¡Descarga Microscopía Óptica y Electrónica: Evolución, Características y Diferencias y más Resúmenes en PDF de Biometría solo en Docsity!
Evolución histórica y
características de los
microscopios ópticos y
electrónicos
Diferencia entre Microscopía Óptica y
Electrónica
Microscopio Óptico
Tipos
De campo claro De campo oscuro De contraste de fases De fluorescencia
Partes
Parte Mecánica: Columna o brazo Base o pie Tubo Tornillo macrométrico Tornillo micrométrico Revólver Parte Óptica: Objetivos Condensador Diafragma Fuente luminosa
Onda electromagnética
La longitud de onda de la luz utilizada es de 0.4-0.7 μm (4000-7000 Å).
Tipo de lente
Consta de lentes convergentes que concentran los rayos de luz hacia la muestra.
Aumento
El aumento total se calcula multiplicando la magnificación del objetivo por la del ocular. Puede alcanzar hasta 1500x.
Límite de resolución
Está limitado por los anillos de difracción y la longitud de onda de la luz. Aproximadamente 200 nm (2000 Å) en las mejores condiciones.
Microscopio Electrónico
Tipos
De barrido (SEM) De transmisión (TEM)
Partes
Lentes magnéticos Portaobjetos Generador de barrido Detectores de electrones Sistema de vacío Amplificador Cañón de electrones Ánodo acelerador de electrones Placa fotográfica o pantalla fluorescente Sistema de registro
Onda electromagnética
La longitud de onda de los electrones es aproximadamente 0.5 Å.
Tipo de lente
Utiliza lentes magnéticas que crean campos eléctricos y magnéticos para dirigir y enfocar el haz de electrones.
Aumento
Puede proporcionar un rango de ampliación de aproximadamente 1000x a 25000x.
Límite de resolución
En teoría, el límite de resolución es 0.002 nm (0.02 Å), pero en la práctica es aproximadamente 1 nm (10 Å), 200 veces mejor que el microscopio óptico.
campo es aproximadamente de 50nm, lo que permite el enfoque de todos los niveles en las estructuras celulares simultáneamente.
Tipos de muestras
Muestras biológicas
Vivas
Organismos completos muy pequeños como bacterias, protozoos, pequeños animales y plantas, o partes discretas de organismos como células en cultivo, células sanguíneas, granos de polen, etc.
Muertas
Partes de organismos vivientes que requieren de un tratamiento especial, tanto para mantenerlos vivos durante la observación, como para asegurar que su muerte no destruya información de interés. Dependiendo de la duración de la observación y de la naturaleza de la muestra, se debe prestar atención a la provisión de suficiente oxígeno, al mantenimiento de la concentración de otras sustancias, a la eliminación de CO2 y otros residuos, al control de la temperatura, a la provisión de luz apropiada, y a la eliminación de organismos extraños o depredadores.
Muestras no biológicas
Granos de minerales, arcillas o cerámicas porosas.
Tratamiento de muestras
Microscopio óptico
Las muestras vivas requieren de un tratamiento especial para mantenerlas vivas durante la observación y evitar que su muerte destruya información de interés. Las muestras muertas requieren de ciertos procesos antes de su vista al microscopio, como fijación, inclusión, corte y tinción.
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Durante el proceso de preparación de las muestras existen varios pasos críticos que es necesario controlar, como la temperatura de lavado y fijación, la presión osmótica de los tampones y fijadores, y el secado de la muestra. Existen tres formas de preparar una muestra para SEM: en polvo, adelgazador iónico y ultramicrótomo.
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Para este tipo de microscopía se utilizan compuestos fluorescentes (proteínas con marca fluorescente) que pueden usarse tanto en organismos vivos como inertes. Una estrategia no invasiva que se utiliza mucho emplea una proteína fluorescente (GFP) de la anémona Aequorea victoria, y se han generado variantes de GFP que emiten fluorescencia en tonos de azul, amarillo y cian.
Preparación de muestras para microscopía
Cortes ultrafinos
Finalmente se obtienen cortes de 400 a 500 Å perpendicularmente al aplastamiento de las partículas planares, mediante un ultramicrótomo dotado de cuchilla de diamante27.
