Lavado
1.Recolección, pretratamiento, transporte de pulpa de café (Castillo Tambo) y Acondicionamiento de la pulpa de café (Secado, reducción de tamaño de partícula y tamizado).
Secado
(Horno de
Bandeja)
Molienda
Molino eléctrico Tamización Almacenamiento
(Bolsas ziploc
herméticas)
Pulpa de café seleccionada
de la finca El Cajón
12kg
Agua con impurezas
Pulpa limpia
Agua
Pulpa seca Pulpa triturada
t: 48 horas
T: 60°C v: 2000 rpm
t: 5 minutos. T: -10°C
granulometría de
0.05mm
Agua
Mezclado
(Beaker de
50mL)
Calentamiento y
Agitación
(Plancha magnetica
de calentamiento)
Ajuste pH
(5.8) Agitación Cinética
enzimática Inactivación
de enzima
Pulpa de café en
polvo 5g Mezcla con
enzima
v: 50 rpm.
T: 100°C
T: 50°C
t: 8 horas
2. Hidrólisis enzimática a la muestra de pulpa de café y medición de pH y °Brix
Agua Destilada
10mL
V: 50 rpm
T: 50°C
Ácido acético (1M)
(CH3COOH) o Hidróxido de
sodio 1M (NaOH)
Celulasa
10uL
Enfriamiento
(Temp.
ambiente)
Filtración
(Al vacio) Almacenamiento
Frascos ambar
Solución líquida
hidrolizada
muestra solida de cafe
3. Cuantificación de azúcares reductores mediante el método DNS) y Análisis cinético
Ensayo uno: Preparación del reactivo DNS (ácido 3,5 dinitrosalicílico).
Mezclado
Agua Destilada
5mL
Preparación en un balón volumétrico de
250 mL (cubierto con papel aluminio)
1,980 g de
hidróxido de
sodio
Mezclado
Agua
Destilada
5mL
1,059 g de
Ácido-3,5-
dinitrosalicílico
Solución Mezclado
Agua
Destilada
5mL
30,60 g de
tartrato de
sodio y potasio
Solución Mezclado
Agua
Destilada
5mL
30,60 g de
tartrato de
sodio y potasio
Solución Mezclado
Agua
Destilada
5mL
0,830 g de
metabisulfito
de sodio
Solución Mezclado
Agua
Destilada
5mL
0,830 g de
Fenol.
Solución Aforar
(Hasta 250mL)
Solución Completa
Agua
Destilada
Sellado y
Agitación Almacenar
(Frasco ambar)
Agitación y
refrigeración
de reactivo
DNS
T: 4°C
t: 24 horas
Ensayo dos: Procedimiento para la cuantificación de azucares reductores de la muestra.
T: 80-85°C
t: 10 min
Preparación
de las
muestras
Preparación
de la muestra
blanco
9 Tubos de ensayo tipo rosca
cubiertos con papel aluminio
Solución de café
hidrolizada 1mL
A
A
B
Agua Destilada
1mL
1 Tubo de ensayo
tipo rosca
Tubos con la
muestra
Tubo con
agua
Mezclado
(Cada tubo)
1.5mL reactivo de
DNS
Agitación
(Vortex)
v: 100 rpm
t: 30s
Calentamiento
(Baño María)
Tubos de
ensayo con el
reactivo
B
Enfriamiento
(Baño de hielo)
t: 10 min
Hielo
Reposar
(Temp.
ambiente)
t: 2 min
Mezclado
(Cada tubo)
20 mL de Agua
destilada
Análisis
espectrofotométrico
(UV-Visible a 540nm)
Todos los tubos
Medición pH
(Potenciómetro
de Hidrógeno)
Determinación
de grados Brix
Muestra hidrolizada
cuantificada
4. Activación de LACTOBACILLUS CASEI
Ensayo uno: Preparación del medio líquido MRS.
Mezclado
(Erlenmeyer
250 mL)
Esterilización
(Autoclave)
Enfriamiento
(Temp.
ambiente)
5,2 g del medio
MRS en polvo
Solución de
MRS
100 mL de agua destilada
Solución
esterilizada
T: 121 °C
P:15 psi
t: 12 minutos.
Ajuste pH
(6-6.5)
Ácido clorhídrico (1N)
(HCL) o Hidróxido de
sodio 1M (NaOH)
Ensayo dos: Inoculación del cultivo.
Esterilización
(Asa
bacteriológica)
Muestreo de
Lactobacillus
casei
Mezclado
(Tubo falcon de
15 mL)
9 mL de solución
salina estéril
C
C
Porción raspada
del microorganismo Agitación
Tubo con
mezcla Reposar
10 min
Suspensión
bacteriana
homogeneizada Mezclado
(Erlenmeyer de
100 mL)
10 mL de la
suspensión
bacteriana
40 mL de medio líquido
MRS estéril
Homogenizar
la solución Erlenmeyer con solución
homogenizada
D
Ensayo tres: Incubación del cultivo
Erlenmeyer con solución
homogenizada Incubación
T: 37 °C
t: 48 horas.
