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DETERMINACION DE

COLESTEROL

OBJETIVOS

 Asegurar que los resultados de las pruebas sean precisos, respaldando la interpretación dada.  Optimizar los procesos de laboratorio para mejorar la eficiencia, y la investigación basándose en reacción enzimática  Destacar la importancia del colesterol en el metabolismo humano y el riesgo que pueda presentarse

UNIVERSIDAD

NUESTRASEÑORA

DE LA PAZ

PRACTICA

DETERMINACION DE COLESTEROL

FUNDAMENTO

El colesterol es un lípido de gran importancia biológica que se encuentra normalmente en los tejidos corporales. Es un constituyente fundamental de las membranas celulares y constituye el precursor de las hormonas esteroides, de una pro vitamina D y de los ácidos biliares. Puede obtenerse de la dieta, a partir de productos de origen animal que lo contiene está presente en muchos alimentos que consume el ser humano. También puede sintetizarse (COLESTEROL ENDOGENO) en el hígado y en otros tejidos, se transporta en la sangre de los vertebrados, en concentraciones variables, como componente del plasma sanguíneo, principalmente formando parte de estructuras lipoproteícas complejas.

LAS LIPOPROTEINAS

El componente lípido puede ser colesterol libre y esterificado y fosfolípidos, en composición y proporción que varía en dependencia de la lipoproteína en particular. Mediante la ultra centrifugación se han reconocido 4 tipos principales de lipoproteínas los quilomicrones, las lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL) las de baja densidad (LDL) y las de alta densidad (HDL) LIPOPROTEINAS DE ALTA DENSIDAD (HDL) Las lipoproteínas de alta densidad, o HDL (d<1,21g/ml, >1,063g/ml), se caracterizan por su contenido en apo A-I, teniendo también como componente principal los ésteres de colesterol. Su síntesis depende, por una parte, del catabolismo de las partículas ricas en triglicéridos (quilomicrones y VLDL) y, por otra parte, de la síntesis de apo A-I, en un principio no asociada a lípidos, por parte del hígado y del intestino. LIPOPROTEINAS DE BAJA DENSIDAD (LDL) Las lipoproteínas de baja densidad, o LDL (d<1,063g/ml, >1,019g/ml), se caracterizan por su contenido en apoB-100 y tienen como componente lipídico mayoritario los ésteres de colesterol. LIPOPROTEINAS DE DENSIDAD INTERMEDIA (IDL) Las lipoproteínas de densidad intermedia, o IDL (d<1,019g/ml, >1,006g/ml) son un grupo minoritario de lipoproteínas que, como se ha mencionado, tienen una composición apolipoproteica similar a las de VLDL. Estas lipoproteínas son, sin embargo, más pequeñas y densas que aquellas, presentando una menor proporción relativa de triglicéridos respecto al colesterol, como corresponde a su origen mayoritario como producto del lipólisis de las VLDL. LIPOPROTEINA DE MUY BAJA DENSIDAD Las lipoproteínas de muy baja densidad, que suelen denominarse por sus iniciales en inglés, VLDL, son también partículas grandes, poco densas (d<1,006g/ml) y muy ricas en triglicéridos. También tienen una composición apolipoproteica similar a los quilomicrones, salvo en 2aspectos esenciales: no contienen apo A-I y presentan la forma completa de apo B (apoB-100) porque en el hígado, lugar de síntesis de VLDL, no se expresa la enzima editora de la apo B. La apoB- 1 00 es la proteína estructural de VLDL y de las lipoproteínas que se sintetizan en buena parte a partir de su catabolismo: IDL y LDL y Lp (a). El principal estímulo para la síntesis de VLDL parece ser la captación y el catabolismo de quilomicrones residuales por parte del hígado.

