequenos anéis, hastes, vírgula ou cocos. Freqüentemente as formas cocóides aparecem formando correntes cruzando a célula (Souza e Almosny, 2002). O eritrócito parasitado geralmente perde a forma bicôncava e assume a forma de esferócitos e estomatócitos. A adesão do parasita à membrana dos eritrócitos é feita por pontos intermitentes de contato (Harvey, 2006).
O seqüenciamento do gene ribossomal resultou também no conhecimento de duas diferentes espécies: H. felis forma pequena, também conhecida como cepa H.felis California denominada Candidatus Mycoplasma haemominutum e H. felis forma grande , também conhecida como cepa H. felis Illinois agora denominada Mycoplasma haemofelis (Willi et al., 2005; Kewish et al., 2004). A similaridade gênica entre esses organismos é de aproximadamente 83% (Harvey, 2006). Uma nova espécie foi identificada em animais na Suíça, o Candidatus Mycoplasma turicensis, associado à relatos de anemia hemolítica severa, que possui filogenéticamente uma maior proximidade com espécies infectantes de roedores como Mycoplasma haemomuris e Mycoplasma coccoides (Willi et al., 2006; Sykes et al., 2007). Embora incomum, a co-infecção com hemoplasmas vem sendo reportada (Sykes et al., 2007). O Mycoplasma haemofelis contém RNA e DNA e replica por fissão binária. A transmissão pode ocorrer através de artrópodes hematófagos, como pulgas e carrapatos, feridas causadas por mordeduras, transfusão sanguínea e transplacentária (Harvey, 2006). Devido à mobilidade e não- especificidade, a pulga, como a Ctenocephalides felis, parece ser o principal vetor (Souza e Almosny, 2002). A anemia hemolítica causada pelo Mycoplasma spp é conhecida também como hemoplasmose. As espécies incluem o prefixo “haemo-” por indicar os únicos mycoplasmas que parasitam eritrócitos. Haemoplasmas foi proposto como um nome geral para esses mycoplasmas hemotrópicos (Harvey, 2006). A doença foi primeiramente descrita em 1953 por Flint & Moss no Colorado, EUA, que relataram ter notado pequenos corpúsculos arredondados sobre ou aparentemente aderidos às hemácias de um gato infectado naturalmente, que eram similares em aparência ao Anaplasma marginale do bovino, exceto por não estarem distribuídos somente na periferia das hemácias onde, como conseqüência da infecção natural, o gato apresentava-se anoréxico, debilitado e com marcada anemia (Souza e Almosny, 2002).
O Mycoplasma haemofelis pode ser comensal em gatos sãos e a infecção pode resultar em doença aguda quando os gatos infectados são submetidos a condições de estresse ou acometidos por infecções ou doenças concomitantes, como a infecção pelo vírus da leucemia felina (FeLV), vírus da imunodeficiência felina (FIV), diabetes, dentre outras (Harvey, 2006). Os gatos portadores podem servir como reservatório da infecção. A infecção crônica de animais com Mycoplasma haemofelis pode levar a
neutrófilos, eosinófilos e linfócitos e a presença de parasitos ou fase da doença. Monocitose e presença de monócitos bizarros são comuns na fase aguda. Mycoplasma haemofelis pode induzir neutrofilia extrema. Um exame de medula óssea revela acentuado aumento na eritropoiese e decréscimo na proporção mielóide-eritróide (Souza e Almosny, 2002).
Na fase aguda da hemoplasmose, as mudanças na concentração das proteínas plasmáticas tendem a seguir com as mudanças no hematócrito. O índice de icterícia do plasma aumenta durante a fase aguda e geralmente inicia no mesmo dia ou no dia seguinte que o hematócrito diminui significativamente, devido hemólise (Souza e Almosny, 2002).
Sinais Clínicos
A infecção pode ser assintomática na doença subclínica com anemia discreta em 25 a 35% dos casos, variando para uma severa anemia hemolítica (Souza, 2003). Os sintomas observados são: depressão, fraqueza, anorexia, perda de peso, palidez de mucosas, esplenomegalia e, às vezes, icterícia. Além disso, podem ocorrer sintomas como febre, gengivite, uveíte, linfadenopatia, refletindo hematopoiese extramedular (ISHAK et al., 2007). Na infecção típica por Mycoplasma haemofelis é comum a ocorrência de anemia regenerativa com reticulócitos, anisocitose, macrocitose e policromasia (Lappin e Tasker, 2002). A ausência de anisocitose ou policromasia acentuadas nos casos confirmados de hemoplasmose felina pode sugerir infecções superagudas com um tempo demasiadamente pequeno para responder ou infecção intercorrente com FeLV ou FIV (SOUZA E ALMOSNY, 2002). Os sintomas estão na dependência do estágio da doença e da rapidez com que se desenvolve a anemia. Se a anemia se desenvolver gradualmente, o gato pode exibir perda de peso, mas se mantém vivaz e alerta. Ao contrário, a diminuição precoce acentuada do hematócrito em associação com a parasitemia grave pode causar pouca diminuição de peso corporal, mas uma marcante depressão mental. A temperatura retal é normal, exceto na fase aguda, quando se encontra aumentada e na fase terminal da doença pode se encontrar diminuída (Souza, 2003).
