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Un experimento de laboratorio que se centra en la cuantificación de azúcares reductores liberados por la hidrólisis del almidón utilizando el método de dns (3,5-dinitrosalicílico). El documento proporciona una introducción al tema, antecedentes sobre la hidrólisis del almidón y el método dns, el objetivo del experimento, la metodología detallada, los resultados obtenidos y la interpretación de los datos. Útil para estudiantes de bioquímica o áreas relacionadas que buscan comprender los principios de la cuantificación de azúcares reductores y la aplicación del método dns en la investigación bioquímica.
Tipo: Ejercicios
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La determinación de la actividad enzimática es un proceso clave en la investigación bioquímica, ya que permite evaluar la capacidad de una enzima para catalizar una reacción específica y cuantificar el producto resultante. En el caso de las enzimas que actúan sobre carbohidratos, como la amilasa o la celulasa, una de las formas más comunes de medir su actividad es monitoreando la producción de azúcares reductores, que son los productos de la hidrólisis de polisacáridos complejos como el almidón o la celulosa. El método del ácido dinitrosalicílico (DNS) desarrollado por Miller en 1959 se basa en la capacidad de los azúcares reductores, como la glucosa y la maltosa, para reaccionar con el ácido 3,5-dinitrosalicílico. Durante esta reacción, los grupos aldehído de los azúcares reductores reducen el ácido dinitrosalicílico a 3-amino-5-nitrosalicílico, lo que genera un compuesto de color rojo anaranjado que puede ser medido a una longitud de onda de 540 nm utilizando un espectrofotómetro. La intensidad del color es directamente proporcional a la cantidad de azúcar reductor presente en la muestra, lo que permite cuantificar indirectamente la actividad de la enzima que los ha liberado (Miller, 1959). A través de este ensayo, es posible obtener una medida cuantitativa de la velocidad de reacción enzimática, lo que es fundamental para caracterizar la actividad de una enzima en diferentes condiciones de pH, temperatura o concentración de sustrato. Sin embargo, también tiene limitaciones, como la interferencia de otras sustancias que puedan reducir el DNS o la sensibilidad del método en bajas concentraciones de azúcares reductores (Bailey, 1988).
Según Díaz (2020), durante la hidrólisis del almidón, se liberan principalmente azúcares reductores como la maltosa, un disacárido compuesto por dos unidades de glucosa unidas por un enlace glucosídico α(1→4), que es uno de los primeros productos generados en este proceso. A medida que la hidrólisis avanza, se libera glucosa, un monosacárido que se forma cuando las enzimas, como la amilasa, continúan rompiendo los enlaces entre las unidades de glucosa que forman el almidón, generando moléculas individuales de glucosa Un azúcar reductor es un tipo de azúcar que posee la capacidad de actuar como un agente reductor, es decir, puede donar electrones y, por lo tanto, reducir otras moléculas en reacciones químicas. Este tipo de azúcares tiene un grupo funcional aldehído o cetona libre que puede oxidarse durante una reacción química. Entre los azúcares reductores más comunes se encuentran la glucosa, la fructosa, la maltosa y la lactosa (Nelson & Cox, 2017). El método de Miller (1959) es una técnica utilizada para determinar la cantidad de azúcares reductores en una muestra utilizando el reactivo de ácido 3,5-dinitrosalicílico (DNS). En este método, los azúcares reductores, que contienen grupos funcionales aldehído o cetona, reducen el reactivo DNS a ácido 3-amino-5-nitrosalicílico en un ambiente alcalino. Este proceso de reducción genera un cambio de color en la solución, que