Solución de MRS
esterilizada
Mezclado
(Erlenmeyer de
100 mL)
10 mL del cultivo
incubado
C
40 mL de medio líquido
MRS estéril
Agitación suspensión bacteriana
homogeneizada Incubación
T: 37 °C
t: 8 días
Agitación
Cada 12 horas
t: 1 min
Repetir cada 48
horas
5. Adaptación de LACTOBACILLUS CASEI
Ensayo uno: Adecuación del hidrolizado como medio de cultivo.
Esterilización
(Autoclave)
Solución líquida
hidrolizada
T: 121 °C
P:15 psi
t: 12 minutos.
Ensayo dos: Preparación del medio líquido MRS.
Solución hidrolizada
esterilizada
D
E
Mezclado
(Erlenmeyer
100 mL)
Esterilización
(Autoclave)
Enfriamiento
(Temp.
ambiente)
13 g del medio
MRS en polvo
Solución de
MRS
125 mL de agua destilada
Solución
esterilizada
T: 121 °C
P:15 psi
t: 12 minutos.
Ajuste pH
(6-6.5)
Ácido clorhídrico (1N)
(HCL) o Hidróxido de
sodio 1M (NaOH)
FSolución de MRS
esterilizada
Ensayo tres: Preparación del medio de transición (50:50).
Mezclado
(Erlenmeyer de
100 mL)
50 mL Solución
hidrolizada
esterilizada
F
50 mL de medio líquido
MRS
ESolución con
MRS Ajuste pH
(6-6.5)
Ácido clorhídrico (1N)
(HCL) o Hidróxido de
sodio 1M (NaOH)
Erlenmeyer
con solución Agitación
(Magnética)
v: 50 rpm
t: 5 min
Mezclado
(Beaker de 100
mL)
90 mL del medio de
transición preparado
(50:50)
Cultivo activado en
MRS
G
10 mL del cultivo activado en
MRS G
Agitación
(vortex)Incubación
v: 50 rpm
t: 10 min
Beaker cubierto
en aluminio
T: 37 °C
t: 48 horas.
Ensayo cuatro: Preparación del medio de transición (25:75).
Mezclado
(Erlenmeyer de
100 mL)
25 mL Solución
hidrolizada
esterilizada
F
75 mL de medio líquido
MRS
ESolución con
MRS Ajuste pH
(6-6.5)
Ácido clorhídrico (1N)
(HCL) o Hidróxido de
sodio 1M (NaOH)
Erlenmeyer
con solución Agitación
(Magnética)
v: 50 rpm
t: 5 min
Mezclado
(Beaker de 100
mL)
90 mL del medio de
transición preparado
(25:75)
10 mL del cultivo en
transición (50:50)
H
Agitación
(vortex)Incubación
v: 50 rpm
t: 10 min
Beaker cubierto
en aluminio
T: 37 °C
t: 48 horas.
Cultivo de
transición (50:50)
H
Cultivo de transición
(25:75)
I
Ensayo cinco: Preparación del medio hidrolizado (100% medio hidrolizado).
Mezclado
(Erlenmeyer de
100 mL)
100 mL Solución
hidrolizada
esterilizada
ESolución de pulpa
hidrolizada Ajuste pH
(6-6.5)
Ácido clorhídrico (1N)
(HCL) o Hidróxido de
sodio 1M (NaOH)
Mezclado
(Beaker de 100
mL)
40 mL del
sobrenadante
hidrolizado
10 mL del cultivo en transición
(25:75) I
Agitación
(vortex)Incubación
v: 50 rpm
t: 10 min
Beaker cubierto
en aluminio
T: 37 °C
t: 48 horas.
Medio hidrolizado
(100% ).
J
A
Erlenmeyer
cubierto
con papel
aluminio
Erlenmeyer
cubierto con
papel aluminio
6. Fermentación del sobrenadante hidrolizado con LACTOBACILLUS CASEI (por
triplicado) y medición de pH y °Brix.
Esterilización
(Autoclave)
300 mL Solución
líquida
hidrolizada
T: 121 °C
P:15 psi
t: 12 minutos.