Gatos que se recuperam da infecção aguda se tornam cronicamente infectados por meses ou anos, se não por toda a vida. Gatos portadores estão clinicamente saudáveis, apresentando hematócrito dentro dos valores de referência ou anemia regenerativa leve. Em alguns animais, podem ser detectados um pequeno número de organismos, mas normalmente, estes não são visualizados pelo fato de terem atingido um estágio de equilíbrio com o hospedeiro (Harvey, 2006). Cabe salientar que o M. haemofelis pode ser um agente oportunista, estando presente em animais sadios e levando a doença quando esses animais são estressados por outras doenças e procedimentos cirúrgicos. O aparecimento da doença causada pelo Mycoplasma haemofelis em gatos
está intimamente ligado com a infecção destes com o vírus da FeLV, onde, em torno de 40% a 50% dos animais com a clínica de hemoplasmose são FeLV positivo, pois o FeLV pode suprimir a resposta imunitária dos gatos, aumentando a suscetibilidade do animal. Mycoplasma haemofelis e FeLV geralmente resultam em anemia mais severa do que em animais com apenas um dos agentes. Em contraste, a infecção pelo FIV não parece aumentar a gravidade da anemia quando associado ao Mycoplasma haemofelis (Harvey, 2006). Até o presente momento, poucas informações existem a respeito da infecção pelo Mycoplasma haemominutum. Uma infecção intensa pode ocorrer sem que o animal apresente grande redução do hematócrito, nos casos de anemia regenerativa. Gatos coinfectados com Mycoplasma haemofelis, M. haemominutum e FeLV, apresentam anemia mais severa quando comparada a infecção causada apenas por M. haemominutum. No entanto, o estresse da infecção por M. haemominutum pode levar ao desenvolvimento de anemia (Guimarães at al., 2007) e doença mieloproliferativa em animais com FeLV (Harvey, 2006). O hemoplasma Candidatus Mycoplasma turicensis é ainda pouco estudado (Yu et al., 2007). Até o presente momento, pesquisas mostraram que gatos livres de patógenos infectados experimentalmente com Candidatus Mycoplasma turicensis apresentaram anemia de moderada a severa, no entanto experimentos com gatos sugerem que co-fatores como imunossupressões iatrogênicas ou retrovirais, podem estar envolvidos no desenvolvimento da anemia em animais infectados (Willi et al., 2006, Fujihara et al., 2007).
Diagnóstico
O diagnóstico é, em geral, estabelecido pela visualização do parasita na superfície dos eritrócitos em esfregaços corados de sangue periférico (Inokuma et al., 2004; Lappin e Tasker, 2002). O parasita pode ser encontrado na superfície de eritrócitos isolados, em pares ou em correntes quando há uma alta infecção (Lappin e Tasker, 2002). A ocorrência cíclica da parasitemia em casos agudos pode dificultar a visualização do parasita na lâmina, o que indica que a ausência do parasita não exclui a infecção. Desta maneira, a preparação de múltiplos esfregaços no período de 24 horas ou durante alguns dias pode aumentar as chances de obtenção de um diagnóstico positivo (Lappin e Tasker, 2002). Por outro lado, o agente pode ser confundido com corpúsculos de Howell-Jolly, debris celulares e artefatos, levando a falsos positivos (Lappin e Tasker, 2002). O exame citológico de esfregaço sanguíneo, portanto, possui pouca sensibilidade e especificidade (Sykes et al, 2007). Quando comparado ao Mycoplasma haemofelis, o agente Mycoplasma haemominutum é raramente visto em esfregaços sangüíneos e quando presente é difícil de ser identificado por ser pequeno (Harvey, 2006). Cabe ainda salientar que os hemoplasmas ainda não podem ser diagnosticados por cultivo celular (Criado - Fornélio et al., 2003; Messick et al., 1998; Berent e Messick, 2003).
O presente trabalho teve por objetivos: identificar a ocorrência e os agentes causadores da hemoplasmose felina em animais de um mesmo perfil (com contato com a rua e com possíveis vetores da doença) oriundos de diferentes regiões do Distrito Federal. determinar as principais alterações hematológicas apresentadas pelos animais infectados e verificar a eficiência do exame molecular como método de diagnóstico de animais sintomáticos e assintomáticos.
