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Universidad Nacional de San Luis
Facultad de Ingeniería y Ciencias
Agropecuarias
MICROBIOLOGÍA
Laboratorio N° 2 y 3: “Siembra, Recuento en Placa,
Tinción de Gram y Microscopía”
Fernandez Aldana
Hilgert Gimena Soledad
Ingeniería en Alimentos
Resumen: En el presente laboratorio se realizaron técnicas de aislamiento y siembra de dos muestras distintas de microorganismos en distintos medios de cultivos para luego realizar el recuento en placa. También se aplicó la técnica de tinción de Gram, para
diferenciar bacterias. Algunas de las muestras también fueron observadas a través del microscopio. Introducción: Para realizar el reconocimiento de microorganismo y obtener resultados lo más acertados posibles, estos se deben aislar, de esta manera se puede observar cómo se comporta una o más colonias sin la intervención de otros factores. También en ciertos casos es necesario aplicar técnicas de diferenciación y así poder identificar si se trata de un microorganismo u otro. Estos procedimientos se deben realizar en un ambiente esteril, ya que de esta manera se garantiza que los microorganismos del medio donde se ensayan no están interfiriendo en el análisis de la muestra que se desea estudiar. Objetivos: ● Adquirir los conocimientos y entrenamiento mínimos en la preparación de medios de cultivo. Conocer los cuidados que se debe tener durante la preparación y selección de los mismos. ● Conocer cómo se realiza la separación por métodos físicos de los microorganismos provenientes de una muestra de un ambiente natural, con el fin de obtener poblaciones (bacterianas) o individuos (hongos, levaduras) sobre un sustrato nutritivo adecuado. ● Aplicar de manera adecuada las técnicas de aislamiento y cultivo de los microorganismos. Esto implica saber qué medios y elementos utilizar, en qué condiciones y cuidados se debe proceder dependiendo la muestra y el tipo de microorganismo que se manipula. ● Realizar la técnica de tinción de manera correspondiente con la correcta preparación del frotis y su posterior tinción Gram, para luego poder diferenciar las formas o morfologías y tinciones características. Conocimientos previos:
Siembra: procedimiento mediante el cual se inserta una pequeña cantidad de
microorganismos en un medio de cultivo estéril.
Cultivo: un cultivo de microorganismos es un método para favorecer la multiplicación
de microorganismos, para luego estudiarlos.
Inóculo: microorganismos que se introducen en un medio de cultivo para que
comiencen a crecer.
Medio de cultivo: consta de un gel o solución (sólido, semisólido o líquido) que
contiene todas las condiciones necesarias, o que se deseen (acidez, temperatura,
cantidad de nutrientes, etc.), para que uno o más microorganismos vivan y crezcan,
para su posterior estudio. El gel que más se usa es el llamado agar, un medio
sólido. Existen dos tipos de medios de cultivo:
● Reactivos y soluciones: Solución de Yodo, Solución cristal violeta, Etanol, Safranina, Agar PCA, Agar YGC, Agua, solución fisiológica, aceite de inmersión. ● Equipos: Estufa, Microscopio Óptico. ● Muestras: Colonia en placa de petri, alimento contaminado (cacao en polvo), agua contaminada. Procedimiento experimental Primera parte Se encienden dos mecheros continuos para crear el cono de esterilidad. Todo procedimiento a mencionar posteriormente se realizó dentro de este último para garantizar la esterilización del medio y la no contaminación de los elementos utilizados. Por una parte se sembró un inóculo microbiano extraído de un cultivo en placa de petri con la ayuda de un ansa en un medio de cultivo sólido de Agar PCA, se realizó un estriado paralelo en la cuarta parte de la placa, luego se quemó el ansa para la esterilización, se enfrió en la tapa de la placa de petri. Posteriormente se volvió a estriar tocando 3-4 veces el área sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de placa. Se gira la placa 90° en cada estriado. Por otro lado se pesaron 10 g del alimento a analizar con la ayuda de una cuchara esteril y se vertió dentro de un frasco con 90 mL de solución fisiológica (mantiene