Solución
hidrolizada
esterilizada
A
Ajuste pH
(6-6.5)
Ácido clorhídrico (1N)
(HCL) o Hidróxido de
sodio 1M (NaOH)
Mezclado
(Erlenmeyer de
250mL)
Mezclado
(Erlenmeyer de
250mL)
Mezclado
(Erlenmeyer de
250mL)
85mL de Solución
15 mL del microorganismo
23 mL del microorganismo
30 mL del microorganismo
77 mL de Solución
70 mL de Solución
Agitación
(vortex)
v: 20 rpm
t: 5 min
Agitación
(vortex)
v: 20 rpm
t: 5 min
Agitación
(vortex)
v: 20 rpm
t: 5 min
Incubación
T: 37 °C
Agitación
(cada 12 horas)
muestro a las 4h,
8h, 24, 28h, 32,
44 h y 48 h
Refrigeración
T: 4 °C
Incubación
T: 37 °C
Agitación
(cada 12 horas)
muestro a las 4h,
8h, 24, 28h, 32,
44 h y 48 h
Refrigeración
T: 4 °C
Incubación
T: 37 °C
Agitación
(cada 12 horas)
muestro a las 4h,
8h, 24, 28h, 32,
44 h y 48 h
Refrigeración
T: 4 °C
Solución fermentada
con 10% de inoculo
Solución fermentada
con 15% de inoculo
Solución fermentada
con 20% de inoculo
Medición pH
(Potenciómetro
de Hidrógeno)
Determinación
°Brix
Medición pH
(Potenciómetro
de Hidrógeno)
Determinación
°Brix
Medición pH
(Potenciómetro
de Hidrógeno)
Determinación
°Brix
7. Cuantificación de metabolit os de la Fermentación.
J
J
J
Filtración
(Filtro de fibra de
vidrio 0,45 µm)
Mezclado (vial de
2 mL)
Agitación y
Calentamiento
(Baño María)
Enfriamiento Análisis
cromatográfico
de gases
5 mL de solución
fermentada con 10% de
inóculo
Solidos suspendidos
200 µL
Solución
fermentada
filtrada
Solución en viales
de inyección
1 µL
t: 30 min
T: 70°C Viales de
inyección
Ensayo uno: Cuantificación de ácido láctico.
K
L
M
100 µL de BSTFA
50 µL de TMCS. Cond icion es de espect rofot ómetro :
Columna DB-WAX (30 m x 0,32 mm x
0,25 µm), como gas portador, se emplea
el helio a un flujo de 1,5 mL/min, la
inyección de la muestra se realizó en
modo split 10:1 con una temperatura del
inyector de 250°C, el programa de
temperatura debe iniciar a 50°C,
manteniéndose por 1 minuto, seguido de
un incremento de 5°C por minuto hasta
alcanzar 240°C, donde se mantuvo
durante 5 minutos y por último la
detección se lleva a cabo mediante un
detector de ionización por llama (FID) a
280°C.
Repetir procedimientos con solución de 15 % y 20% de inóculo
Muestra
cuantificada
Ensayo dos: Cuantificación de ácido acético.
Filtración
(Filtro de fibra de
vidrio 0,45 µm)
Mezclado (vial de
2 mL)
Agitación y
Calentamiento
(Baño)
Enfriamiento Análisis
cromatográfico
de gases
5 mL de solución
fermentada con 10% de
inóculo
Solidos suspendidos
200 µL
Solución
fermentada
filtrada
Solución en viales
de inyección
1 µL
t: 25 min
T: 60°C Viales de
inyección
100 µL de BSTFA
50 µL de TMCS.
Muestra
cuantificada
Cond iciones de espec trofo tómetr o:
Inyectar 1 µL en el cromatógrafo. Utilice las
siguientes condiciones: una columna
DB-WAX (30 m x 0,32 mm x 0,25 µm),
utilizando helio como gas portador a un flujo
de 1,5 mL/min, la inyección se realizó en
modo split 15:1 con una temperatura del
inyector de 250°C, el programa de
temperatura comenzó en 40°C,
manteniéndose por 1 minuto, seguido de un
incremento de 7°C por minuto hasta
alcanzar 230°C, donde se mantuvo durante
5 minutos y por último, la detección se llevó
a cabo mediante un detector de ionización
por llama (FID) a 280°C.
Ensayo tres: Cuantificación de etanol.
Filtración
(Filtro de fibra de
vidrio 0,45 µm)
Análisis
cromatográfico
de gases
5 mL de solución
fermentada con 10% de
inóculo
Solidos suspendidos
Solución en viales
de inyección
1 µL Muestra
cuantificada
Cond icion es de espect rofot ómetro :
una columna DB-WAX (30 m x 0,32 mm x
0,25 µm), con helio como gas portador a
un flujo de 1,5 mL/min, la inyección se
debe realizar en modo split 10:1 con una
temperatura del inyector de 250°C, el
programa de temperatura inició en 50°C,
manteniéndose por 1 minuto, seguido de
un incremento de 10°C por minuto hasta
alcanzar 240°C, donde se mantuvo
durante 5 minutos y por último, la
detección se llevó a cabo mediante un
detector de ionización por llama (FID) a
280°C.
Ensayo cuatro: Cuantificación de CO2.
Filtración
(Papel filtro y
embudo T/R.)
10mL de solución
fermentada con 10% de
inóculo
Solidos suspendidos
Mezclado
(Beaker de 50
mL)
10 mL de
la muestra
3 gotas de Fenolftaleína
Titulación
(bureta 25mL)
25 mL de solución de
hidróxido de sodio
(NaOH 1M)
K
K
K
KMuestra lista
para
cuantificación
Metodologías