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A hemoplasmose é causada pelo Mycoplasma spp, um importante agente causador de anemia hemolítica em gatos, principalmente os animais com acesso a rua que entram em contato com um de seus vetores como a pulga (Ishak et al., 2007). As espécies incluem o prefixo “haemo-” por indicar os únicos micoplasmas que parasitam eritrócitos. Foram, portanto, denominados Haemoplasmas, como um nome geral para esses micoplasmas hemotrópicos (Harvey, 2006).
Pelo menos três espécies deste gênero infectam gatos: Mycoplasma haemofelis , Candidatus Mycoplasma haemominutum e Candidatus Mycoplasma turicensis (Peters et al., 2007). Mycoplasma haemofelis é capaz de causar anemia severa em gatos, enquanto Candidatus Mycoplasma haemominutum ainda tem sido associado a doenças em gatos imunocompetentes. A terceira espécie, recentemente descoberta, Mycoplasma turicensis ainda vem sendo alvo de mais estudos (Sykes et al., 2007; Peters et al., 2007). Em estudo de infecções experimentais, Mycoplasma haemofelis é, aparentemente mais patogênico que Candidatus Mycoplasma haemominutum , e no caso deste último, há suspeita da influência de infecções retrovirais em sua manifestação clínica (Willi et al., 2006). Isto tem sido evidenciado pelo fato de que gatos infectados experimentalmente com Candidatus Mycoplasma haemominutum exibiram sinais clínicos mínimos, geralmente sem indução de anemia, enquanto infecção por Mycoplasma haemofelis frequentemente, resulta em anemia hemolítica severa. Por outro lado, o Mycoplasma haemofelis pode ser um agente oportunista, estando presente em animais sadios e levando a doença quando esses animais são estressados por outras doenças e procedimentos cirúrgicos. Cabe salientar que o aparecimento da doença causada pelo Mycoplasma haemofelis em gatos está intimamente ligado com a infecção destes com o vírus da FeLV, onde, em torno de 40% a 50% dos animais com a clínica de hemoplasmose são FeLV positivo, pois o FeLV pode suprimir a resposta imunitária dos gatos, aumentando a suscetibilidade do animal. A associação Mycoplasma haemofelis e FeLV geralmente resultam em anemia mais severa do que em animais com apenas um dos agentes (Willi et al., 2005). O chamado grupo de risco inclui animais de três, ou menos, com acesso a rua, anemia, FeLV positivos, com histórico de abscessos por mordidas (Jain, 1993a).
O diagnóstico do Mycoplasma haemofelis é, em geral, estabelecido pela visualização do parasita na superfície dos eritrócitos em esfregaços corados de sangue periférico, uma vez que o agente não pode diagnosticado por cultivo celular (Messick et al., 1998; Lappin e Tasker, 2002; Criado - Fornélio et al., 2003; Berent e Messick, 2003; Inokuma et al., 2004). O parasita pode ser encontrado na superfície de eritrócitos em formas isoladas, em pares ou ainda em correntes quando há uma alta infestação. A ocorrência cíclica da parasitemia em casos agudos pode dificultar a visualização do parasita na lâmina, o que indica que a ausência do parasita não exclui a infecção. Desta maneira, recomenda-se a preparação de múltiplos esfregaços no período de 24 ou durante alguns dias para aumentar as chances de obtenção de um diagnóstico positivo. Por outro lado, o agente pode ser confundido com corpúsculos de Howell- Jolly, debris celulares e artefatos, levando a falsos positivos (Lappin e Tasker, 2002). O exame citológico de esfregaço sanguíneo, portanto, possui pouca sensibilidade e especificidade (Sykes et al., 2007).
Mycoplasma haemominutum é raramente visto em esfregaço e quando presente é difícil de ser identificado por ser pequeno (Harvey, 2006). É difícil também, a distinção morfológica entre as espécies Mycoplasma haemofelis e Candidatus Mycoplasma haemominutum (Harvey, 2006). O advento da tecnologia da incrementou a habilidade de detectar os hemoplasmas, sendo conhecidamente mais
Grupo 2 : composto de 49 animais semi-domiciliados residentes na área da Fercal, região periurbana de Brasília, abordados em suas residências.