DIETA Y METABOLISMO DE LAS LIPOPROTEINAS

Las modificaciones de la dieta pueden modular los niveles de lipoproteínas circulantes, existiendo una gran variabilidad en la respuesta individual, la que se supone genéticamente condicionada. Colesterol de la dieta : Una gran proporción de la población puede mantener niveles aceptables de colesterol plasmático frente a un amplio rango de ingestión de colesterol. Ello se debe a una contra regulación de la síntesis endógena, esto es a mayor ingesta menor síntesis y viceversa, como vimos anteriormente. También existe una contra regulación de su absorción intestinal que oscila entre 40 a 60%. Sin embargo, existe una proporción de la población que responde incrementando significativamente los niveles del colesterol de LDL del suero. Estos sujetos presentan un defecto genético subyacente, ya sea una disminución del número y actividad de los receptores de LDL (como se ha descrito en el hipercolesterolemia familiar) o de los mecanismos de contra regulación hepática o intestinal. En estas personas que responden con incremento en los niveles del colesterol de LDL, en muchas ocasiones se ha producido una reducción en el número de receptores hepáticos y periféricos de LDL. Al existir una mayor disponibilidad hepática de colesterol, se generan señales genéticas que reducen la síntesis de receptores. Ello interfiere con la clarificación de LDL y eleva sus niveles séricos. Grasas (TAG) en la dieta: Las grasas saturadas e hidrogenadas elevan los niveles del colesterol de LDL y las mono y poliinsaturadas lo reducen. El mecanismo por el cual ejercen este efecto, aún es materia de controversia científica. Se postula que modulan la expresión de los receptores de LDL y que ello se realiza a través de cambios de la expresión de la acil colesterol acil transferasa (ACAT), enzima clave en la esterificación del colesterol intracelular. Las grasas saturadas reducen su expresión, incrementando la proporción de colesterol libre en el hígado, a lo que sigue una reducción de la síntesis de receptores de LDL. En cambio, el mono insaturado y el poliinsaturado, incrementan la expresión de la ACAT, reduciendo el contenido de colesterol libre y aumentando la expresión de los receptores de LDL. Las grasas poliinsaturadas, especialmente las marinas (ω- 3), reducen la síntesis y secreción de VLDL, posiblemente por inhibición de los genes involucrados en su síntesis. Además, estas grasas estimulan el catabolismo de las VLDL, activando la oxidación de acil-CoA a nivel peroxisomal. Fibra dietética : La fibra dietética soluble reduce la concentraciÛn del colesterol en LDL del suero y atenúa los incrementos exagerados postprandiales de los quilomicrones. Su efecto se atribuye a su capacidad de absorber sales biliares, reducir el pool de estas sales, lo que hace que disminuya el colesterol hepático. La reducción de la disponibilidad de colesterol en el hígado, incrementa la expresión de receptores de LDL. Ello parece ser causado por un receptor que ejerce un efecto regulatorio entre el contenido de sales biliares y la actividad de la 7 alfa hidroxilasa, enzima clave de la síntesis de sales biliares a partir del colesterol y por la proteína ligante de sales biliares (I-BAPS), responsable del transporte de sales biliares a nivel hepato-biliar. Al reducirse el contenido de sales biliares, se activa la 7 alfa hidroxilasa.

MATERIAL

POR LA UNIVERSIDAD DEL ESTUDIANTE

o 3 tubos de hemólisis o 1 vaso precipitado 100ml o Micropipeta de 10 - 100 o Micropipeta de 100 - 1000 o Puntas para micropipeta de 10 - 100 o Puntas para micropipeta de 100 - 1000 o Material de toma de muestra o Material de bioseguridad o Recipiente material corto punzante o 1 gradilla EQUIPO o Baño maría o Vortex o Espectrofotómetro (505 nm) o Centrifugadora o Calculadora REACTIVOS o Agua destilada o Reactivo precipitante y estándar para determinación de HDL- COLESTEROL o Plasma

DETERMINACION DE HDL COLESTEROL

1. Un integrante por equipo, en ayunas de por lo menos 9 horas
2. Extraer por punción venosa 5 mL de sangre y depositarla en un tubo mediano limpio y seco.
3. Llevar a baño maría a 37°C por 5 a 8 minutos.
4. desprender el coagulo con 1 varilla de vidrio.
5. Centrifugar a 3000 r.p.m. durante 10 minutos.
6. Con la ayuda de una pipeta Pasteur, separar el suero a un tubo ependorf.
7. preparar los tubos de hemolisis de la siguiente manera:
8. Incubar durante 5 minutos y luego leer las absorbancias *preparar de manera individual
9. En un tubo de hemolisis colocar 200 ul de suero con 20 ul de reactivo precipitante ( partes del R1: Acido Fosfotungstico + 1 parte del R2 MgCL2) llevarlo al vortex esperar 10 minutos y centrifugar a 5000 rpm durante 15 minutos
10. Identificar los siguientes tubos Blanco Estándar Muestra Reactivo (^) 1000 l 1000 l 1000 l Agua destilada (^) 10 l Estándar de colesterol (^) 10 l Suero (^) 10 l Blanco Estándar Muestra Reactivo (^) 300 l 300 l 300 l Agua destilada (^) 15 l Estándar de HDL colesterol (^) 15 l Suero (^) 15 l

