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PRACTICA # 1
EL MICROSCOPIO
HISTORIA DE LA MICROSCOPIA
Antiguamente el hombre solo contaba con sus 5 sentidos para observar y conocer el medio ambiente que lo rodeaba. Con el avance del conocimiento se encontraron maneras de extender el alcance de estos sentidos. Prueba de ello es que en las ruinas de Nínive – antigua capital del imperio Babilónico- se encuentran cristales de roca tallados en forma de lentes convergente, los cuales eran utilizados para agrandar las imágenes de los objetos. Los griegos y los romanos emplearon esferas de cristal llenas de agua. Estos hechos sientan los primeros antecedentes históricos conocidos de la utilización de las lentes; sin embargo, no existe constancia de alguna observación. A principios del siglo XVI aparece la lupa en Europa. La invención del telescopio y del microscopio se atribuye a Zacarías Jansen (1590). Sin embargo, en la historia de la microscopia se la atribuye una mención especial al holandés Anton Van Leewenhoek (1632-1723) pionero en dejar constancia de sus observaciones, consignando notas y bosquejos detallados de los primeros microorganismos que sabemos fueron observados: los protozoos, encontrados en aguas negras y en el sarro de los dientes. Leewenhoek diseño diferentes tipos de microscopios, todos ellos de una gran calidad óptica. Se estima que monto alrededor de 247 lentes. Aunque la estructura era rudimentaria, la calidad de los lentes utilizados y su capacidad de observador dieron como resultado una serie de descripciones que causaron sensación entre los naturalistas de su época. Entre los trabajos que inmortalizaron su nombre cabe mencionar las primeras descripciones de los protozoarios, los glóbulos rojos y algunas bacterias. El inglés Robert Hooke, construyo en 1665 un microscopio vertical. Con estos aparatos se obtienen imágenes deficientes, debido a la utilización de lámparas de aceite como fuente de luz. En la subsecuente evolución del microscopio participaron eminentes científicos, quienes lo modificaron de diversas maneras- con el objeto de mejorar la imagen obtenida se diseñaron portaobjetos intercambiables, tornillos de ajuste y se hicieron cambios importantes en el sistema de iluminación, así como el portacondensador y espejos, haciendo el manejo de microscopio más versátil, y la observación científica más accesible. A principios del siglo XX el microscopio comenzó a adquirir las características que tienen en la actualidad. Los adelantos técnicos permitieron la aparición de los grandes microscopios compuestos, siendo uno de los adelantos el mejoramiento de los sistemas de iluminación y la incorporación de varios objetos, cada uno con un aumento diferente, fácilmente intercambiables al estar montados en un revolver. Igual mención merece la introducción de un tubo fijo inclinado y de varios tornillos de mando situado sobre una platina móvil.
TIPOS DE MICROSCOPIOS
MICROSCOPIO DE POLARIZACIÓN
Es en el que se interpone un prisma de Nicol (o una hoja de polaroid) en el cambio de la luz bajo el lente condensador, este polarizador convierte toda la luz que pasa a través del microscopio en luz polarizada plana. Un segundo prima semejante llamado analizador, se coloca dentro del tubo del microscopio por arriba del objetivo. Cuando el analizador se hace girar hasta que su eje este perpendicular al polarizador, la luz no puede pasar por el ocular, lo que produce un efecto de campo oscuro, el campo permanecerá negro si se coloca en la platina un objeto de refracción simple (isotópico). En cambio, un objeto birrefringente hace girar el eje de la luz que emerge del polarizador y aparecerá como una estructura luminosa sobre un fondo oscuro. La birrefringencia (anisotropía), es exhibida por muchas estructuras biológicas, por ejemplo, fibras musculares, algunas fibras del tejido conectivo, gotitas de lípido dentro de la corteza suprarrenal y los conos y bastones de la retina.
MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASE
Esta echo para transformar las diferencias invisibles de fase de otras de amplitud visible. Las ondas invisibles que inciden en la pieza de estudio, se recambian con las que salen de ella, de lo que resulta que estos dos grupos de ondas se interfieran mutuamente en grado diferente. Ello permite diferenciar las imágenes obtenidas con el microscopio común, que requieren que el objeto de estudio – in vitro - tenga una preparación y tinción especial, dado que con el microscopio de contraste de fase se obtienen imágenes de tejidos in vivo.