Tinciones supravitales
Los colorantes se aplican cuando el organismo ya está muerto a causa de la fijación. Hay tinciones que son bastante rutinarias y frecuentes como la hematoxilina-eosina en animales, el fast green-safranina en vegetales o el Gram para las bacterias. Pero hay muchas también que solo se aplican en determinados casos como la tinción de Herovisi (técnica utilizada para valorar estructuras tisulares), tinción de la reticulina o tinción del tricrómico de Masson (cuantificación de la densidad media vascular).
Montaje de muestras
Gota pendiente
Se untan los bordes del cubreobjetos con vaselina para conseguir adherencia y que no se seque la muestra, si se va a observar por más de una hora.
Extensión o frotis
Se extiende la gota sobre el portaobjetos con ayuda de otro, de manera rápida para evitar la coagulación. El líquido extendido se fija, colorea y monta de manera normal. Generalmente se utiliza en el estudio de sangre y bacterias.
Aplastamiento
Técnica más común. Los cortes se depositan en el portaobjetos. Si no se quiere conservar la preparación no se añade medio de montaje, pero la preparación no durará más de una hora (el líquido se evaporará por acción del foco luminoso). Si se quiere conservar, se añade un buen medio, que
También estacionado en la base del microscopio se encuentra una serie de filtros que condicionan la luz emitida por la lámpara incandescente antes de que se refleje en un espejo y pase a través del diafragma de campo y en el condensador de platina inferior. El condensador forma un cono de iluminación que baña la muestra, que se encuentra en la platina del microscopio, y posteriormente entra en el objetivo. La luz que va dejando el objetivo es desviada por un haz divisor y por una combinación de prismas ya sea por los oculares para formar una imagen virtual, o directamente a través de la lente de proyección montada en el tubo de extensión tri-ocular, donde entonces se puede formar una imagen sobre la matriz de fotodiodos CCD posicionada dentro del sistema de imagen digital. Los componentes ópticos y mecánicos del microscopio, incluyendo el espécimen montado en un portaobjetos de vidrio y de micro cubreobjetos, forman un tren óptico con un eje central que atraviesa la base del microscopio29.
Formación de la imagen en microscopía
electrónica
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
El haz de electrones se enfoca formando una línea muy fina que barre el espécimen, al igual que el haz de electrones en un cinescopio de TV traza la figura. Cuando el haz barre el espécimen, los electrones salen despedidos y son reunidos por un ánodo recolector positivo con respecto a la muestra, mantenido a un potencial de algunos cientos de volts. La corriente en el ánodo recolector se amplifica y usa para modular el haz de electrones en un tubo de rayos catódicos, que es barrido en sincronización con el haz en el microscopio. Así, el tubo de rayos catódicos traza una imagen muy aumentada del espécimen29.
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Los electrones son emitidos por un cátodo caliente, y acelerados por una diferencia normal de potencial de 10 a 100 kV. Pasan por una lente condensadora y se conforman en un rayo paralelo, antes de pasar por el espécimen u objeto a examinar. El lente objetivo forma entonces una imagen intermedia de este objeto, y la lente de proyección produce una imagen real final del objeto. Las lentes objetivo y de proyección desempeñan los papeles de las lentes objetivo y ocular, respectivamente, de un microscopio óptico compuesto. La imagen final se registra en una película fotográfica, o se proyecta sobre una pantalla fluorescente, para verla o fotografiarla29.
Tipos de imagen en microscopía óptica
Microscopio de luz o de campo claro
La luz ilumina a la muestra de abajo hacia arriba, sin modificaciones en el paso de los rayos luminosos.
Campo oscuro con luz transmitida
Permite resaltar las estructuras, pudiéndose observar partículas extremadamente delgadas. En un campo visual de campo oscuro los elementos o partículas en suspensión se ven brillantes y refringentes mientras que el resto del campo es oscuro, haciendo un contraste perfecto31.
Imágenes de contraste
Los pequeños cambios en la longitud del camino óptico (conforme la luz se mueve a través de materiales diferentes de diferentes índices de refracción) son trasladados ópticamente dentro de los cambios correspondientes en la intensidad de la luz, los cuales pueden ser observados como diferencias en los contrastes de la imagen32.