PROCEDIMIENTO

VALORES DE REFERENCIA

BIBLIOGRAFIA

1. Kaplan LA, Pesce AJ. (2002). Química Clínica. Teoría, análisis y correlación. 3ª Edición. Ed. Pesce Kaplan Publicaciones.
2. Peña-Díaz A, Arroyo BA, Gómez PA, Tapia IR, Gómez EC. Bioquímica. Undécima reimpresión de la 2a. ed. México: Editorial Limusa; 2004.
3. Laguna J, Piña E. Bioquímica de Laguna. 5a.ed. México: Editorial El Manual Moderno; 2002: p. 41-56.
4. Principios de Bioquímica. Cuarta edición PEARSON EDUCACIÓN, México, 2008 5.http://www.wikicardio.org.ar/wiki/Tratamiento_para_el_colesterol_y_triglic%C3%A9ridos_ elevados
5. Colesterol. (s/f). Fundación Española del Corazón. Recuperado el 24 de abril de 2024, de https://fundaciondelcorazon.com/prevencion/riesgo-cardiovascular/colesterol.html
6. Errico, T. L., Chen, X., Martin Campos, J. M., Julve, J., Escolà-Gil, J. C., & Blanco-Vaca, F. (2013). Mecanismos básicos: estructura, función y metabolismo de las lipoproteínas plasm. Clínica e investigación en arteriosclerosis: publicación oficial de la Sociedad Española de Arteriosclerosis , 25 (2), 98–103. https://doi.org/10.1016/j.arteri.2013.05.

COLESTEROL TOTAL

NORMAL < 200 mg/dl ALTO 200 – 240 mg/dl Se considera hipercolesterolemia a los niveles de colesterol total superiores a 200 mg/dl COLESTEROL LDL Pacientes con enfermedad cardiovascular: CLDL < 55 mg/dl Personas sin enfermedad cardiovascular ni factores de riesgo: CLDL <160 mg/dl En el resto de personas deben individualizarse los valores considerados como normal COLESTEROL HDL NORMAL Superior a 35 mg/dl en el hombre y 40 mg/dl en la mujer

EVALUACION DE TRABAJO EN LABORATORIO

NOMBRE:

¿Realizo práctica en laboratorio y el paciente cuenta con permiso correspondiente?

SI NO

En caso de SI cada uno de los siguientes puntos tiene el valor de 2 puntos siendo 2 puntos: logrado 1 punto: En proceso 0 puntos: NO logrado

NOTA

CRITERIO ACTIVIDAD NOTA

Realiza el procedimiento de toma de muestra Está en una buena posición para realizar la toma de muestra y Coloca de manera adecuada la ligadura Selecciona la vena más adecuada para la toma de muestra y realiza técnica de desinfección de la zona de toma de muestra. Obtiene 5 ml de muestra Retira ligadura antes de retirar la aguja Obtiene plasma Lleva^ al^ baño^ maría^ la^ muestra^ por^5 a^10 min Desprende el coagulo y lleva a la centrifugadora. Obtiene plasma sanguíneo Realiza determinación de Colesterol por método enzimático colorimétrico. Prepara serie de tubos (tubo de muestra) Mezcla e incuba a 37° C tubo de muestra por 10 minutos Lee absorbancia Realiza cálculo de resultado Interpreta resultados Trabaja en equipo Realiza las actividades propuestas en la práctica Cumple normas de bioseguridad Prepara los equipos, materiales, el espacio de trabajo. No desperdicia materiales y/o recursos Hay cooperación y una distribución equitativa de las tareas entre los integrantes TOTAL /34 puntos