MICROSCOPIO DE INTERFERENCIA
Va provisto de un dispositivo de desdoblamiento de haces luminosos, como por ejemplo un espejo semirreflector. Uno de los haces luminosos atraviesa el objeto y el otro recorre el trayecto semejante, pero evitando el objeto. Cuando se juntan ambos haces en condiciones adecuadas, se origina interferencia y se obtienen en la misma imagen variaciones de intensidad o color. Se utiliza para observar estructuras transparentes o traslucidas.
MICROSCOPIO DE CAMPO OBSCURO
Este utiliza una luz fuerte y oblicua que no pasa por el objetivo. Un condensador especial de campo obscuro o permite que la luz pase por el centro de la lente. La luz alcanza así el objeto a observar en un ángulo tan oblicuo que nada de ella puede entrar al objetivo, por lo tanto, el campo es obscuro. Sin embargo, las partículas pequeñas que hay en el objeto reflejarán algo de la luz hacia el objetivo y aparecerán como puntos brillantes. Por ello es posible visualizar partículas por debajo de los límites de resolución de la luz que podemos detectar.
E) TORNILLOS DE AJUSTE. – Sirven para movilizar el carro y así observar diferentes partes del tejido fijado sobre el portaobjetos.
F) TORNILLOS MACROMETRICO Y MICROMETRICO. – Permiten realizar el enfoque correcto de las preparaciones con suma precisión, permitiendo el desplazamiento de la platina en sentido vertical, aproximando o alejando la preparación de los objetivos. Es imperativo manejarlos con extrema delicadeza , ya que de n hacerlo se dañarán irreversiblemente los objetivos y el sistema óptico completo, o romperá el portaobjetos. Siga la técnica que el instructor le mostrara.
G) REVOLVER. – Es una pieza metálica en forma de disco que gira alrededor de un eje, en el que se fijan los objetivos de distintos aumentos. Al girar el revolver se sitúan debajo del tubo. Es necesario posiciona el revolver hasta que perciba un click para obtener la imagen correcta.
SISTEMA ÓPTICO
A) TUBO. – En él se encuentran sujetos arriba de los oculares y abajo los objetivos en el revolver; dentro del tubo se encuentran los espejos y prismas que guiaran la imagen a los oculares.
B) OBJETIVOS. – Se diferencian según su poder de amplificación en 4X, 10X, 40X Y 100X , al primero se le denomina comúnmente lupa , el 10X se conoce como seco débil, y al 40X como seco fuerte. Al de 100X se le denomina de inmersión o húmedo, debido a que para observar a través de él se requiere aplicar aceite de inmersión. Dicho aceite corrige en gran manera la refracción de la luz , redirigiendo el haz luminoso hacia el objetivo.
C) OCULARES. – Captan la imagen amplificada por los objetivos y generan una imagen aumentada, virtual y unidimensional preparada para la observación final con nuestra vista. La graduación de los oculares puede ser de 10X, 15X Y 20X.
D) CONDENSADOR. – Se encuentra por debajo de la platina y está formado de lentes convergentes que hacen que la luz – generada dispersamente por la fuente de luz- se consensa en un solo rayo, que dirige hacia los objetivos.
E) DIAFRAGMA DEL CONDENSADOR. – Regula la cantidad de luz que pasara a través del condensador. Tiene una función similar a la del iris de nuestro ojo o al obturador de una cámara fotográfica.
PRACTICA # 2
T E C N I C A S H I S T O L O G I C A S
INTRODUCCIÓN
Como concepto amplio de las técnicas histológicas comprende la preparación de tejidos para su estudio microscópico , lo que nos permite conocer la morfología macro y microscópica del órgano a estudiar. Tales tejidos se pueden obtener de dos fuentes: la primera de ellas directamente de pacientes sometidos a intervención quirúrgica, seleccionando una muestra de tejido de un órgano específico o una mínima porción de este; a esta última muestra de tejido vivo la llamaremos biopsia. La segunda fuente de obtención de tejidos es post-mortem ; puede ser llamada necropsia, debido a que es extraída de algún órgano durante una neurocirugía.
OBJETIVO
Explicar las diferentes técnicas de preparación de tejidos utilizaos en histología; particular y explícitamente la técnica de la parafina , desde la obtención del tejido hasta su observación al microscopio. Es trascendental dejar claro que el orden de los pasos, porcentajes, sustancias y sus volúmenes citados aquí pueden presentar variaciones en la metodología de acuerdo a la experiencia de cada investigador, no significando estas variaciones contradicción en la exposición de la técnica.
PASOS DE LA TÉCNICA DE LA PARAFINA
Citaremos los pasos, seguidos adelante por una descripción amplia de cada uno.
Obtención del tejido
Fijación del tejido
Sección del tejido
Proceso automatizado de fijación, deshidratación, aclaramiento e impregnación.