Microscopía de fluorescencia
Utiliza la capacidad de los fluorocromos para emitir luz después de ser excitado con luz de una determinada longitud de onda. Permite determinar la distribución de una sola molécula, su cantidad y su localización dentro de una célula33.
Tipos de microscopios
Microscopio electrónico de barrido (SEM)
Crea una imagen ampliada de la superficie de un objeto. No es necesario cortar el objeto en capas para poder observar con un SEM, sino que puede colocarse en el microscopio con muy pocos preparativos. El SEM explora la superficie de la imagen punto por punto, al contrario que el TEM, que examina una gran parte de la muestra cada vez34.
Microscopio electrónico de transmisión (TEM)
Permite la observación de muestra en cortes ultrafinos. Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada del espécimen. Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles de angstroms34.
Introducción
La microscopía es una herramienta fundamental en el campo de la investigación médica, permitiendo el estudio detallado de estructuras celulares y biomoléculas a escalas microscópicas. A lo largo del tiempo, la evolución de los sistemas de microscopía ha posibilitado avances significativos en el conocimiento de la biología celular y el diagnóstico de
vuelto cada vez más accesible, brindando nuevas oportunidades para explorar y comprender los mecanismos fundamentales de la vida.
Referencias Bibliográficas
Mundo Microscopio. (2020). Historia del Microscopio. Recuperado de https://www.mundomicroscopio.com/historia-del-microscopio/ Apsney. (2008). Microscopio. Recuperado de https://www.apsnet.org/ edcenter/disimpactmngmnt/labexercises/Microscopio/Pages/ default.aspx Escudero, N. L., Sánchez, S. I., Cangiano, A., Daguerre, A., Dávila, S., Isaguirre, A., & Videla, A. (2018). Guía de trabajos prácticos: Biología General y Celular. Recuperado de http://www.fqbf.unsl.edu.ar/ documentos/mde/Biologia/B_GyC/2018/BGyC2018.pdf#page= Franrzmn. (2016). Microscopios Electrónicos. Recuperado de https:// www.franrzmn.com/microscopios-electronicos/ #Partes_de_un_microscopio_electronico_de_transmision The Biology Project. (1998). Cells. Recuperado de http:// www.biologia.arizona.edu/cell/tutor/cells/cells2.html Hipertextos del área de la Biología. (1998). Microscopía Electrónica de Barrido. Recuperado de http://www.biologia.edu.ar/microscopia/ meb.htm Lifeder. (2019). Microscopio de Campo Claro. Recuperado de https:// www.lifeder.com/microscopio-campoclaro/ #:~:text=Consta%20de%20un%20lente%20convergente,se%20puede%20subir% Varilux. (2020). Lentes Convergentes. Recuperado de https:// positive.varilux.es/saludvisual/lentes-convergentes/ #:~:text=Las%20lentes%20convergentes%20se%20llaman,y%20algunos%20tipos Guzmán Altamirano, M. A. (2015). Remoción de la aberración cromática lateral en Imágenes de microscopía óptica de campo claro. Recuperado de https://ipicyt.repositorioinstitucional.mx/jspui/bitstream/1010/815/3/ TDIPICYTG8R42015.pdf Montalvo Arenas, C. E. (2010). Microscopía. Recuperado de http:// bct.facmed.unam.mx/wp-content/uploads/2018/08/2_microscopia.pdf Microscopio Electrónico. (2018). Partes del Microscopio Electrónico. Recuperado de https://www.microscopioelectronico.top/partes-del- microscopio-electronico/ Megías, M. (2020). Microscopio Óptico. Recuperado de https:// mmegias.webs.uvigo.es/6-tecnicas/6- optico.php#:~:text=El%20aumento%20total%20que%20permite,la%20que%20pro Jefferson, G. (2019). Microscopio Óptico de Campo Claro y Microscopio Óptico de Transmisión. Recuperado