varía de amarillo a rojo anaranjado, dependiendo de la cantidad de azúcar presente. Bello et al. (2006) explican que el método DNS es efectivo con azúcares reductores porque reacciona con el grupo carbonilo (C=O) presente en las formas de aldehído o cetona de estos azúcares, permitiendo su oxidación y la reducción de los iones de cobre del DNS, lo que genera un cambio de color. A partir de la curva de calibración de absorbancia y concentración de azúcar reductor, se puede medir la cantidad total de azúcares en la muestra. No obstante, este método no puede diferenciar entre diferentes azúcares en una solución, lo que lo convierte en una técnica no selectiva Ilustración 3 Conversión de los azúcares reductores mediante DNS
3. OBJETIVO GENERAL: Determinar la actividad enzimática de una muestra mediante la cuantificación de azúcares reductores utilizando el método de DNS de Miller, por medio de la medición espectrofotométrica de la absorbancia a 540 nm. 4. METODOLOGIA MATERIALES: 23 tubos de ensayo. Gradilla. Micropipeta de 1000 μl. Matraz Erlenmeyer 500 ml. EQUIPO: Baño maría a 50°C. Espectrofotómetro calibrado a 540 nm. REACTIVOS Y SOLUCIONES: Reactivo DNS (3,5-dinitrosalicílico) preparado según Miller (1959). Almidón (diluido a concentración 8 g/l). (Sustrato) α-amilasa. Agua destilada. PROCEDIMIENTO:
Tabla 1. Concentraciones de glucosa para curva de calibración Solución Madre (μL) Agua Destilada (μL) Concentración Final (g/L) 0 2000 0 200 1800 2 400 1600 4 600 1400 6 800 1200 8 1000 1000 10 1200 800 12 1400 600 14 1600 400 16 1800 200 18 2000 0 20
A partir de la curva de calibración y de la réplica de experimentos más consistente, se calcula la concentración de azúcares reductores en las muestras a diferentes tiempos, usando la ecuación de la línea para sustituir el valor de absorbancia en la ecuación, posteriormente se realiza un despeje: Concentración : X =
Esta concentración, medida en mg/ml, indica la cantidad de azúcares reductores presentes en la muestra, lo que permitirá calcular la velocidad de la reacción con base a: a) Dt =^ Δ^ T^ = T^^1 − T^^0 ( intervalo^ de^ tiempo^ entre^ las^ mediciones^ ) b) Dp =^ Δ^ P = P^^1 − P^^0 (^ diferencia^ entre^ la^ concentración^ ) c) Vr =^
( tasa de cambio de la concentración con respecto al tiempo ) Tabla 3. Resultados obtenidos con los cálculos de concentración a partir de la curva de calibración Tiempo (min) Absorbancia Concentración (g/l) Dt Dp Vr (^0) 0.66 1.337^ - - - (^2) 1.12 2.220^2 0.88326 0. 4 1.16 2.297^2 0.0768 0. (^6) 1.25 2.470 2 0.17281 0. (^8) 1.36 2.681 2 0.21121 0. (^10) 1.44 2.834 2 0.15361 0. (^12) 1.47 2.892 2 0.0576 0. (^14) 1.51 2.969^2 0.0768 0. (^16) 1.51 2.969^2 0 0. (^18) 1.5 2.950 2 -0.0192 -0. A partir de estos datos, se realizaron dos graficas: a) La primera, que relaciona la absorbancia en función del tiempo, en donde se observa el comportamiento y por tanto se considera que un incremento en la
Se realizó el mismo experimento a concentraciones de almidón en 2g/l, 4g/l, 6g/l, 10g/l y 12g/l para realizar una estimación de la velocidad de reacción. Resultados obtenidos a 2g/l de almidón: 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 0
f(x) = 0.023559 x + 0. R² = 0. Absorbancia en función del tiempo Series Linear (Series2) Tiempo (min Absorbancia Ilustración 10 Tabla 4. Resultados obtenidos utilizando 2 g/l de almidón como sustrato Tiempo (min) Absorbanci a Concentraci ón (g/l) Dt Dp Vr 0 0.00316^ 0.076^ -^ -^ - 2 0.27152 0.591 2.000 0.515 0. 4 0.34093 0.724 2.000 0.133 0. 6 0.35243 0.746 2.000 0.022 0. 8 0.38987 0.818 2.000 0.072 0. 10 0.45967^ 0.952^ 2.000^ 0.134^ 0. 12 0.4701^ 0.972^ 2.000^ 0.020^ 0. 14 0.47871^ 0.989^ 2.000^ 0.017^ 0. 16 0.49005 1.010 2.000 0.022 0. 18 0.58884 1.200 2.000 0.190 0. 20 0.62987 1.279 2.000 0.079 0.
