¡Descarga Immunohistoquímica e Immunofluorescencia: Detección de antígenos en tejidos y más Guías, Proyectos, Investigaciones en PDF de Inmunología solo en Docsity!
Práctica número 2: Inmunofenotipicación Lugo Hernández Enrique Adrian, Sánchez Rodríguez Carla Lorena, Pacheco Blancas Jesús Antonio. Asignatura: Inmunología Licenciatura QFBT Periodo 2017- Fecha de Entrega: 22 de Agosto de 2017 Docente: Dr. Gerardo Bernabé Ramírez Rodríguez
RESUMEN
La inmunohistoquímica (IHQ) es una valiosa técnica utilizada para localizar / visualizar la expresión de la proteína en una sección de tejido montada usando anticuerpos específicos. Hay dos métodos: el método directo e indirecto. En este experimento, sólo describiremos el uso de tinción indirecta de IHQ. La tinción indirecta de IHQ utiliza anticuerpos primarios y anticuerpos secundarios altamente específicos conjugados con biotina. Los anticuerpos primarios se utilizan para identificar discretamente las proteínas de interés uniéndose a un epítopo específico, mientras que los anticuerpos secundarios restan para la tinción de fondo no específica y amplifican la señal formando complejos con el anticuerpo primario. Las diapositivas pueden generarse a partir de secciones congeladas o secciones conservadas en parafina montadas en portaobjetos de vidrio. Para esta práctica realizó la evaluación de reconocimiento de antígeno-anticuerpo mediante técnicas de inmunohistoqumica e inmunofluorescencia a partir de lectina biotinilada que se ocupó como anticuerpo primario y como anticuerpos secundarios streptavidina fluoresceinada (prueba de inmunofluorescencia) y sistema ABC de Vector (prueba de inmunohistoqímica), esto nos permitiría observar los capilares del corte histológico de cerebro de ratón de 10 micras con fluorescencia o un sobre tono en la prueba de inmunohistoquímica, manejando siempre los tejidos con buffer TBS al 1x, realizando los lavados previos con este para que el anticongelante (etilenglicol) que contenían los tejidos fuera eliminado, los tiempos de incubación fueron muy cortos por lo que la muestra que se observó que fue la de IHQ solo en algunas pequeñas zonas se observó un pequeño contraste de algunos capilares de vasos sanguíneos del corte de cerebro de ratón, obteniendo resultados pero no los esperados por la modificación de los tiempos de incubación.
Palabras clave: Anticuerpo, Streptavidina Fluoresceinada, Lectina biotinilada , Sistema ABC de Vector****.
INTRODUCCIÓN
Principios de la IHQ:
El principio de IHQ ha existido desde los años 1930, pero no fue hasta 1941 que el primer estudio de IHQ fue divulgado. [1] Coons y sus colegas usaron anticuerpos marcados con isotiocianato de fluoresceína (FITC) con un colorante fluorescente para localizar antígenos neumocócicos en infectados Tejidos Con la expansión y el desarrollo de la técnica IHQ, se han introducido etiquetas enzimáticas, como la peroxidasa [ 2, 3] y la fosfatasa alcalina. [4] Oro coloidal [5] También se ha descubierto y usado para identificar reacciones inmunohistoquímicas tanto a la luz como a los niveles de microscopía electrónica. Otros marcadores incluyen elementos radiactivos, y la inmunorreacción se puede visualizar mediante autorradiografía. El objetivo de IHQ es realizar la mayoría de la tinción de IHQ causando el menor daño en la célula o el tejido, y usando menos cantidad de anticuerpo, encuentra una manera en el tumor que mecanografía y los marcadores tumorales.
Lectina biotinilada:
Las lectinas son proteínas que tienen dominios o secuencias de aminoácidos que son capaces de reconocer y unirse a glúcidos terminales que forman parte de cadenas de oligosacáridos, bien libres o formando parte de otras moléculas como las glicoproteínas. Por ello se dice que las lectinas reconocen glicoconjugados. Las lectinas están ampliamente distribuidas en los tejidos animales y vegetales y sus funciones son muy variadas. Por ejemplo, la salida de los linfocitos desde el torrente sanguíneo hacia los tejidos dañados se produce gracias a la acción de una familia de lectinas denominadas selectinas que expresan las células endoteliales
próximas al lugar de la lesión. Es decir, el linfocito puede salir por la pared endotelial gracias a la unión de las selectinas endoteliales a los glúcidos de la membrana del linfocito.[6]
Fig 1. Pasos para la detección de glúcidos con lectinas. Los tiempos pueden variar según el material o la lectina usada. En este ejemplo se usa un método de detección indirecta puesto que la lectina lleva unida una proteína intermediaria que es la biotina, la cual será reconocida por la avidina del complejo ABC ("avidin-biotin-complex") que contiene la enzima peroxidasa. Es el resultado de la reacción de este enzima tras añadir el substrato peróxido de hidrógeno y la molécula diaminobencidina, lo que produce un precipitado insoluble y visible con el microscopio óptico. El paso de BSA (albúmina de suero bovino) sirve para saturar posibles sitios de unión inespecíficos de la lectina. Si en vez de cortes en parafina hubiésemos usado cortes de vibratomo podríamos procesar, tras la reacción de la peroxidasa, dichos cortes para observar el producto de reacción con el microscopio óptico y también con el electrónico de transmisión.
Streptavidina Fluoresceinada (LSAB):
reacción enzimática se podrá observar la unión de estos por medio de microscopio de fluorescencia para el caso de la IMF y microscopia de contraste de fases en el caso de la IHQ.
