Ligación del producto de PCR en el pET SUMO.
Para eficiencias óptimas de ligadura, es recomendable usar productos de PCR
frescos (de menos de 1 día).
Cantidad de producto de PCR a utilizar
Una relación molar de 1:1 de vector: inserto produce la mejor eficiencia de
ligadura.
0.5 a 1.0 μl de una muestra de PCR típica con longitud de inserción promedio de
400-700 pb dará la mejor proporción molar adecuada de 1:1 de vector inserto.
Si requiere mayor precisión en la exactitud de las concentraciones de ADN se
puede realizar una segunda reacción de ligadura usando una proporción molar de
1:3 de vector: inserto.
*No se recomienda utilizar más de 2-3 μl de la muestra de PCR en la reacción de
ligadura, ya que las sales de la muestra de PCR pueden inhibir la T4 ADN
Ligasa. *
Materiales necesarios:
➢Producto PCR (La descripción para su obtención en la página anterior)
➢Tampón de ligadura 10X (10X Ligation Buffer, incluido en el kit). ➢
Vector pET SUMO (incluido en el kit).
➢Agua esterilizada (incluido en el kit).
➢ADN ligasa T4 (T4 DNA Ligase, incluida en el kit).
Procedimiento para la reacción de ligadura
1. Determinar el volumen de muestra de PCR necesario para alcanzar la
cantidad requerida del producto PCR.
Usar agua esterilizada para diluir la muestra de PCR si es necesario. 2.
Configurar la reacción de ligadura de 10 μl como se indica a continuación:
Producto de PCR fresco ………………………………… X μl
Tampón de ligadura 10X ………………………………...1 μl
Vector pET SUMO (25 ng/μl) …………………………… 2 μl
Agua estéril hasta un volumen total de ………………. 9 μl
ADN ligasa T4 (4.0 unidades Weiss) …………………. 1 μl
Se tiene un volumen final de 10 μl
3. Incubar la reacción de ligadura a 15 °C durante un mínimo de 4 horas
(preferiblemente durante la noche). También se puede incubar la reacción
de ligadura a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Se puede almacenar la reacción de ligadura a -20 °C hasta que esté listo para