de https://www.studocu.com/es/ document/universidad-nacional-de-asuncion/biologia-molecular/ resumenes/microscopio-optico-de-campo-claro-y-microscopio-optico-de- transmision/6139644/view UNED. (2020). Microscopía Electrónica de Barrido. Recuperado de https://www2.uned.es/cristamine/mineral/metodos/sem.htm Karp, G. (2019). Biología Celular y Molecular (8va ed.). Ciudad de México: McGraw Hill Interamericana Editores. Smith, Y. (2018). Limitations of Optical Microscopy. Recuperado de https://www.news-medical.net/life-sciences/Limitations-of-Optical- Microscopy.aspx
Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Morgan, D., Raff, M., Roberts, K., & Walter, P. (2016). Biología Molecular de la Célula (6ta ed.). Barcelona: Ediciones Omega. Mabon, J., Swiech, W., Zhou, H., Chen, C., & Wang, J. (2017). The Scanning Electron Microscope. Recuperado de https://mrl.illinois.edu/ sites/default/files/pdfs/AMC2017_SEM-FIB_6-01-2017_S.pdf Ipohorski, M., & Bozzano, P. (2013). Microscopía Electrónica de Barrido en la Caracterización de Materiales. Recuperado de http:// aargentinapciencias.org/wp-content/uploads/2018/01/RevistasCeI/ tomo63-3/5-MICROSCOPIA-ELECTRONICA-DE-BARRIDO-EN-LA- CARACTERIZACION-DE-MATERIALES-cei63-3-2013-5.pdf Universidad Autónoma de Madrid, Centro Nacional de Biotecnología. (2020). Microscopio Óptico. Recuperado de https://www.uam.es/otros/ cnb/servicios/microscopiaelectronica/microscopio_optico.htm Edmund Optics. (2020). Depth of Field and Depth of Focus. Recuperado de https://www.edmundoptics.com/knowledge-center/application-notes/ imaging/depth-of-field-and-depth-of-focus/ Dover Motion. (2020). Microscope Calculations: Field of View, Depth of Field, Numerical Aperture. Recuperado de https://dovermotion.com/ applications-capabilities/automated-imaging/microscope-calculations/ Naik, A. (s.f.). Fundamentos del microscopio electrónico y su aplicación en la investigación textil. Recuperado de https://upcommons.upc.edu/ bitstream/handle/2099/6074/Article03.pdf Sorrivas, V., Morales, A., & Yañez, M. J. (2014). Principios y práctica de la Microscopía Electrónica. Bahía Blanca. Universidad de Alicante. (2011). Preparación de muestras para microscopía óptica. Recuperado de https://ssyf.ua.es/en/formacion/ documentos/cursos-programados/2011/especifica/microscopia-optica/ tema-4.pdf Arraiza, N., Viguria, P., Navarro, J., & Ainciburu, A. (s.f.). Manual de Microscopía: Historia, descripción y uso del microscopio óptico. Recuperado de https://d1wqtxts1xzle7.cloudfront.net/60338379/ manual_de_microscopia_unlocked20190819-316936fmrzl.pdf? 1566270174=&response-content- disposition=inline%3B+filename%3DMATERIAL_PARA_LABORATORIO_Historia_d CBmIJWdzIARtaAq6RFYNEfo~I9jU69QzTttub- eeUEeqY1~BZYWn3jIOCIVcq- PnNfOb1CUylOLww8eMIx6sQ1diRFD4glCtHQxRTVSJLVHflxI7NgI2O4D94JfCC9UI agNbF3t8604- YrRxIBw16Lg~qSt~qw2SlsenS5Hf6duD7IEp7veD95~Vv0F1xTHiD~NRk8s1EKcoV Pair-Id=APKAJLOHF5GGSLRBV4ZA Renau-Piqueras, J., & Faura, M. (1994). Principios básicos del microscopio electrónico de barrido. Recuperado de https://ruc.udc.es/ dspace/bitstream/handle/2183/9313/CC011_art_5.pdf Galindo, A. L., Segura, E. F., Navas, A. S., Guerrero, M. M., & Ortega Huertas, M. (1989). PUESTA A PUNTO DEL MICROANÁLISIS EDX CON EL MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN ZEISS EM 10C. Recuperado de http://sge.usal.es/archivos/REV/2(1-2)/Art15.pdf Microscopía Óptica y Electrónica. (2020). Recuperado de http:// ksantacruz.fisica.uson.mx/biofotonica_y_optica_medica/ Tema%204%20tipo%20de%20Microscopias%20.pdf