MÉTODO
- Tomar tejido cerebral de la placa multipozos para trabajar los siguientes grupos: A) Control negativo para IHQ, 😎 Muestra problema para lHQ, c) Control negativo para IMFs y D) Muestra problema para lHQ.
- Colocar el tejido cerebral en la placa multipozos que contenga las rejillas previamente llenadas con la solución de TBS 1x.
- Realizar dos lavados más con la solución de TBS 1x.
- Preparar la lectina a una dilución 1:200 en TBSs? colocar 400 microlitros.
- por pozo. (TA) Dejar incubar con la lectina durante 1 hora a temperatura ambiente.
- Lavar el tejido tres veces con la solución de TBS 1x.
- Adicionar la estreptavidina uoresceinadas o el sistema ABC de vector y dejar incubar durante una hora. NoTA: estas soluciones deben prepararse al menos 30 minutos antes de ser utilizadas.
- Lavar el tejido tres veces con la solución de TBS 1x.
- Al tejido al que se le adiciono el sistema ABC se le deberá adicionar el sistema DAB de vector y dejar incubarlo durante 5 minutos, seguido de tres lavados con TBS x para montar el tejido sobre un portaobjetos y cubrirlo con el medio de montaje para IHQ
estreptavidina fluoresceinada se le realizaran
- Al tejido que se le adiciono los tres lavados con TBS 1x para montar el tejido sobre un portaobjetos y cubrirlo con el medio montaje para IMFs.
- observar las preparaciones con el microscopio de fluorescencia y/o con microscopio de campo claro resultado de la IHQ e IMFs.
RESULTADOS
En proceso de observación.
Se hablará sobre la prueba de IHQ en el apartado de discusión de resultados.
DISCUSIÓN DE RESULTADOS La inmunohistoquimica es una técnica que se utilizan los anticuerpos con el fin de identificar a ciertos antígenos, en este caso funcionan como una especie de marcadores en una muestra de tejido. Por lo general, los anticuerpos están unidos a un florocromo. Este cuando se activa, los anticuerpos se unen al antígeno en la muestra de tejido y de esta manera, el antígeno se puede observar al microscopio.
Nosotros utilizamos cortes de tejido del cerebro de un ratón pero no obtuvimos los resultados esperados ya que cuando se observó la muestra de IHQ en el microscopio de contraste de fases y no se observó claramente la tinción de los vasos sanguíneos más que en algunas zonas, una de las posible causa en la cual pudo intervenir en el resultado fue el tiempo de incubación del complejo ABC con el tejido, ya que la interacción entre de la avidina con la biotina no fue la esperada a causa del recorte en los tiempos de incubación, arrojándonos un contraste muy bajo de los vasos sanguíneos y en un área pequeña del
tejido, otra causa pudo ser el Buffer TBS que se preparó ya que el potenciómetro no es muy fiable ya que las soluciones con las que se calibran pueden estar contaminadas o también que los reactivos que utilizamos no están en óptimas condiciones para el desarrollo de esta técnica.
Lo que provoco que la lectina no se uniera correctamente a los glúcidos por lo que el anticuerpo secundario no pudo generar el contraste adecuado.
CONCLUSIÓN
La inmunofluorescencia, como todos los inmunoensayos, aprovecha la capacidad que tienen los anticuerpos para unirse con alta especificidad a una determinada molécula blanco; pero se diferencia de otras técnicas inmunoquímicas en que aquí la marca unida al anticuerpo es una molécula fluorescente tal como, por ejemplo, el isotiocianato de fluoresceína.
La inmunofluorescencia puede ser utilizada en cortes de tejidos, líneas celulares cultivadas, células individuales y secreciones que contengan células en suspensión con la finalidad de analizar la presencia y distribución de proteínas, glúcidos y moléculas pequeñas tanto de origen biológico como no.
Las lectinas son capaces de reconocer y unirse a glúcidos terminales que forman parte de cadenas de oligosacáridos, bien libres o formando parte de otras moléculas como las glicoproteínas. Están ampliamente distribuidas en los tejidos animales y vegetales y sus funciones son muy variadas.
El objetivo de la histoquímica es poner de manifiesto una molécula o familia de moléculas presentes en una sección
histológica y estudiar su distribución tisular "in situ".
REFERENCIAS
- Coons AH, Creech HJ, Jones RN. Propiedades inmunológicas de un anticuerpo que contiene un grupo fluorescente. Proc Soc Exp Biol. 1941; 47 : 200 - 2.
- Coons AH, Kalpan MH. Antígenos de localización en células de tejido. Mejoras en un método para la detección de antígenos por medio de anticuerpos fluorescentes. J Exp Med. 1950; 91 : 1-13. [ Artículo libre de PMC ] [ PubMed ]
- Nakane PK, Pierce GB. Anticuerpos marcados con enzimas: Preparación y aplicación para la localización de antígenos. J Histochem Cytochem. 1966; 14 : 929-31. [ PubMed ]
- Mason DY, Sammons R. fosfatasa alcalina y peroxidasa para el marcaje inmunoenzimático doble de los constituyentes celulares. J Clin Pathol. 1978; 31 : 454 - 60. [ Artículo libre de PMC ] [ PubMed ]
- Faulk WP, Taylor GM. Un método inmunocoloide para el microscopio electrónico. Inmunoquímica. 1971; 8 : 1081 - 83. [ PubMed ]
- Tecnicas histológicas. Capitulo 5- Lectinas. https://mmegias.webs.uvigo.es/ 6-tecnicas/5-lectinas.php (Visitado el 18-08-2017)
- Weber, P. C. (1989). "Structural Origins of High-Affinity Biotin Binding to Streptavidin". Science. 243 (4887): 85–8. PMID 2911722. doi:10.1126/science.
- Cowen T et al. (1985) Histochemistry 82:205–208.