constante la cantidad de agua dentro del microorganismo), para de esta manera obtener una dilución de 10 -1^. A continuación se realizaron diluciones hasta el 10-9^ tomando 1 mL de la dilución precedente y colocándola en un tubo de ensayo con 9 mL de agua destilada como diluyente esteril, para obtener diferentes concentraciones. Cada una de las diluciones fueron llevadas a un agitador por 5 min. Una vez obtenidas las diluciones, con una pipeta esteril se tomó 1 mL de cada una comenzando desde la 10-2^ y se la colocó en una placa de petri previamente esterilizada Luego se le colocó la cantidad necesaria de Agar PCA, el cual se mantuvo todo este tiempo a baño maría para evitar su solidificación. La cantidad que se colocó de este último fue la necesaria para cubrir bien la base de la placa de petri. Una vez realizado este paso se agitó la placa en distintos sentidos para mezclar todo, antes de que el agar se solidifique, garantizando así un mejor crecimiento de las colonias para poder realizar posterior conteo. Luego, de las mismas diluciones se realizaron siembras superficiales en placas con agar YGC, se colocó 1 mL de cada dilución en diferentes placas con el medio y con la ayuda de una espátula de Drigalsky se distribuyó el inóculo por toda la superficie hasta que el líquido fue absorbido por el medio. Esto se repitió de la misma manera con cada una de las diluciones, comenzando desde la 10-^. Al finalizar todas las placas fueron invertidas y llevadas a incubar en estufa por 48 hs a 30ºC. Segunda parte : Se observaron las placas para su recuento e identificación mediante dos procedimientos:
Las placas que fueron sembradas por estriado, se observaron a tras luz para poder identificar las colonias. Se vió que había dos tipos de colonia ya que se observaban dos colores diferentes. El crecimiento de dos colonias distintas en este caso pudo haber sido por contaminación, ya que se realizó el repique de una única colonia. Luego, una de las placas donde se realizó la siembra superficial que contiene medio de cultivo con antibiótico YGC, el cual favorece el crecimiento de hongos, se colocó bajo el microscopio óptico y se observaron tanto hifas como esporangios. Por otra parte, se realizó el conteo en placa de una siembra por inclusión que llevó a cabo el profesor de la asignatura ya que, la siembra realizada en la primera parte del procedimiento no mostró un resultado posible de contabilizar ya que las colonias que se observaban eran casi nulas, esto pudo ser debido a errores cometidos durante dicho procedimiento, como por ejemplo, en el presente caso el medio de cultivo que se utilizó no contenía los nutrientes necesarios para el crecimiento de los microorganismos. En el apartado de resultados se mencionan las UFC obtenidas en los conteos de las placas PCA realizadas por el profesor por duplicado y en las placas YGC de las alumnas. Por otra parte se observó bajo el microscopio una muestra de agua contaminada donde se vieron distintas morfologías de microorganismos vivos.
mL solución fisiológica g de alimento mL de agua destilada Siembra por inclusión 90 mL 10 g 10 mL por cada tubo de ensayo Tabla 1- Datos de sustancias utilizadas para siembra por inclusión. Resultados Experimentales Dilución UFC UFC 10 -5^ 80x10^5 114X10^5 10 -6^ 26X10^6 28x10^6 10 -7^ 5x10^7 1x10^7 10 -8^ 1x10^8 - 10 -9^ 2x10^9 2x10^9 Tabla 2- Siembra por inclusión en Agar PCA realizada por el Profesor Adrián Giurno por duplicado. Dilución UFC 10 -5^ 3x10^6 10 -6^ 12x10^7 10 -7^ 5x10^8 10 -8^ 7x10^9 10 -9^ 3x10^10 Tabla 3- Siembra en superficie. Agar YGC Conclusión Se cumplieron los objetivos del laboratorio, a través de las distintas técnicas y con ayuda del microscopio se pudieron observar morfologías de bacterias como Estafilococos, Cocos y Bacilos. Además mediante la tinción de Gram se visualizaron algunos bacilos Gram- negativas y cocos Gram-positivas. También la estructura microscópica de hongos y se adquirió un mejor manejo del microscopio, de las técnicas y elementos propios de un laboratorio de microbiología. Bibliografía Guías de trabajos prácticos de laboratorio- Microbiología General.