Inclusión en parafina.
Microcorte del tejido.
Montaje en laminilla portaobjetos.
Desparafinación
Tinción
Montaje del cubreobjetos.
Los cuatro recipientes que siguen contienen sucesivamente alcohol al 70%, 80%, 90% y 96% con el fin de deshidratar los tejidos gradualmente. Dos recipientes más contienen alcohol absoluto (al 100%) para concluir este proceso.
Aclaramiento: Tanto el agua como el alcohol son insolubles en parafina, pero hay productos químicos solubles en ambos y se conocen como agentes aclarantes. Los aclarantes más usados son: Xilol , Tolueno, Cloroformo, Benceno y aceite de cedro. La canasta pasa por dos recipientes de Xilol para su aclaramiento, fenómeno que tiende a hacer trasparentes a los tejidos.
Impregnación en parafina: los dos últimos recipientes son de metal y mantienen la parafina a una temperatura suficiente para conservarla liquida. Los espacios inter e intracelulares – que naturalmente contienen agua, temporalmente sustituida por alcohol, después por el aclarante Xilol - serán ocupados por parafina con el fin de conservar la estructura celular lo más cercanamente posible a su aspecto natural. En este momento concluye el proceso automático del Autotecnicon.
5). INCLUSIÓN EN BLOQUES DE PARAFINA
Los tejidos recientemente procesados se colocan en el fondo de pequeños moldes cúbicos en los cuales se vierte parafina liquida a una temperatura específica, de no ser así el tejido en estudio sufriría alteraciones estructurales por quemadura, alterando su aspecto a la observación. Se deja enfriar hasta que solidifique convenientemente y se extraen los bloques de los recipientes cúbicos.
6). MICRO-CORTE DE TEJIDOS
Los tejidos son incluidos en parafina porque este compuesto presenta – entre otras características- una consistencia especifica la cual permite hacer al bloque cortes tan finos como 3 a 10 micrómetros o micras (μ ) Para efectuar los cortes se existe un instrumento conocido como micrótomo, con cuchillas finamente afiladas. Se coloca el bloque de parafina en la pinza del micrótomo, se hace girar la manivela, haciendo que el bloque se deslice hacia arriba y abajo contra el filo de la cuchilla, originando en cada ciclo cortes consecutivos en forma de cinta.
7). MONTAJE EN LAMINILLA PORTAOBJETOS:
La cinta de cortes se hace flotar en agua a temperatura de 50 grados centígrados con el fin de eliminar las arrugas de los cortes, una vez que se eliminan las arrugas los cortes se colocan en laminillas portaobjetos. La superficie de un portaobjetos se hace ligeramente adhesiva frotándola con solución diluida de albumina de huevo u otro adherente.
8). DESPARAFINACION
Los cortes montados en las laminillas contienen gran cantidad de parafina, cuyo exceso debe ser eliminado. Esto se logra sometiendo las laminillas a temperatura alta de hasta 70 a 80 grados centígrados con el fin de derretir la parafina y exponer
exclusivamente el tejido. El portaobjetos con el tejido embebido en parafina se sumerge en un agente aclarante para disolver y extraer la parafina. Después se introduce en alcohol absoluto para disolver el aclarante en el que acaba de ser sumergido, enseguida se introduce e soluciones de alcohol gradualmente menores y finalmente en un recipiente con agua. Si en este momento se observa el corte con microscopio ordinario mostraría muy pocos detalles para interpretación, por lo que tendremos que utilizar colorantes para mostrar sus características morfológicas específicas.
9). TINCION
La mayor parte de los colorantes utilizados para teñir cortes de tejido se fabrican como soluciones acuosas o hidrófilas, por lo que la parafina – sustancia hidrófoba embebida en las células del tejido montado en el portaobjetos debió ser eliminada para lograr que los colorantes de la tinción pudiesen ser fijados por el tejido. La tinción que mayormente utilizaremos en el laboratorio de histología se conocen bajo el nombre de hematoxilina y eosina. Las estructuras de los tejidos que se tiñen con colorantes básicos se conocen como BASOFILAS , son afines a la hematoxilina – colorante básico- que tiñe en tono azul o purpura. Las estructuras de los tejidos que fijan colorantes ácidos se conocen como ACIDOFILAS, son afines a la eosina – colorante acido- que tiñe rosa o rojo, es necesario que comprenda y asimile estos conceptos.