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1
Relación concentración-absorbancia Absorbancia Concentración (g/l) Ilustración 11 Resultados obtenidos a 4 g/l de almidón: Tabla 4. Resultados obtenidos utilizando 4 g/l de almidón como sustrato Tiempo (min) Absorbanci a Concentraci ón (g/L) Dt Dp Vr 0 0.22 0.492 - - - 2 0.4 0.838 2.000 0.346 0. 4 0.14 0.338 2.000 -0.499 -0. 6 0.24 0.530 2.000 0.192 0. 8 0.2^ 0.454^ 2.000^ -0.077^ -0. 10 1 1.990^ 2.000^ 1.536^ 0. 12 1.35^ 2.662^ 2.000^ 0.672^ 0. 14 - - - - - 16 - - - - - 18 - - - - - 20 - - - - -
Resultados obtenidos a 6 g/l de almidón: Tabla 4. Resultados obtenidos utilizando 6 g/l de almidón como sustrato Tiempo (min) Absorbanci a Concentraci ón (g/l) Dt Dp Vr 0 0.27289 0.593 - - - 2 0.79268 1.592 2.000 0.998 0. 4 0.98783 1.966 2.000 0.375 0. 6 1.3348^ 2.632^ 2.000^ 0.666^ 0. 8 1.1239^ 2.228^ 2.000^ -0.405^ -0. 10 0.96005 1.913 2.000 -0.315 -0. 12 1.008 2.005 2.000 0.092 0. 14 - - - - - 16 - - - - - 18 -^ -^ -^ -^ - 20 -^ -^ -^ -^ - 0 2 4 6 8 10 12 14 0
f(x) = 0.0477882142857143 x + 0. R² = 0. Absorbancia en función del tiempo Series Linear (Series2) Tiempo (min Absorbancia Ilustración 14
0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.1 1.2 1.3 1.
Relación concentración-absorbancia Absorbancia Concentración (g/l) Ilustración 15 Resultados obtenidos a 10 g/l de almidón: Tabla 5. Resultados obtenidos utilizando 10 g/l de almidón como sustrato Tiemp o (min) Absorbanci a Concentraci ón (g/l) Dt Dp Vr 0 0 0. 2 0.136 0.331 2.000 0.261 0. 4 0.322 0.688 2.000 0.357 0. 6 0.552 1.129 2.000 0.442 0. 8 0.561^ 1.147^ 2.000^ 0.017^ 0. 10 0.626^ 1.272^ 2.000^ 0.125^ 0. 12 0.738^ 1.487^ 2.000^ 0.215^ 0. 14 0.841 1.684 2.000 0.198 0. 16 0.923 1.842 2.000 0.157 0. 18 1.1 2.182 2.000 0.340 0.
Resultados obtenidos a 12 g/l de almidón: Tabla 6. Resultados obtenidos utilizando 12 g/l de almidón como sustrato Tiemp o (min) Absorbanci a Concentraci ón (g/l) Dt Dp Vr 0 0 0.070 - - - 2 0.011 0.091 2.000 0.021 0. 4 0.202 0.457 2.000 0.367 0. 6 0.364^ 0.768^ 2.000^ 0.311^ 0. 8 0.465^ 0.962^ 2.000^ 0.194^ 0. 10 0.587 1.197 2.000 0.234 0. 12 0.681 1.377 2.000 0.180 0. 14 0.764 1.536 2.000 0.159 0. 16 0.903 1.803 2.000 0.267 0. 18 1 1.990^ 2.000^ 0.186^ 0. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 0
f(x) = 0.0579606060606061 x −0. R² = 0. Absorbancia en función del tiempo Series Linear (Series2) Tiempo (min Absorbancia
0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1 1.
Relación concentración-absorbancia Absorbancia Concentración (g/l) Cálculo de V^ max y K^ m
f(x) = 1.34783701838912 x + 2. R² = 0. Gráfica de Lineweaver-Burk 1/S Linear (1/S) 1/S 1/Vr max (1/min)
La ecuación de Eddie-Hofstee se expresa de la siguiente manera: En donde: Utilizando la recta obtenida de la regresión lineal de la gráfica, la pendiente obtenida del ajuste lineal es 2.5158, por lo tanto K^ m =2.5158^ y la intersección con el eje y da directamente V (^) max , entonces V (^) max =0.1869 min − 1
En conclusión, a concentraciones muy altas de almidón, como las observadas en las concentraciones a partir de 6 g/L o superiores en resultados, puede haber saturación de la enzima, de forma que la enzima ya no puede trabajar más rápido porque todos los sitios activos están ocupados. Es recomendable experimentar con concentraciones de almidón más cercanas a los 4-6 g/L (donde se observa la mayor eficiencia) para tener datos suficientes que permitan la optimización del proceso.