Hematologia
Todas as amostras foram submetidas a hemogramas completos, realizados no Laboratório de Patologia Clínica Veterinária da Universidade de Brasília. Com a utilização de um contador automático de células para uso veterinário (CC-550 - CELM) foram determinados o número total de hemácias, leucócitos e a concentração de hemoglobina. A quantidade de plaquetas foi estabelecida pela contagem manual em câmera de Neubauer diluídas (1:100) em solução de Brecher (oxalato de amônio 1%). Para a determinação do volume globular (VG) foi utilizada a técnica do micro-hematócrito. As proteínas plasmáticas totais foram determinadas por refratometria. Os índices hematimétricos (concentração de hemoglobina corpuscular média – CHCM e volume corpuscular médio – VCM) foram obtidos por cálculo. O diferencial leucocitário foi realizado manualmente, através da identificação de 100 células em esfregaço sangüíneo corado com corante Panótico, utilizando objetiva de 100 vezes. Todas as amostras foram submetidas à pesquisa de hemoparasita, realizada por meio de exame citológico (esfregaço sanguíneo) e Reação de Polimerase em Cadeia ( Polimerase Chain Reaction - PCR). Após a realização dos hemogramas, o restante do sangue foi centrifugado (2500 rpm/5min) para a separação do plasma e da capa de células. Tanto o plasma quanto a capa de células foram congelados (-20° C) até o momento da extração do DNA e realização da PCR.
Reação de Polimerização em Cadeia (PCR)
A extração do DNA foi realizada utilizando-se kit comercial (QIAamp DNA Blood Mini Kit - Qiagen), seguindo-se o protocolo sugerido pelo fabricante. As amostras de DNA foram mantidas a -20° C até o momento da realização da PCR.
Foram utilizados dois pares de oligonucleotídeos para a identificação dos hemoplasmas de acordo com o gênero ( Mycoplasma spp) e espécie ( Mycoplasma haemofelis ). Os animais de ambos os grupos foram testados.Onde para a realização da PCR Universal Mycoplasma spp. Foram utilizados os oligonucleotídeos: HBT-F e HBT-R (Tabela 1) conforme descrito por Criado-Fornélio et al (2003). As reações consistiram de aproximadamente 2 ng de DNA, 1X tampão de PCR, 2,5 mM MgCl2 , 0,25 mM de cada deoxinucleotídeo, 0,5 μM de cada oligonucleotídeo e 1,0U de Taq DNA polimerase resultando em um volume final de 50μL. A PCR foi realizada em um termociclador (FTGene5D – Techgene) utilizando- se o seguinte protocolo: desnaturação inicial a 94° C por dez minutos, seguida de 40 ciclos: 94ºC por 30 segundos, 50ºC por 30 segundos e 72ºC por 30 segundos e posterior extensão final 72ºC por dez
minutos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1.0%, corados com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta resultando em produtos de 595pb para fragmento de Mycoplasma haemofelis e 618pb para fragmento de Mycoplasma haemominutum nos animais positivos. Foram utilizados controles negativo (água) e positivo (DNA de gato doméstico positivo para Mycoplasma spp.). Os produtos de PCR obtidos de animais positivos no PCR Universal, foram submetidos à digestão enzimática com a enzima Eco RI (REact ® - Invitrogen, EUA) que produz dois fragmentos, 269 pb e 349 pb, para determinação da infecção pela espécie Candidatus Mycoplasma haemominutum , a enzima não é capaz de cortar produtos de Mycoplasma haemofelis, conforme descrito por Criado- Fornélio et al (2003). A reação consistiu em 1,0 unidade da enzima EcoRI, tampão 10X apropriado, 1μg de produto de PCR, resultando em um volume final de 15 μL (Brooks, 1987). A solução foi mantida em banho-maria a 37°C por duas horas e submetida à eletroforese em gel de agarose 1.5%, corados com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta. Para a reação da PCR foram utilizados os oligonucleotídeos Fl e R3 (Tabela 1), específicos para o gene 16S rRNA do hemoplasma Mycoplasma haemofelis, conforme descrito por Berent et al (1998). As reações consistiram de aproximadamente 10 ng de DNA, 1X tampão de PCR, 3,0 mM MgCl2 , 0,15 mM de cada deoxinucleotídeo, 0,6 μM de cada oligonucleotídeo e 1,5U de Taq DNA polimerase resultando em um volume final de 25μL. A PCR foi realizada em um termociclador (FTGene5D – Techgene) utilizando-se o seguinte protocolo: desnaturação inicial a 94° C por dez minutos, seguida de 40 ciclos: 94ºC por 45 segundos, 54ºC por 45 segundos e 72ºC por 45 segundos e posterior extensão final 72ºC por sete minutos. Os produtos da PCR foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 1.5%, corados com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta resultando em um produto de 393pb nos animais positivos. Para cada reação utilizaram-se controles negativo (água) e positivo (DNA de gato doméstico com hemoplasmose). Tabela 1. Oligonucleotídeos utilizados para as PCRs para Mycoplasma spp. e Mycoplasma haemominutum Oligonucleotídeos Seqüência Fonte HBT-F ATA CGG CCC ATA TTC CTA CG
Criado-Fornélio et al., 2003
HBT-R TGC TCC ACC ACT TGT TCA Criado-Fornélio et al., 2003 FI GAC TTT GGT TTC GGC CAA GG e R3: CAG AGT ACT ATC ATA ATT ATC CCT C
Berent et al., 1998
Berent et al., 1998