10). MONTAJE DEL CUBREOBJETOS:
Los cortes teñidos son colocados en una laminilla cubreobjetos – para su protección y conservación- con un adhesivo transparente y resistente que puede ser resina sintética o bálsamo de Canadá, sustancias seleccionadas por contar entre sus características el tener un índice de refracción de la luz similar al que el vidrio del porta y cubreobjetos la refracta.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
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2.- BURBUJAS
Se generan al colocar el cubreobjetos sobre el tejido-paso 10 de la técnica de la parafina- quedando espacios de aire entre este y el portaobjetos. Al microscopio se observan generalmente como espacios ocupados por aire, circulares, transparentes, de bordes generalmente regulares en forma de una línea negra.
3.- RETRACCION
Son porciones de tejido separadas entre sí artificialmente, generando espacios y cambios en la estructura tisular que in vivo no existen. Las diferentes sustancias químicas a las que los tejidos son sometidos, o la excesiva temperatura de la parafina fundida – durante los pasos 4 y 5 de la técnica- son las causantes más comunes. Se observan como interrupciones o espacios sinuosos en el tejido, de bordes irregulares.
4.- MUESCAS EN LA CUCHILLA
Son interrupciones de la continuidad del tejido causados por defecto en el filo de la cuchilla del micrótomo. Estos ocurren durante el paso 6 de la técnica cuando la cuchilla está mal afilada o hay una muesca o melladura en el filo de ella, marcando una huella recta de bordes regulares que van de un lado a otro del corte.
5.- CUERPO EXTRAÑO
Son partículas ajenas al tejido atrapadas bajo el cubreobjetos durante el proceso de preparación del tejido. Se observan al microscopio como puntos negros de bordes variables, generalmente fuera del plano del tejido en observación, ya sea por encima o por debajo de el – esto último lo puede detectar al modificar finamente el enfoque de la imagen con el tornillo micrométrico, mostrando la diferencia en la nitidez de la imagen del tejido y del cuerpo extraño.
P R A C T I C A # 4
C E L U L A
INTRODUCCIÓN
Originalmente la palabra cellula se acuño como el diminutivo de la palabra latina cella, que designa una habitación o compartimiento. La palabra célula – pequeño compartimiento- fue introducida en biología en el siglo XVII cuando el naturalista ingles Robert Hooke, observando un corte de corcho proveniente de la corteza del árbol alcornoque noto que contenía innumerables compartimientos vacíos, separados unos de otros, a los que llamo células o celdillas. En un intento de definir célula podemos decir que es la unidad organizada más pequeña de material vivo capaz de existir independientemente e un medio inerte adecuado, sustituyendo su propia substancia a medida que resulte necesario, gracias a la síntesis de componentes nuevos partiendo de elementos nutritivos obtenidos del medio ambiente. Dividida morfológicamente en dos partes, tenemos que se compone de
CITOPLASMA: Delimitando con la membrana celular en su interior el aparato de Golgi, lisosomas, mitocondrias y retículos endoplásmicos liso y rugoso.
NÚCLEO Contenido dentro del citoplasma y diferenciándolo de este la membrana nuclear, conteniendo en su interior al nucléolo y gránulos de cromatina, suspendidos todos estos en el jugo nuclear.
OBJETIVO
Conocer la morfología de las estructuras y organelos que forman la célula y haga dibujos al identificarlos
Membrana celular Núcleo Retículo endoplásmico Membrana nuclear Aparato de Golgi Nucléolo Lisosomas Gránulos de cromatina Mitocondrias
MATERIAL
Laminillas de hígado o páncreas, microscopio y aceite de inmersión. Debido a su mínimo tamaño las estructuras de la lista solo podrán ser apreciadas a través de un gran aumento, por lo que se hace necesario utilizar el objetivo 100x, que requiere de aceite de inmersión. Siga las instrucciones del profesor para la aplicación y el manejo de esta técnica. No olvide limpiar el aceite del objetivo y la laminilla al final de su práctica.
RESULTADOS Y CONCLUSIONES
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OBJETIVO GENERAL
El alumno observara cortes de tejido epitelial que se estudien al microscopio.
OBJETIVO ESPECIFICO
El alumno identificara y esquematizara los diferentes epitelios:
Laminilla de PIEL a) Epitelio plano estratificado no queratinizado
Lamina de INTESTINO DELGADO a) Epitelio cilíndrico simple secretor
Laminilla de TIROIDES a) Epitelio cubico simple que forman los folículos de la glándula tiroides
Laminilla de CORNEA
Laminilla de ARTERIA ELASTICA a) Epitelio plano simple (cel. Endotelial)
MATERIAL
Laminillas con los diferentes tipos de epitelio y microscopio
EVALUACIÓN
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OBSERVACIONES
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